Учреждение Российской академии наук Институт общей...
DESCRIPTION
Индуцированный мутагенез (количественные аспекты). А.В. Рубанович. Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. [email protected]. XIX век – Август Вейсман: - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Учреждение Российской академии наукИнститут общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН
Индуцированный мутагенез (количественные аспекты)
А.В. Рубанович
История
1925 – Г. А. Надсон (и его сотрудник Г. С. Филиппов) - Ленинградский Институт рентгенологии и радиологии: после воздействия рентгеновых лучей вырастали колонии дрожжей, отличавшиеся величиной, формой и окраской.
XIX век – Август Вейсман: безуспешные попытки изменить наследственность используя температуру, влажность и механические воздействия.
1927 - Герман Джозеф Меллер - V Международный генетический конгресс в Берлине: первые удачные опыты по искусственному вызыванию рецессивных мутаций с помощью рентгеновых лучей у дрозофилы.
1927 - Л. Стадлер: искусственные мутации у ячменя и кукурузы после воздействия рентгеновых лучей.
Нобелевская премия - 1946
Расстрелян - 1939
Биологическое действии радиации осознали значительно раньше!
1936 - Обелиск в Гамбурге: имена 115 исследователей, погибших в результате действия радиации
1901 - Первый описанный случай радиационного ожога кожи
1906 - Первый летальный исход (США)
1911 - Первый описанный случай радиационно- индуцированной лейкемии
1946 – Первое описание «клинического синдрома обусловленного атомной бомбардировкой»
Радиобиологический парадокс: ничтожная энергия вызывает драматический
биологический эффект!
1920 - Фридрих Дессауер – «теория точечной теплоты»: радиация отдает энергию порциями, вызывая нагревание отдельных точек до очень высокой температуры. Далее локальное свертывание белков, что к ведет биологическому поражению.
Полулетальная доза для человека = 4 Гр = 270 Дж = 67 кал
=
1 чайная ложка горячего кофе
=
2 секунды на пляжегибель в 50% случаев
По энергетическим затратам:
Теория мишеней и принцип попадания (1946-1947)
Ионизирующие излучения переносят энергию в дискретном виде
Акты взаимодействия (попадания) не зависят друг от друга и подчиняются пуассоновскому распределению
Исследуемый эффект наступает, если число попаданий в некоторую чувствительную область (мишень), равно определенному числу раз
Карл Циммером (Гемания)
Николай Владимирович Тимофеев-Ресовский (Россия)
Дуглас Ли (Великобритания) Откуда взялись эти положения?
В основном из характера дозовых зависимостей…
Зависимость «доза-эффект» в радиобиологии
Частота, %
Время гибели
100
50
Среднее время гибели
Выживаемость, %
Время воздействия, концентрация
100
50
Токсические воздействия:
Выживаемость, %
Доза облучения
100
50
Радиация:
S(D)=e-D
Экспонента - порога нет!
Порог
Кривая выживания – это функция распределения дозы (времени воздействия), вызывающей гибель
Частота, %
Доза, вызывающая
гибель
100
50
Средняя убивающая
доза
Плотности распределений
Забудем на время о дозах – будем говорить о распределениях продолжительности жизни
Выживаемость, %
Возраст
100
50
75
ЧеловекВыживаемость, %
Возраст
100
50
Некоторые насекомые
Экспоненциальная продолжительность жизни - это распределение «без памяти о прошлом»
Вероятность умереть в следующемгоду не зависит от возраста
Вероятность умереть в следующемгоду увеличивается с возрастом
4000
Распределение продолжительности жизни
для бессмертных! Единственная причина смерти – попадание под
колеса автомобиля. Средняя продолжительность
жизни 4000 лет
Вернемся к зависимостям «доза-эффект»
Выживаемость, %
Доза облучения
100
50
Экспоненциальная зависимость:вероятность наступления эффекта при
следующей порции облучения не зависит от предыдущей дозы
Ионизирующие излучения переносят энергию в дискретном виде
Акты взаимодействия (попадания) не зависят друг от друга и подчиняются пуассоновскому распределению
Исследуемый эффект наступает, если число попаданий в некоторую чувствительную область (мишень), равно определенному числу раз
Положения теории попаданий в мишени
Не только дозовые зависимости! Многое проясняет физика
взаимодействия излучений с веществом
-частиы
-лучи
X-лучи(рентгеновское излучение)
-частицы-Рентгеновское излучение
не связано с радиоактивностью
Виды ионизирующих излученийт.е. способных производить ионизации атомов (выбивать электроны с орбит )
Ядро атома
-
-
-
--
-
-
-
Вильгельм Конрад Рентген и рука его жены (1895)
Эрнест Резерфорд (1899)
Природа ионизирующих излучений
-частицы:
-частицы:
-лучи:
Pb +
-
Источник – радиоактиный изотоп, у которого ядра атомов
нестабильны за счет избытка нейтронов
Число протонов
Чи
сло
нейт
роно
в
Излучение, тип радиации Масса Заряд Защита
Ядра гелия 4 +2 Бумага, одежда
Электрон 1/1836 -1 Пластик, стекло
ЭМ-волны 0 0 Свинец, бетон
n Частица 1 0 Вода, парафин
Источник – радиоактиный изотоп, у которого ядра атомов
нестабильны за счет избытка (или дефицита) нейтронов
++
-
4Не
е-
2
Фотон
Частота, Гц
-лучи X-лучи УФ
Длина волны, м
Ионизирующая способность
Ионизации и линейная передача энергии (ЛПЭ)
Низкая ЛПЭ < 7 кэв/мкм(-лучи, X-лучи, -частицы)
Высокая ЛПЭ > 20 кэв/мкм (- частицы, протоны, нейтроны)
ЛПЭ = потери энергии ионизирующей частицы на единицу пути в веществе (E/s)
Ионизированный атом-
-
-
--
-
Ионизирующее излучение
Бумага Бетон
-частицы
-частицы
Прохождение излучений через вещество
Источники опасны только при
поступлении в организм
-лучи
Пробег в ткани 0.1 – 3 мкм
Единицы измерения доз Поглощенная доза – энергия, выделенная в 1 кг вещества: 1 Грей (Гр) =1 Дж/1 кг
Экспозиционная доза – мера ионизации (только для - и X-лучей) - заряд (одного знака), образующийся в 1 см3 воздуха
1 Рентген (Р) = 0,0088 Гр
Эффективная или эквивалентная доза – доза с учетом ОБЭ и радиочувствительности пораженного органа
1 зиверт (Зв) = 100 бэр
Только для личного пользования!1 Гр = 100 рад 100 Р 100 бэр 1 Зв
Единицы измерения радоактивности
Cкорость распада атамов: 1 беккерль (Бк) = 1 распад/сек 1 Кюри (Кю) = 3,71010 Бк
Дозиметры меряют не дозу, а мощность дозы, т.е. поглощенную дозу в единицу времени (Гр/c)
Рентген, грей, бэр, рад, зиверт, рем…?
0.1 1 10 100 1000
1
2
3
4
ЛПЭ, кэвмкм-1 ткани
ОБ
Э
Относительная биологическая эффективность излучения (ОБЭ)
- p+
Положения теории попаданий в мишени
Ионизирующие излучения переносят энергию в дискретном виде
Акты взаимодействия (попадания) не зависят друг от друга и подчиняются пуассоновскому распределению
Исследуемый эффект наступает, если число попаданий в некоторую чувствительную область (мишень), равно определенному числу раз
Что является «мишенью»?
Идентификация мишени: ядро, хромосомы, ДНК Микропучки -частиц с пробегом 40 мкм (210Ро):
избирательное облучение ядра Микроразрезы: перенос необлученного ядра в облученную цитоплазму
Уридин (РНК, цитоплазма) и тимин (ДНК, ядро), помеченные тритием 3Н
(-излучатель, пробег 1-2 мкм) Сенсибилизация клеток 5-бромдезоксиуридином
(BUdR подобен, но не идентичен тимину) Радиочувствительность содержание ДНК в клетках:
растения, насекомые, амфибии (объем интерфазных хромосом)
Ядро в 100 раз более чувствительно, чем цитоплазма
Облучение хромосом в 200-300 эффективней, чем облучение цитоплазмы
Прямое и непрямое действие радиации
Непрямое действие - радиолиз воды и возникновение свободных радикалов при прохождении излучения через цитоплазму:
- наиболее активен радикал OH (75% повреждений ДНК) - преобладает при низких ЛПЭ (- и X-лучи)
Прямое действие - непосредственная ионизация атомов ДНК - преобладает при высоких ЛПЭ (-частицы, нейтроны)
Свободный радикал OHэлектрически нейтрален, но имеет
неспаренный электрон на внешней орбите - высокая реакционная способность
(время жизни 10-10 с)
В любом случае речь идет о попадании в ДНК-мишень
2 мкм
Действие ионизирующих излучений
«Интерфазная гибель» - мгновенное прекращение метаболизма и разрушение клетки: большие дозы (> 20 Гр) «Репродуктивная гибель» - потеря способности к неограниченному делению: низкие дозы (< 10 Гр):
Однонитевые разрывы ДНК (низкое ЛПЭ) Двунитевые разрывы ДНК (высокое ЛПЭ) Повреждение оснований (особенно пиримидиновых).
На хромосомы:
На клетку:
Репарация Хромосомные аберрации, мутации генов в половых и соматических клетках (рак)
Дальнейшие события:
Попадания в мишени: распределение Пуассона
- среднее число попаданий при дозе D
Распределение «редких событий»:- число рыбок, пойманных за «время» D- число изюминок в кексе «объема» D- число голосов за Жириновского в квартале с D жителями
…………
Вероятность отсутствия поражений, т.е. выживаемость при
«одноударном» механизме гибели
объем мишени
Модель гибели «одна одноударная мишень»
Доза облучения
Выживаемость, %
100
50S(D)=e-D
Доза облучения
Выживаемость, %
1
0.1
0.01
Удобен «полулогарифмический» масштаб:
- доза, вызывающая 63% гибели:
1-2 Гр для клеток млекопитающих500 Гр - вирусы
По оси ординат ln S(D)=-D
D37
0.37
Первые правильные оценки размера генов в хромосомах.
Задолго до «двойной спирали»!
Модель гибели «несколько одноударных мишеней»
S(D)=1 – (1-e-D)m
0.01
Доза облучения
Выживаемость, %
1
0.1
Пусть для инактивации клетки небходимо попадание в m
мишеней, например при m=2 :
Вероятность попасть в одну мишень (хотя бы раз!)
m«Плечо»
Жива Жива Погибла
Оценка «числа мишеней»!
Численные оценки радиочувствительности
Выживаемость, %
D
100
50
- средняя доза, вызывающая
гибель
_D
=
Процедура нахождения площади более устойчива к разбросу точек, по сравнению с алгоритмами вычисления D50 или D37
Выживаемость, %
D
100
D50 D37
3750
D
Выживаемость, %
100
50
_D
D37 - в радиобиологии
D50 - в токсикологии
D - в теории вероятностей_
D = Площадь под кривой выживания в линейном масштабе
_
Одноударные и многоударные эффекты
………… и т.д. – распределение Пуассона
Одноударный эффект
Двухударный эффект
Доза облучения
Эффект (мутации, аберрации)
1 удар2 удара
Радиационно-специфические аберрации хромосом
Центрические кольца + фрагменты (2 разрыва в одной хромосоме)
Дицентрики + фрагменты (2 разрыва в разных хромосомах)
Одноударные и многоударные эффекты
2 4 60
0.4
0.8
1.2
1.6
Доза, Гр
Чис
ло д
ицен
трик
ов
на к
летк
у
2 разрыва за 1 удар
D
2 разрыва за 2 удара
D2
При увеличении ЛПЭ кривая становится
одноударной
Доза, Гр
Час
тота
ди
цент
рико
в
50
1.5
Xn
Выход дицентриков D+ D2
Биодозиметрия
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Доза, Гр
Час
тота
ди
цен
три
ков
и
цет
ри
чес
ки
х к
олец
на
кл
етк
у
Калибровочная регрессия зависимости частоты дицентриков и центрических колец на дозу -облучения (облучение лимфоцитов in vitro)
y = 0,001 + 0,015 D + 0,063 D2y = 0,001 + 0,015 D + 0,063 D2
Доза, полученная пациентом
Частота аберраций у
пациента
Минимальная доза, которую можно выявить при анализе лимфоцитов составляет 0.1 – 0.2 Гр
Обнаружение хромосомных аберраций в лимфоцитах крови – доказательство недавнего облучения организма
Возможны более точные оценки индивидуальной дозы по данным, полученным при облучении лимфоцитов in vitro
В.А. Шевченко, 2002
Репарация
Повреждения ДНК Частота на Гр Доля летальных
Изменение оснований 500/Гр 0.01
Однонитевые разрывы 1000/Гр 0.01
Сшивки ДНК-белок 150/Гр ?
Двунитевые разрывы 50/Гр 0.95
Влияние мощности дозы на частоту микроядер
0
1
2
3
4
5
Контроль 10 cГр(острое)
10 cГр/2 ч 10 cГр/24 ч 10 cГр /48 ч
Час
тота
мик
рояд
ер/1
00 к
лето
к
de Toledo et al. 2006
При уменьшении мощности дозы
Ацентрические фрагменты хромосом исключенные из клеточных ядер в момент
деления клеток
Репарация – зависимость выживаемости от мощности дозы
X-лучи: 0,01 Гр/мин
2 4 6 8 100
10-3
10-4
10-2
10-1
1
X-лучи: 1 Гр/мин
Доза, ГрНейтроны: 0.01 Гр/мин
Нейтроны: 1 Гр/мин
При увеличении мощности дозы и ЛПЭ излучения
Репарации обнаруживается по изменению наклона кривых «доза-эффект»:
при изменении мощности дозы
при фракционированном облучении
Репарация – зависимость выхода дицентриков от мощности дозы
D.C. Lloyd (1981)
X-лучи: 1Гр/мин
X-лучи: 0,003 Гр/мин
543210
0.5
1.0
1.5
2.0
Доза, Гр
Час
тота
диц
ентр
иков
на
клет
ку
При увеличении мощности дозы и ЛПЭ излучения
Нейтроны, энергия 0.714.7 Мэв
Выход Х-сцепленных рецессивных леталей у дрозофилы не зависит от мощности дозы
в диапазоне 0.03 - 100 Гр/час
Принцип «беспороговости» и «кумулятивности» мутационного процесса
Проект «MegaMouse» супругов L. B. Russell & W. L. Russell (1955-1965)
Пять главных выводов
Выход различных мутаций на 1 Гр различается в 30 раз.
Эффект мощности дозы существенен. Хроническое облучение вызывает меньше мутаций, чем острое (в отличии от Drosophila)
Самцы более радиочувствительны, чем самки.
Генетические эффекты существенно уменьшаются, если увеличивается время между облучением и спариванием.
Удваивающая доза для частоты мутаций равна 1 Gy.
Индукция морфологических мутаций в потомстве облученных родителей
7 морфологических мутаций7 миллионов мышей!
1 Гр
The frequency of radiation-induced mutations is not, as the classical view holds, independent of dose rate. W. L. Russell, L. B. Russell. Science, 19, 1958
Копию презентации можно скачать на сайте ИОГен: www.vigg.ru
Всем спасибо, и еще раз напомню:
Экспоненциальная зависимость выживаемости от дозы означает гибель от случайных и независимых актов поражения
Квадратичная зависимость от дозы указывает на двухударный механизм формирования эффекта
Для млекопитающих доза, удваивающая частоту мутаций в потомстве 1 Гр
1 Гр 100 рентген, хотя это разные вещи
Биологические эффекты ионизирующих излучений в основном связаны с воздействием на ядерное ДНК
Зависимость кривой «доза-эффект» от мощности дозы указывает на присутствие репарации