해조류를 이용한 치매예방 및

기억력개선 기능성 식품개발

2012. 12. 12한림대학교 강일준

치매 발병치매 발병

•치매 환자수

약 5,800 만명

세 계 국 내

가파른 고령사회 진입 속도

치매의 심각성

[2000 년 고령화 사회 ( 노인인구 : 7%)→2019 년 고령사회 ( 노인인구 : 14%)]

[ 치매 환자수 ] 5 년 만에 2.7 배 증가

[ 총 진료비 ] 3268억원으로 5 년만에 5.8 배 증가

[ 노인장기요양보험 ] 44% 치매환자

주원인 기타

알츠하이머병37-50%

알코올성치매파킨슨병

Huntington병infection

brain injury

치매 원인치매 원인

혈관성 치매20-38%

코그넥스 (tacrine) Exelon (rivastigmine) Aricept (donepezil)

The first approved

drug in the United

States (a potent

AChE inhibitor)

hepatotoxicity

vertigo, emesis

vertigo, emesis

천연물 유래 제품 개발 시급

간독성 구토 위장장애

부작용

치매 치료제의 문제점

고령화 의료비부담해양자원의

기능성

인지능력 개선 및 치매 예방 물질 개발

치매환자급증

사회적문제

알츠하이머병 치료 접근법

Acetylcholinesterase inhibitors: Increase acetylcholine contents β-Secretase inhibitors: Decrease β-amyloid protein accumulation

Antioxidants: Decrease ROS and free radical

혈관성 치매 치료 접근법

뇌허혈 / 뇌졸중 예방 뇌 신경세포보호 뇌 신경세포재생

연구동향

• 총 29 종의 해조류를 채집하여 이들로부터 3 가지의 용매추출물을 제조

• 항산화 , 뇌신경세포 재생 , AChE 억제효과 , β-secretase 억제효과 등의 효능평가 • 이상의 연구를 통해 감태 , 구멍쇠미역의 후보물질을 도출함

후보소재 도출

감태 (Ecklonia cava E6)

분류 : 갈조류

서식지 : 동해안

식용 여부 : 식용가능

특 징 : Seanol 을 함 유 , 의약품원료로 사용

구멍쇠미역 (Agarum clathratum, E13)

분류 : 갈조류

서식지 : 동해안

식용 여부 : 식용가능

β-secretase inhibition = sAPPα/sAPP(sAPPα+ sAPPβ)

Mechanism of Aβ secretion via β-secretase

Human APP(amyloid precursor protein) swedish mutants 를

발현하는 plasmid 를 함유한 HEK293T cell

정상인 AD 환자

Effects of butanol extract of E. cava on APP processing

The butanol extract did not show any toxicity in the HEK293-APPsw stable cells (A)The culture media (sAPPs) and cellular lysates (CTFs) were analyzed by the immunoblots. Soluble APPa and sAPPs (sAPPa and sAPPb) were detected by 6E10 and 22C11 monoclonal antibodies. CTFa was detected by the A8717 antibody. (B)The densitometry data were calculated for the ratios. BACE inhibitor IV (5 μM)

Butanol extract of E. cava prevents Aβ secretion via β-secretase inhibition.

Butanol extract of E. cava prevents Aβ secretion

- HEK293-APPsw stable cells were treated with various concentrations of butanol extract of E. cava for 8 h. - The concentrations of Aβ1–40 and Aβ1–42 in the culture media were assayed by ELISA methods after the treatment of the butanol extract.

Butanol extract of E. cava inhibits Aβ oligomerization

(a)The butanol extract was incubated with 10 μM Aβ1–42 solution for 18 h at 4oC to determine the effect on low-size (monomer to tetramer) Aβ oligomerization.

(b) The butanol extract was incubated with 10 μM Aβ1–42 for 18 h at room temperature to determine the effect on middle-size (40–120 kDa, particularly around 50 kDa) Aβ oligomerization.

(c and d) TEM images of middle size Aβ oligomer (untreated control, c) and of the co-treatment of 50 μM butanol extract with Aβ (d) are shown.

In Fig. 2c, large globular aggregates (white arrowhead) were shown, but not in Fig. 2d, only small aggregates were shown.

100 nm

Butanol extract of E. cava inhibits Aβ fibrillogenesis

(black bar = 200 nm)

(a) Congo red assay was performed after 7 days of incubation without and with the increasing amount of butanol extract co-incubated with 100 μM Aβ1–42 (measuring of β-sheet structure)

(b) Thioflavin T assay results Transmission electron microscopy images of the Aβ fibril preparation(untreated control, c) and of the Aβ fibril preparation treated with 50 μM butanol extract (d) are shown.

Butanol extract of E. cava inhibits Aβ-induced cell death(Primary rat cortical Neurons)

β-amyloid 를 10μM 로 처리(A) MTT assay (B) LDA release

Schematic illustration of the pathogenesis by beta-amyloid and its aggregates

Butanol extract of E. cava inhibits Aβ synthesis via BACE inhibition and reduces Aβ oligomerization and further fibrilization. Ultimately, the extract prevents Aβ-induced neuronal cell death.

TLC chromatogram of the subfractions obtained from E. cava butanol fraction (silica

open column)

E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7

BtOH fr.

E1

E2

E3

E4

E5

E6

Aβ1-42 inhibition of sub fractions of E. cava butanol fraction

TLC chromatogram of the subfractions of E. cava E5(sephadex open column)

BtOH fr.

E5-4

E5-5

E5

E5-6

E5-7

E5-8

E5-9

Aβ1-42 inhibition of sub fractions of E. cava E5

Position δc δH (multi, J Hz)

1 122.5 123.32

2 147.2 147.79 9.44 s OH

3 98.3 99.14 6.31 s

4 142.1 142.86 9.87 s OH

4a 122.7 123.47

5

5a 134.1 134.81

6 103.3 104.09

7 103.5 104.25

8 146.6 147.34 8.22 s

9 99.2 99.95 6.45 s

9a

10 150.5 151.21 9.85 s OH

10a

11 120.0 120.97

11a 149.6 150.34

12a 151.0 151.67

13 94.8 95.66 6.74

14 144.9 145.60 10.13 s OH

14a 126.4 127.19

15a 137.0 137.69

1' 160.2 161.08

2' 93.7 94.58 5.78 d, J=2.0

3' 158.8 159.69 9.18 s

4' 96.2 97.20 5.85 d, J=2.0

5' 158.8 159.69 9.18 s

6' 96.2 97.20 5.78 d, J=2.0

1'' 158.8 159.69

2'' 93.7 94.58 5.74 d, J=2.0

3'' 159.9 160.76 9.21

4'' 93.4 94.35 5.85 d, J=2.0

5'' 159.0 159.87 9.21

6'' 93.4 94.35 5.74 d, J=2.0

MALDI-TOF m/z 602

1H, 13C NMR and maldi-tof mass data of E5-9 compound in DMSO-d6Maldi-tof mass spectrum of E5-9 compound

13C NMR spectrum of E5-9 compound

1H NMR spectrum of E5-9 compound

1H, 13C NMR and maldi-tof mass spectrum

OH

O

O

HO

OH

O

O OH

OH

O

OHHO

HO

HO

4’’

1’’

119

711a

12a

13

65a

15a

4a 3

1

1’

4’

A

BC

DE

Phlorofucofuroeckol A

Chemical structure of E5-9 compound

Cryosection 30 ㎛

혈관성치매 연구를 위한 뇌세포연구

크레실 바이올렛 Fluoro-jade B 염색

저빌에서 뇌허혈 유발

Cresyl violet staining in the sham, vehicle, and E13-ischemia groups

.

at 4 days post-ischemia

Relative analysis as a percentage in the number of Cresyl Violet+ neurons

NeuN immunohistochemistry

NeuN immunohistochemistry in the sham, vehicle, and E13-ischemia groups at 4 days post-ischemia.

Relative analysis as a percentage in the number of NeuN+ neurons

Relative analysis as a percentage in the number of NeuN+ neurons in the sham, vehicle-, and E13-ischemia groups at 4 days post-ischemia.

Fluoro-Jade B histofluorescence

Fluoro-Jade B histofluorescence in the sham, vehicle, and E13-ischemia groups at 4 days post-ischemia.

정 상 군 : 세 포 질 이 작 고 돌 기 가 발달하지 않은 휴지형 미세아교세포 관찰

뇌허혈 유발군 : 세포질 및 돌기가 발달한 미세아교세포 뿐만 아니라 아메바형 미세아교세포 또한 다수 관찰 .

미 세 아 교 세 포 활 성 화 억 제 가 신경세포 보호와 밀접한 연관성이 있음

미세아교세포 활성화 억제

Iba-1 immunohistochemistry in the sham, vehicle, and E13-ischemia groups at 4 days post-ischemia.

후보 물질의 분리 , 정제 및 구조분석

Fig. 구멍쇠미역 EtOAc 분획물의 TLC

사진 .

CHCl3:EtOAc

EtOAc fraction 100:95 95:5 93:7 80:20 50:50 40:60 0:100

activity (%)

48.52 ±0.46

12.13±1.39

12.79 ±1.85

35.25 ±0.23

73.44 ±0.93

63.11 ±0.23

60.49 ±0.23

54.59 ±0.37

Table. 구멍쇠미역 EtOAc 분획물의 silica chromatography 분리 후 , 활성검사 (50 μ g/mL)

후보 물질의 분리 , 정제 및 구조분석

정제된 효능 물질의 분자량 및 구조는 Q-TOF-MS 및 NMR 을 이용 . 구멍쇠미역 주요 효능 물질의 분자량은 498.93 으로 측정되었으며 ,

C24H16O12 의 분자구조를 가짐

Fig. 구멍쇠미역 효능 물질의 QTOF-MS 를 이용한 분자량 분석 (m/z: 498.93)

13C NMR spectra (ppm) Ring A Ring C 1 136.

31 150.

72,6 143.

42 133.

73,5 115.

03 144.

44 148.

84 112.

2Ring B 5 147.

41 154.

56 108.

62,6 109.

3Ring D

3,5 144.2

1 158.4

4 134.2

2,6 107.4

3,5 151.5

4 110.3

1H NMR spectra (ppm)

Ring A 3,5 6.92 2,6 2.064 2.28Ring C

4 6.756 6.54 3 2.20 5 2.24

Ring B 2,6 6.683,5 2.06

Ring D 2,6 6.564 6.63

C-3, 5 2.24

Table 구멍쇠미역 효능성분의 1H 및 13C NMR spectrum (in CDCl3)

Fig. 구멍쇠미역 기능물질 /지표물질의 구조

Chemical structure of key compound

(Tetraphloroethol E)

단기 기억력 : Passive avoidance Test

group

Avo

idan

ce la

tenc

y (s

ec) aa

c

b

Effect of Phlorofucofuroeckol (E6) and tetraphloroethol E (E13) on the memory deficit mice induced by scopolamine in the passive avoidance

performance test (50 μg/kg)

group

Stop

-thro

ugh

late

ncy

(sec

)

c

a

bc b

공간학습능력 : Morris water maze

group

Fre

quen

cy

bb

c

a

Effect of Phlorofucofuroeckol (E6) and tetraphloroethol E (E13) on the memory deficit mice induced by scopolamine on the stop-through latency and

frequency (50 μg/kg 100sec)

• 물질 분리 및 정제

- 용매분획

-Column 분리

- 단일화합물• 기능 /지표 성분

설정

지표성분설정

• 식물 종

•확보량 • 사용부위

• 채취시기

• 원산지

원재료표준화

• 추출

- 용매 , 온도 , 시간 등

• 농축

- 온도 , 압력 , 시간 등

• 건조

- 건조 (VD, FD, SD 등 ) • 분말

제조공정표준화

• 안전성 ( 독성 ) 평가

• 시험관 및 동물시험

• 인체적용시험

기능성평가

표준화 필요성 표준화 필요성 일정한 효과 ( 활성 ) 를 함유한 원료 생산 유효성분 함량이 가능한 높은 원료 생산

원료의 수율 최적화 공정 확립 기준규격에 적합한 원료의 안정적 생산

과립화액상소재화

분말 /캡슐화

감태 /구멍쇠미역

구분 세부 사항 비고

대량전처리 조건확립

유효 물질의 효율적인

추출조건확립

액상소재화

원료 수세

원료 측량

냉풍 건조

건식 분쇄

원료 회수

고온고압추출

원심 분리

한외 여과

주정 추출액

수분 함량 15% 내외

Pin mill, 4,000rpm, 10 분 (250 micron 이하 )

주정 , 80oC, 15MPa, 1 시간

5oBrix

제조공정 표준화

구분 세부 사항 비고

수율

구멍쇠미역 /감태

주정 추출 수율

20% 로 표준화

주정추출액 규격 ( 지표성분함량 /100g)Tetraphloroethol E: 1.895 g

Phlorofucofuroeckol A: 1.325 g

분말소재화

공정

주정 추출액

말토덱스트린 첨가

균질화

분무건조

상온 냉각

주정추출물 분말

85 g

15 g

유입공기 온도 160℃, 배출공기 90℃,

아토마이저 속도 20,000 rpm, 시료유입 속도 30 mL/min

제조공정 표준화

구분 세부사항 비고

저장성 총균수 , pH, 산도 이상없음

안정성 층분리 현상 없음 안정함

기능성분(100 mL

당 )Tetraphloroethol E

Phlorofucofuroeckol A190mg ( 구멍쇠미

역 )133mg ( 감태 )

주정추출물

↓

감태 /구멍쇠미역 주정추출물

10% 첨가 (100 g/kg)

↓

부형제 : maltodextrin, 2%

↓

구연산 , 구연산나트륨 , 비타민 C, 니코틴산아미드 , 비타민 B2, 비타민 B6,

비타민 B12, 망고향 , 고과당시럽 첨가

↓

정제수 첨가 , 혼합 , pH 조정 (pH 4)

↓

살균 , 충전 , 포장

검사항목37oC 저장기간 ( 주 )

0 주 1 주 2 주 3 주 4 주 5 주

총균수(CFU/ ml) -1) - - - - -

색도차이 ＊ 2) ＊ ＊ ＊ ＊ ＊

pH 3.95 3.88 3.90 3.89 3.90 3.91

산도 (%) 0.209

0.217

0.275

0.220

0.225

0.215

관능적 특성 ＊ 2) ＊ ＊ ＊ ＊ ＊

1) not detected, 2) 변화 없음

액상 소재화 공정

구분 세부사항 비고

스펙 주정추출물분말 85%말토덱스트린 15%

안정성 흡습성 양호 안정함

기능성분(100 mg

당 )Tetraphloroethol E Phlorofucofuroeckol A

1.69mg( 구멍쇠미역 )1.13mg( 감태 )

분무건조 주정추출물분말

↓

입자 흐름성 조절

↓

캡슐레이션 ( 충진 )↓

이물 및 미립자 제거(air cleaning)

↓

캡슐 검사

↓

포장

분말 소재화 공정

감사합니다 .