콜레스테롤 관련 기능성 시험

최명숙

경북대학교 식품영양학과

1. 콜레스테롤 조절 / 394

(1) 체내 “ 콜레스테롤 조절” 과 “ 콜레스테롤 대사” 에 관한 이론 및 정의 394

2. 콜레스테롤 조절작용과 관련된 바이오마커 선정 결과 / 401

3. 콜레스테롤 조절 기능성 평가를 위한 동물시험과 인체시험의 일

반 시험법 구축결과 / 401

(1) 동물을 대상으로 한 콜레스테롤 조절관련 일반시험법 제시 ··················401

(2) 콜레스테롤 조절관련 기능성평가를 위한 인체시험법 제시 ····················405

(3) 검정결과를 통한 각 바이오마커의 표준 분석법 제시 ·····························409

4. 참고문헌(Reference) / 409

5. 부 록 / 411

(1) 유효량 결정을 위한 animal-to-human extrapolation ···························411

(2) 피험자 수 산출근거 (예시) ·······································································411

(3) 각 바이오 마커의 표준 분석법 제시(필요한 바이오마커만 선택) ·········414

1. 콜레스테롤 조절

(1) 체내 “ 콜레스테롤 조절” 과 “ 콜레스테롤 대사” 에 관한 이론

및 정의

콜레스테롤 조절이란 체내 콜레스테롤 수준을 적절한 범위로 조절하여 혈장과

조직 (특히 혈관)에 콜레스테롤 축적이 일어나지 않게 함을 말한다. 체내 콜

레스테롤이 축적될 경우 고콜레스테롤혈증이 나타나며, 장기간에 걸쳐 콜레스

테롤이 조절되지 않을 경우 동맥경화증으로 이어진다.

가. 혈장 총콜레스테롤 수치의 의미

콜레스테롤 대사조절에 이상이 생길 경우 일반적으로 혈중 총 콜레스테롤의

상승현상이 나타난다. 한국인을 위한 “ 바람직한 총 콜레스테롤 수치” 는 200

mg/dl미만이며, 200-239 mg/dl은 “ 경계수준” , 그리고 240 mg/dl이상은 “ 고

콜레스테롤혈증” 이라고 정의한다 (Table 1). 참고로 표 2에서는 미국

NCEP(National Cholesterol Education Program)가 설정한 혈장 콜레스테롤 수

준과 coronary heart disease의 위험율을 제시하였다. LDL콜레스테롤은 100

mg/dl 미만이면 “ 적절한 수준” 이며 100-129 mg/dl이면 “ 적정수준에 근접하

였거나 조금 상위하는 수준” , 130-159 mg/dl이면 “ 경계위험수준” , 160-189

mg/dl이면 “ 고위험수준” , 그리고 190 mg/dl이상이면 “ 매우 고위험수준” 으

로 규정한다. 이와같이 LDL콜레스테롤의 5 단계로 세분화되고 있음을 알 수

있다. LDL 콜레스테롤을 중요시하는 이유는 혈장 총 콜레스테롤치가 240

mg/dl를 넘지 않아 고콜레스테롤혈증으로 진단되지 않아도 LDL콜레스테롤이

160 mg/dl이상이면 주의가 필요하기 때문이다. 한편 HDL 콜레스테롤이 40

mg/dl이하이면 문제가 된다. 이는 HDL 콜레스테롤이 낮으면 콜레스테롤 역수

송 효율이 낮아져 동맥경화의 원인이 되기 때문이다. HDL 콜레스테롤이 저하

되는 원인은 영양 균형이 나쁜 식사, 운동부족, 비만, 흡연, 스트레스의 축적

등이다. 그러므로 장기간에 걸친 고농도의 총 콜레스테롤, 고농도의 LDL 콜레

스테롤 및 저농도의 HDL 콜레스테롤은 동맥경화증을 유도하게 되며 이를 예방

하기 위해서는 약물, 식습관 교정 및 건강기능식품등의 보충에 의한 콜레스테

롤 조절이 이루어져야 한다.

Table 1. 혈장 총 콜레스테롤 수준의 일반적 의미 (Meaning of plasma

cholesterol concentration)

총 cholesterol

(mg/dl)분 류 대 응 책

200미만정 상

(desirable)5년 후 혈청 수준 검사할 것

200 - 239경계역

(borderline-high)

식사요법 시행, 1년 후에 혈청 수준 검

사할 것

240 이상고위험군

(high)

식사요법 반드시 시행하며 정밀 혈청

지질 검사에 따라 약물요법도 병행

(한국동맥경화.지질학회 설정기준)

Table 2. 총 콜레스테롤과 LDL 및 HDL 콜레스테롤에 관한 ATPⅢ 분류

(Definition of levels of plasma total cholestrol, LDL- and

HDL-cholesterol)

Plasma cholesterol mg/dl Definition

Total cholesterol <200

200 - 239

≥ 240

Desirable

Borderline high

High

LDL cholesterol < 100

100 - 129

130 - 159

160 - 189

≥ 190

Optimal

Nearoptimal/above optimal

Borderline high

High

Very high

HDL cholesterol < 40

≥ 60

Low

High

(미국 NCEP 2001년 기준)

나. 콜레스테롤 대사경로와 관련된 조절의 의미

정상인의 1일 콜레스테롤의 섭취량이 약 400-500 mg 일 경우 일반적으로 식이

콜레스테롤의 약 60-80%가 흡수된다. 이 수치는 연구자들에 따라 조금씩 다르

게 보고 되었는데. 식이 콜레스테롤을 40-2,000 mg 섭취하는 경우 평균 30 -

40%가 흡수된다고 보고 된 바도 있다 (Samuel, 1983). 한편 제한된 콜레스테

롤의 흡수율에 따라 흡수되지 않은 식이 콜레스테롤은 콜레스테롤형태 내지

대장과 직장의 박테리아 효소반응에 의한 대사산물로 배설된다. 식이 지방의

소화흡수 과정에 필수적인 담즙은 하루 그 분비량이 800-1200 mg이며, 담즙을

구성하는 주요성분은 담즙산이 92%, 담즙산염이 6%, 유리 콜레스테롤이 0.3%

이며 그 외 소량의 인지질, 유리지방산 및 빌리루빈을 포함한다.

식이에 의해 섭취되거나 또는 생합성된 지질이 체내 각 조직에서 이용 및 저장

되기 위해 지단백질 (lipoprotein)이라는 특수한 형태의 구조를 이루어 혈장을

통해 운반된다. 그 이유는 소수성 지질성분들은 수용성 영양소들과 달리 혈장에

용해되어 이동할 수 없기 때문이다. 지단백질 입자는 중심부에 소수성 지질

(triglyceride, cholesteryl ester), 표면에 친수성 지질 (phospholipid, free

cholesterol) 및 아포지단백 (apolipoprotein)으로 구성된 고분자량의 수용성

복합체이다. 혈장 콜레스테롤의 2/3는 cholesteryl ester형태이며, 혈장 HDL의

lecithin:cholesterol acyltransferase (LCAT) 및 간과 소장의

acyl-CoA:cholesteryl acyltransferase (ACAT)에 의해 합성된다. 체내의 주요

콜레스테롤 대사산물은 간에서 합성되는 담즙산과 스테로이드 호르몬 등이며,

콜레스테롤 생합성량은 식이 콜레스테롤의 흡수정도 및 담즙산 재흡수 정도에

따라 조절되어 항상성이 유지된다 (Grundy, 1969). 각 지단백질의 특성은 구성

된 지질 및 고유의 아포지단백에 따라 달라지는데, 아포지단백은 각 지단백질의

대사를 조절하고 조직의 각 지단백 수용체의 지단백 인식부위로 작용하게 된다.

지단백질은 지질-아포지단백질 복합체를 형성하여 중성지방과 콜레스테롤을 간

에서 말단조직으로 운반 또는 말단조직에서 간으로 역수송함으로써 지질 재분배

를 가능하게 한다 (Fig. 1). 콜레스테롤은 LDL의 70% 이상, HDL의 약 30%, VLDL

의 약 24% 및 chylomicron의 약 6%를 차지한다 (Table 3).

HDL

CECE

FCFC

CE

LDL

VLDL

IDL

Dietary Cholesterol

FC

Fecal Sterol (cholesterol & Bile acid)

CEFC

CM

CM-R

CETP

synthesisBile

PlasmaLiver

Peripheral Tissue

Small Intestine

LDLr

LDLr

CE

CE

CE

CETPReverse Cholesterol Transport

HDL

CECE

FCFC

CE

LDL

VLDL

IDL

Dietary Cholesterol

FC

Fecal Sterol (cholesterol & Bile acid)

CEFC

CM

CM-R

CETP

synthesisBile

PlasmaLiver

Peripheral Tissue

Small Intestine

LDLr

LDLr

CE

CE

CE

CETPReverse Cholesterol Transport

Fig. 1. 간, 혈장 및 말초조직 간의 콜레스테롤 대사 (Simplified scheme of

cholesterol metabolism between liver and peripheral tissues) FC: free

cholesterol; CE: cholesteryl ester; CETP: cholesteryl ester transfer

protein; LDLr: LDL-receptor; CM: chylomicron; CM-R: chylomicron remnant.

Chylomicron과 VLDL (very low density lipoprotein)은 각각 외인성과 내인성

중성지방을 말초조직으로 운반하는 역할을 한다. 그리고 혈장 VLDL로부터 전환

된 LDL은 혈장 주요 콜레스테롤 운반체로서, LDL receptor를 통해 혈장 콜레스

테롤의 많은 부분은 말초조직으로 공급하고 나머지는 간조직 LDL receptor를 통

해 제거된다 (Fig. 1). 세포내 콜레스테롤 농도가 높아지면 기존의 HMG-CoA

reductase활성이 저해될 뿐만 아니라, 이 효소의 합성속도도 저하된다. 또한

ACAT은 세포내 고농도의 콜레스테롤에 의해 활성화되고 (Fig. 2), 콜레스테롤은

에스테르화되어 저장된다. 이 경우 LDL recepor합성도 억제되어 혈장으로 부터

의 LDL 유입도 억제되므로 콜레스테롤 항상성은 조직내 콜레스테롤 축적을 감소

시키는 방향으로 진행된다. 또한 간조직에서는 7α -hydroxylase에 의해 콜레스

테롤이 담즙산 (bile acid)으로 전환되며 그중 일부는 재순환되지 않고 분변을

통해 배설된다. LDL은 지단백질 중 산화감수성 (oxidative susceptibility)이

가장 크고, 산화된 LDL (oxidized LDL, oxLDL)은 세포에 독성을 주어 동맥경화

를 전개 및 진행시키는 원인이 된다 (Steinberg, 1989). 또한 콜레스테롤 대사

에서 그 합성정도가 조절되지 않거나 혈중 콜레스테롤 농도가 지나치게 높으면

혈관벽에 콜레스테롤이 침착되어 “ 아테롬성 동맥경화 반(atherosclerotic

plaque)” 이 생긴다. 한편 HDL입자는 말초조직에서 간으로의 콜레스테롤 역수

송, 즉 “ reverse cholesterol transport (RCT)"라는 중요한 역할을 담당한다.

혈장 HDL표면의 친수성층에 위치한 유리 콜레스테롤은 LCAT작용을 받아 계속 에

스테르화된 후 HDL입자 내부의 소수성층으로 이동된다. 이러한 HDL내의 콜레스

테롤 농도구배는 말초조직에서 합성된 콜레스테롤 및 혈관의 잉여 콜레스테롤을

혈장 HDL로 이동시키는 효과를 유도하게 된다. 따라서 혈장 HDL 콜레스테롤 수

준이 높을수록 동맥경화 위험성은 감소된다 (Oram, 1986). 한편 HDL내의

cholesteryl ester(CE)는 밀도가 낮은 VLDL, LDL 또는 IDL등으로 이동될 수 있

는데, 이 반응은 cholesteryl ester transfer protein (CETP)에 의해 매개되며

HDL로 이동된 CE는 다시 조직으로 이동되어 재분배된다. 이러한 CETP의 콜레스

테롤 재분배 기작은 콜레스테롤 섭취가 충분하지 못할 경우 어렵게 생합성된 콜

레스테롤을 재사용하기 위한 장치로 사료되나, 과잉의 콜레스테롤을 섭취하는

현대인들에게는 콜레스테롤 역수송효율을 감소시켜 오히려 혈액내 잉여 콜레스

테롤을 체외로 배출하는데 있어서 장애인자로 등장하게 되었다.

Table 3. 사람의 혈장지단백 분류와 그 특징 (Characteristics of Human Plasma

Lipoproteins)

Lipoprotein Density

(g/ml)

Composition (wt %)

Protein Phospholipids

Free Cholesterol

Cholesterol Ester

Triglyceride

Chylomicron >1.006 2 1 1 3 85

VLDL 0.95-1.006 10 7 7 13 50

LDL 1.006-1.063 23 (Apo B) 8 9 38 10

HDL 1.063-1.210 55 (Apo A-I) 2 2 15 4

Sources: Modified from Kritchevsky. D. (1986) Atherosclerosis and

Nutrition. Nutr. Int. 2, 290-297, ( ): Major apolipoproteins

Fig. 2. LDL 수용체를 통한 혈장 LDL의 조직 유입 및 분해과정과 이를 통해

일어나는 조직내의 콜레스테롤 조절작용 (Diagrammatic

representation of uptake and partial degradation of LDL via

the LDL-receptor pathway) The resultant increase in free

cholesterol down-regulates HMGR and LDLr synthesis and

results in an increased rate of cholesterol esterification

via ACAT (Brown et al. 1979).

다. 콜레스테롤 조절작용중 HDL 콜레스테롤의 동맥경화 위험 감소 효과에 대한 의미

HDL 콜레스테롤이 고콜레스테롤혈증 뿐 만아니라 동맥경화위험감소에 주요한

역할을 하는 이유는 구체적으로 다음과 같다.

HDL 의 콜레스테롤 역수송효과 (Role of HDL in reverse cholestrol transport)

- HDL 입자는 동맥혈관 벽으로부터 잉여의 콜레스테롤을 제거하며 혈관의 플

라그 형성을 억제한다.

- HDL은 혈관에 기 형성된 플라그도 안정화 시키며 플라그 rupture를 억제한다.

HDL 입자의 항산화 효과

- HDL 입자 자체에는 paraoxonase와 PAFAH (platelet activating factor

acetylhydrolase)가 결합되어 있다. 항산화효소인 paraoxonase는 혈장과 동

맥벽 내부의 LDL이 산화 LDL로 변화되는 것을 억제한다. 또한 PAFAH는 혈장

과 동맥벽에 존재하는 산화 지단백입자를 분해 시켜 산화된 지단백입자를

제거하는 역할을 하는 것으로 보고 되었다.

- HDL 입자는 혈관내 동맥경화를 유도하는 adhesion molecule(vascular cell

adhesion molecule-1, monocyte chemotactic protein-1등) 들이 발현되는

것을 감소시킴으로서 혈관의 기능을 원활하게 유지시킨다.

라. 콜레스테롤 대사상에서 흡수대사배설 등을 통한 콜레스테롤 조절단계

체내의 모든 대사반응은 항상성에 의해 조절된다. 콜레스테롤 대사는 다음과

같은 방법을 통해 그 조절이 유도 가능하며, 콜레스테롤 조절단계는 그 유형

에 따라 Table 4 와 같이 분류될 수 있다.

체내 콜레스테롤대사 조절의 의미

- 콜레스테롤 흡수조절;

① 장내 콜레스테롤 가수분해효소 (pCEH) 및 에스테르화효소 (ACAT) 저해로

식이 콜레스테롤 흡수를 감소시킴

② 장내 콜레스테롤 흡수경쟁이 일어나게 함으로서 식이 콜레스테롤의 흡수량

을 감소시킴

- 스테롤 (중성스테롤과 산성스테롤) 배설조절:

① 장내 콜레스테롤에 대한 흡수 차단 (예: 마이셀 형성시의 콜레스테롤 용해

도 저해)

② 담즙산 재흡수를 차단시켜 재순환되는 양을 감소시킴 (콜레스테롤은 담즙

산의 전구체임)

Table 4. 콜레스테롤 조절 유형과 알려진 작용물질들 (Types of

cholesterol regulation)

체내 스테롤

조절 단계조절작용의 유형

관련 기능성

물질/식품관련 약물

장내

콜레스테롤

흡수조절

소장 콜레스테롤

가수분해 및 에스테르화

효소 활성도 저해

빈랑자 추출물

마황추출물Ezetimibe

담즙산 마이셀 용해도

저해등에 의한 brush

border에서 콜레스테롤

흡수 억제

Plant sterol, Plant

stanol, Plant sterol

ester 등을 이용한

식용유, 마가린 등콜레스테롤과

담즙산 배설

조절

장내 흡수

차단제(sequestrant)로

작용하여 스테롤 배설

촉진

식이섬유

담즙산 결합용

수지(Cholestyramin

,Cholestipol)

콜레스테롤

역수송 조절 CETP 활성도 저해 생강 추출물, 마늘

추출물_

콜레스테롤

생합성 조절HMG-CoA reductase 저해

Red yeast rice

(Mevinolin),

Phenolic 및

flavonoid 화합물의

일부

Statin 계열 화합물

혈중 VLDL

합성/분해조절

간의 VLDL 합성 관련

효소 저해, Lipoprotein

lipase 활성화

오메가-3 지방산

Nicotinic acid

Fibric acid 계열

화합물

조절단계가

미확인된 기타

조절

기타 알려지지 않은 작용항산화영양소 (vit

E), Phytoestrogen

Probucol

Estrogen

- 분포조절:

① HDL에 의한 콜레스테롤 역수송을 증가시켜 혈장 콜레스테롤 제거율 증가시킴

② 간의 콜레스테롤 생합성량을 감소시킴 (HMG-CoA reductase 저해)

- VLDL 분해/합성조절:

① 간의 VLDL 합성을 감소시킴

② 혈장 VLDL 분해를 증가시킴 (lipoprotein lipase 조절)

- 기타: 미확인된 콜레스테롤 조절기작

2. 콜레스테롤 조절작용과 관련된 바이오마커 선정 결과

콜레스테롤 조절작용과 관련된 in vivo 바이오마커들을 그 조절 작용 유형에

따라 적절하게 선정하였으며 결과는 편의상 다음에 제시되는 동물과 인체시험

의 일반시험법 부분에서 제시하였다. 단, 콜레스테롤 조절관련 in vitro 바이

오마커는 제시는 불가능한 것으로 사료되었다. 그 이유는 다양한 기능성 화합

물들이 세포배양과 같은 in vitro 시스템에서 해당 IC50가 낮았으나, in vivo

시스템에서는 콜레스테롤 조절기능이 나타나지 않는 등 in vitro 와 in

vitro 효능간에 일관성이 없기 때문이다. 그러므로 in vitro 에서 구해진 콜

레스테롤 조절관련 효소들의 IC50 수치는 학문적 의미는 있지만 콜레스테롤 조

절에 대한 in vivo 효과를 간접적으로 나타낸다고 볼 수는 없다.

3. 콜레스테롤 조절 기능성 평가를 위한 동물시험과 인

체시험의 일반 시험법 구축결과

여기에서 제시되는 일반시험법은 문헌조사의 시험법 빈도조사 결과와 본 연구

자의 실험실에서 지금까지 구축한 연구방법을 바탕으로 하여 완성하였다.

(1) 동물을 대상으로 한 콜레스테롤 조절관련 일반시험법 제시

가. 기능성테스트 물질 형태 선정: 원료성분, 최종배합물 및 최종제품

나. 시험동물 대상: 흰쥐, 마우스, 토끼, 햄스터, 기니피그 등

다. 투여기간: 콜레스테롤 조절시험 유형에 따라 다양하게 함 (Table 5 참조)

Table 5. 콜레스테롤 조절형태에 따른 실험동물 대상, 시험물질 투여기간 제

시 및 양성대조 물질 제시 (Animal species, feeding period of

test materials and positive materials according to types of the

cholesterol regulation)

체내 스테롤

조절 단계시험대상 동물*

시험물질 적정

투여기간양성대조물질

장내 콜레스테롤

흡수조절

흰쥐 2주콜레스테롤 흡수효소 저해

제 (Ezetimibe)

흰쥐 2주콜레스테롤 흡수경쟁물질

(예: Plant sterol)

콜레스테롤과

담즙산 배설 조절 흰쥐 2-4주

담즙산 차단제

(Cholestyramine,

Cholestiploe)콜레스테롤 역수송

조절

마우스, 토끼,

햄스터 4주 이상 -

콜레스테롤 생합성

조절

마우스 ,

햄스터, 토끼4주 이상

HMG-CoA reductase 저해제1

(Statin계열 화합물)혈중 VLDL

합성/분해조절마우스, 토끼 4주 이상 Fibrate계열 화합물

동맥경화유도 조절 토끼 20주 이상 Statin/Fibrate

조절단계를 모르고

시작하는 경우

흰쥐2, 마우스,

토끼, 햄스터4주이상 Fibrate

* 기니피그의 콜레스테롤 대사는 사람과 유사하나 국내 구입이 용이하지 않으므로

제외하였음.

1흰쥐는 statin에 의해 HMG-CoA reductase 저해가 잘 일어나지 않음. 2흰쥐로 시험 시작하는 것이 용이함

라. 실험군 시험식이 선정, 시험물질 투여 방법과 투여량

① 실험군: 정상대조군, 콜레스테롤 대조군, 양성대조군, 기능성물질 투여군

으로 함.

② 시험물질 투여방법: 시험물질은 식이에 혼합하여 공급함을 원칙으로 함.

③ 시험물질의 식이 첨가수준: 단일물질은 0.02% - 0.5%, 추출물은 0.5 - 4%,

그리고 식품 원재료는 2.0 - 5.0 % 정도로 함.

④ 식이 콜레스테롤의 첨가수준은 시험동물에 따라 다양하게 할 수 있음.

(Table 6은 예로 제시함)

Table 6. 실험동물의 실험식이 조성안 (Composition of experimental diets

for different animals)

식이군

사료(diets)

기본

표준식이

(AIN-76/

AIN-93)*

식이 콜레스테롤

첨가

여부

동물별 첨가수준 (%)

흰쥐 마우스 토끼 햄스터

정상대조군 o X

시험대조군 o o

1.0-2.0 0.2-1.0 0.2-2.0 0.2-1.0양성대조군 o o

시험물질 투여군 o o

*기본사료는 옥수수유를 포함하는 AIN-76 식이가 적절하며, 식이 콜레스테롤

첨가수준은 조절유형에 따라 시험자가 선택 가능함.

마. 각 실험군의 크기(n)는 다음과 같이 함을 원칙으로 한다.

흰 쥐: n= 10 내외

마우스: n = 10 내외

토 끼: n= 5 이상

햄스터: n = 10 내외

바. 사육시설환경: 온습도, 환기상태, 소음, 조명등은 실험동물 관리기준

(GLPs) 따름.

사. 생체시료의 분석항목(바이오마커)/분석 방법

분석항목은 콜레스테롤 조절유형에 따라 선택가능하며, 분석방법은 표시기능

에 적합해야 하며 전문 학술지에서 인정하는 방법에 준함. 바이오마커 항목은

시험자의 편의를 위해 Table 7와 같이 제시함.

Table 7. 콜레스테롤 조절유형에 따른 in vivo 바이오마커 제시안

(Suggestion of in vivo biomarkers according to the types of cholesterol

regulation)

콜레스테롤

대사부위/조절

명칭

바이오마커의

의미주요 바이오마커들 보조 바이노마커들

장내

콜레스테롤

흡수 조절

장내 콜레스

테롤 흡수

관련 효소

저해지표

콜레스테롤 섭취량

pCEH 활성도(소장액)

ACAT활성도(소장조직)

콜레스테롤 수준(분변, 혈장)

동위원소 표지자 콜

레스테롤의 수준(소장

과 대장 내용물, 분

변, 혈장)

흡수 경쟁에

의한 콜레스

테롤 흡수

감소 지표

콜레스테롤 섭취량

콜레스테롤 수준 (소장 점

막조직, 혈장, 분변)

동위원소 표지자 콜

레스테롤의 활성도 (혈

장, 분변, 소장 대장내

용물)

콜레스테롤과

담즙산 배설

조절

스테롤의 체

외 배설 지

표

분변 중성스테롤 배설량

분변 산성스테롤 배설량

Total cholesterol (혈장)

간조직의 7-α

hydroxylase 활성도

콜레스테롤 (간)

HDL-cholesterol

LDL-cholesterol

혈장

콜레스테롤

대사 조절

고콜레스테

롤혈증 및

동맥경화유

도 위험성

예측 지표

Total cholesterol (혈장)

LDL-cholesterol

HDL-cholesterol

Apo A-I Apo B

산화 LDL 수준

Atherogenic index

Paraoxonase 활성도

HDL-C/Total-C 비율

TBARS 농도(혈장, 간)

항산화효소 활성도

(적혈구, 간)

조직

콜레스테롤

축적 조절

(간, 동맥)

조직 콜레스

테롤 대사

지표

Cholesterol(간,동맥, 혈장)

HMG-CoAreductase활성도

(간)

ACAT 활성도 (간, 동맥)

조직 fat droplet 비

율(간, 동맥)

LDL-C

콜레스테롤

역수송 조절

혈장 콜레스

테롤 제거

지표

혈장 CETP 활성도

혈장 LCAT 활성도

Total cholesterol (혈장)

HDL-cholesterol

LDL-cholesterol

콜레스테롤 수준 (간)

HMG-CoA reductase

활성도

ACAT 활성도 (간)

HDL-C/Total-C 비율

콜레스테롤

생합성 조절

간의

콜레스테롤

생합성 지표

Cholesterol(간,혈장)

HMG-CoAreductase활성도

(간)

ACAT 활성도 (간, 동맥)

HDL cholesterol

LDL cholesterol

분변 중성스테롤

분변 산성스테롤

아. 실험결과 유의성 해석

각 식이군의 모든 자료를 유의적 수준 0.05 이하에서 통계적으로 검정하며,

시험물질의 유효성을 입증하고 가능한 범위 내에서 주요 바이오마커들 간의

연계성이 설명되어야 함.

(2) 콜레스테롤 조절관련 기능성평가를 위한 인체시험법 제시

가. 피험자의 선정기준, 제외기준, 목표한 피험자수 및 그 근거

① 선정기준

- 40세 이상 60세 이하의 성인 남녀

- 정상군: 혈장 콜레스테롤 농도가 180 - 200 mg/dL 에 속하는 정상인

- 시험군: 혈장 콜레스테롤 농도가 201 - 240 mg/dL 에 속하는 반건강인

- 본인 또는 대리인이 연구참여에 서면동의 한 환자

② 제외기준

- 임산부, 수유부, 노약자, 그리고 적당한 피임을 하지 않는 가임여성

- 당뇨병, 간질환, 고혈압, 간질, 알코올 중독, 신경질환, 약물남용, 정신

병, 췌장염, 암 등 전문가가 연구에 제외시켜야 한다고 인정하는 환자

- 동반질환이 있어 생물학적 조절제, 면역 조절제, 세포 독성제, 전신성 부

신 피질 호르몬제를 투여받고 있는 환자

- 혈청 크레아티닌이 정상 상한치의 1.5 배를 초과하는 신기능 부전환자

- 체중지수 (BMI = 체중 kg/신장 m2)가 30 이상인자

- 연구자의 판단에 의해 연구대상자로 부적합한 환자

③ 피험자수 및 그 근거

최종 유효성 평가를 위해 필요한 최소 피험자 수 산출근거를 제시한다. 피

험자수 산출 및 그 근거에 대한 예시는 부록에 나타내었다. 단, 제시된 방

법은 본 연구자가 사용한 예시이며 피험자수를 산출하는 통계학적 근거만

제시하면 타 산출방법도 이용될 수 있다.

나. 관찰항목, 시험검사 항목 및 관찰검사법

① Baseline 관찰항목의 정의

- 실험실 검사

혈액학적 검사: WBC, RBC, Hemoglobin, Hematocrit

혈액생화학적 검사: Total protein, BUN, Albumin, Total bilirubin,

Creatinine, AST, ALT, Alkaline posphatase, -GPT,

Glucose, Total cholesterol, HDL-cholesterol,

LDL-cholesterol, Triglyceride, LDH etc.

② 시기별 방문계획, 시험물질 제공 및 순응도 조사

Visit 1

㉮ 서면동의: 시험 시작전 피험자에게 충분한 설명을 한 후 서면동의서를 작

성한다.

㉯ 기초조사: 피험자의 생년월일, 성별, 주소, 전화번호, 신장, 체중, 흡연

여부, 알코올 섭취 여부, 치료력을 물어서 기록한다.

㉰ 피험자번호 부여

㉱ 병력 및 약물복용력: 치료기를 기준으로 지난 1년간 혹은 현재 가지고 있

는 질환, 복용하는 약물에 대하여 문진하여 그 내

용을 증례기록지에 기록한다.

㉲ 활력징후 (vital sign): 체온, 혈압, 맥박을 측정하여 기록한다.

㉳ 신체진찰: 각 기관에 대한 이상여부를 검사하고 이상이 있을 경우 그 내

용을 증례기록지에 기록한다.

㉵ 임신여부 검사: 불임수술을 받지 않았고 효과적인 피임법을 실시하고 있

지 않은 가임기 여성에 한하여 실시한다.

㉶ 혈장 콜레스테롤 확인 검사: 콜레스테롤 농도 재측정

㉷ 실험실 검사: 혈액학적 검사, 혈액생화학적 검사, 뇨검사를 실시한다.

㉸ 피험자번호 부여

㉹ 선정/제외기준 판정: 선정기준을 모두 만족하고 제외기준에 한가지도 해

당되지 않을 경우 본 시험의 피험자로 선정될 수

있다.

㉺ 시험식품/ 대조식품 지급

Visit 2

㉮ 활력징후

㉯ 혈청(장)보관

㉰ 실험실 검사: 혈장 콜레스테롤 확인을 위한 혈액수집

㉱ 병용약제 조사: 시험시작이후 복용한 약물에 대해 문진하여 그 내용을 증

례기록지에 기록한다.

㉲ 이상반응 조사

㉳ 순응도(compliance) 평가: 피험자들에게 빈 식품 용기나 섭취하지 않은

식품을 가져오도록 요청해야 한다. 연구자는

반납된 시험식품을 조사하여 섭취 상태를 기

록하고 순응도를 평가한다.

순응도 = 실제 복용 횟수/총 복용해야하는 횟수 x 100

㉴ 시험식품/ 대조식품 지급

㉵ 일정에 없는 방문 및 입원

Visit 3:

visit 2와 동일함. 최종 채혈 실시

다. 효과 평가 기준, 평가방법 및 해석방법 (통계분석방법)

① 유효성 평가대상

선정/제외 기준에 적합하여 본 인체시험의 피험자로 무작위 배정된 대상자들

중 금지된 약물의 복용이 없었고, 계획서의 중대한 위반 없이 섭취해야 할

시험식품의 적어도 75% 이상을 섭취하였고 마지막 방문까지 관찰이 이루어진

피험자는 평가대상에 속한다.

② 유효성 평가기준

유효성 평가시에는 피험자수의 산출근거도 참고로 하여 시험식품 투여군의

혈장 콜레스테롤 농도 감소 비율이 대조군과 비교시 유의적으로 감소된 경우

(p<0.05)를 기준으로 함이 원칙이다. 단, 시험자가 피험자수를 산출근거에

의해 정하지 않고 인체시험을 실시한 경우에는 각 바이오마커들의 유의성 분

석결과를 적용하여 그 유효성을 평가 할 수도 있다.

③ 바이오마커 분석

콜레스테롤조절 관련 기능성 평가를 위한 인체시험의 바이오마커들은 Table

8에 제시하였다. 시험자가 필수적으로 분석해야할 사항들은 주요 바이오마커

로 하였고 주요 바이오마커 분석결과를 지지하는 지표들은 보조 바이오마커

로 분류하였다.

Table 8. 최종 채혈한 혈액으로부터 분석할 바이오마커들 (Suggestion of

in vivo biomarkers of cholesterol regulation to be measured

in human blood)

체내 콜레스테롤

조절명칭

조절작용의

유형/의미주요 바이오마커들 보조 바이노마커들

장내 콜레스테롤

흡수 조절

장내 콜레스테롤

흡수 지표

콜레스테롤 섭취량

콜레스테롤 배설량

(분변)

T otal cholesterol

(혈장)

영양소 섭취량

(식물성 스테롤에

의한)

콜레스테롤의

흡수저해 지표

콜레스테롤 섭취량

콜레스테롤 배설량

(분변)

Total cholesterol

(혈장)

.영양소 섭취량

콜레스테롤과

담즙산 배설 조절

(동물시험 우선)

스테롤의

체외배설

지표

중성스테롤 배설량

(분변)

산성스테롤 배설량

(분변)

Total cholesterol

(혈장)

영양소 섭취량

혈장 콜레스테롤

대사 조절

고콜레스테롤혈증

및 동맥경화유도

위험성 예측 지표

Total cholesterol

(혈장)

LDL-cholesterol

HDL-cholesterol

Apo A-I

Apo B

산화 LDL

Atherogenic index

Paraoxonase 활성도

VLDL-chol.

LP(a)

HDL-C/Total-C

비율

적혈구 항산화

효소 활성도

TBARS 농도

영양소 섭취량

콜레스테롤 역수송

조절CETP 활성도 저해

혈장 CETP 활성도

혈장 LCAT 활성도

Total cholesterol

(혈장)

HDL-cholesterol

분변스테롤 수준

HDL-C/Total-C

비율

(3) 검정결과를 통한 각 바이오마커의 표준 분석법 제시

별지 부록에 구체적으로 제시하였음.

4. 참고문헌(Reference)

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5. 부 록

(1) 유효량 결정을 위한 animal-to-human extrapolation

건강기능식품의 섭취량 제안을 위해서는 유효성을 보장하기 위한 과학적 근거

자료가 제시되어야 하고 안전한 섭취범위에 속함을 증명할 수 있는 자료 첨부

가 필수적이다. 동물실험 자료를 제출할 경우에는 animal-to-human

extrapolation이 적합한가를 판단할 수 있는 근거 자료가 필요하다. 동물실험

만으로 인체의 적정 섭취량을 환산할 경우 동물의 단위체중당 섭취량과 단위

열량 당 함량을 이용할 수 있는데 그 예시는 다음과 같다. 단,

Animal-to-human extrapolation 산출법은 과학적 근거에 의한 것이면 타 산출

법도 적용가능하다.

예시)

- 어떤 기능성 물질 (X)이 동물시험 흰쥐 식이에 0.02% (20 mg/100 g diet)

을 보충한 결과 혈장 콜레스테롤 저하 효능이 입증되었음.

- 인체에서 동일 효능을 나타내기 위해 권장되는 물질 “ X“ 의 섭취량 환산

법: 흰쥐가 약 20g/day (약 80 Kcal)의 사료를 섭취한다면 4 mg 물질

“ X“ /20 g diet = 4 mg/80 Kcal = 5.2 mg/100 Kcal로 산출된다.

한편, 성인 남자의 열량권장량은 1일 2500 Kcal 이므로, 물질 “ X“ 의 1일 섭

취권장량은 5.2 mg/100Kcal x 2500 Kcal = 130 mg 으로 제안할 수 있다.

이와 같이 물질 “ X“ 는 그 순도를 고려하여 해당 권장섭취량의 산출이 가능

하다.

(2) 피험자 수 산출근거 (예시)

본 연구에서는 시험군에게는 시험물질과 대조군에게는 placebo를 투여하여 oo

개월 후에 혈장 콜레스테롤 농도를 측정하여 두 집단에서 개선으로 판정될 비

율을 기준으로 피험자의 수를 결정한다.

◈ 피험자수의 결정

가. 연구자에 따른 효과와 성별효과를 제거하고 순수한 시험물질의 효과를 뚜

렷하게 밝혀내기 대상자의 성별을 렌덤화한 디자인한다. (replicated

randomized complete block design)

나. 각 피험자의 시험군과 대조군의 배정은 독립적으로 동수로 임의배정한다.

다. 시험물질의 효과가 유의하다고 잘못 설명하는 위험확률 (유의수준) = α ,

시험물질의 효과가 유의하지 않다고 잘못 설명하는 위험확률 (-오류) = 1-β

본 연구에서는 α =0.05, d=0.2 β =0.2라 둔다. 즉, 유의수준은 5%이며 시

험군과 대조군의 효과의 차이가 20% 일때의 검정력이 1-0.2=0.8이다.

라. 피험자의 수는 다음과 같이 이중표집법 (double sampling)을 사용한다.

p1 : 시험군 (건강기능식품군)의 치료효과

p2 : 대조군의 치료효과

m1, m2 : 1단계, 2단계에서의 시험군의 피험자수

n1, n2 : 1단계, 2단계에서의 대조군의 피험자수

m = m1 + m2 : 시험군의 최종적인 피험자수

n = n1 + n2 : 대조군의 최종적인 피험자수

귀무가설

대립가설

m1 = n1 = 20 : 1단계에서의 피험자수는 시험군과 대조군에 각각 20명씩으로

한다.

바. 1단계 시험후 다음과 같이 2단계시험을 한다.

: 1단계 시험에서 시험군의 효과

: 1단계 시험에서 대조군의 효과

여기서

이다.

그러면 다음과 같은 결정을 한다.

(1) 만일 이면 시험을 종료한다. 따라서 이 경우는 피험자

수는 이며 검정력은 이다. 단, 는 표준정규분포의 누적분

포함수이다. 이때

이면

시험물질의 효과가 통계적으로 유의수준 5%에서 유의하다고 결론 내린다.

(2) 만일 이면 2단계 시험을 행한다.

사. 2단계 시험은 다음과 같이 한다.

시험군과 대조군에서 각각 와 명의 피험자를 선택한다. 편의상

으로 한다. 그러면 최종적으로 피험자수는 시험군에서

이며 대조군에서 가 된다. 또한

이면

시험물질의 효과가 통계적으로 유의수준 5%에서 유의하다고 결론내린다.

여기서

: 2단계 시험에서 시험군의 효과

: 2단계 시험에서 대조군의 효과

: 시험군에서의 최종효과

: 대조군에서의 최종효과

이며 시험물질의 효과가 d일때의 검정력은 이다. 여기서

이다.

만일 이면 시험물질은 유효성을 가진다.

(3) 각 바이오 마커의 표준 분석법 제시(필요한 바이오마커만 선택)

가. 혈장지질 및 콜레스테롤 관련 바이오마커 분석법

혈장의 콜레스테롤 함량 변화

혈장 지단백질 중 HDL은 dextransulfate-MgCl2 침전법으로 분리하고, 혈장 총

콜레스테롤과 HDL-콜레스테롤 농도는 Allain 등 (1974)의 효소방법에 의한 총

콜레스테롤 측정용 시액 (아산제약 kit)의 효소시약과 반응시킨 후 500 nm에

서 흡광도를 측정하여 각각의 표준곡선을 기준으로 농도를 계산한다.

Friedewald 공식으로 LDL-cholesterol 농도를 산출할 수도 있으나 이 공식은

대부분의 혈장 중성지질이 VLDL내에 있고, VLDL내의 중성지방:콜레스테롤은

5:1이다 라는 가정 하에 성립한다. 즉, 고 중성지질혈증 (>4.5 mmol/L)일 경

우에는 이 공식이 부정확하므로 사용할 수 없다.

LDL-cholesterol, mg/dl (by Fredwald formula) = Total Chol. - HDL Chol. -

(Triglyceride/5)

혈장 지단백질 profile 분석

혈장 lipoprotein profile은 FPLC를 이용하여 얻으며 실험군간 각 지단백

peak의 지질조성을 비교분석한다.

Apolipoprotein 분석

초고속원심분리에 의해 분리한 각 지단백질 분획을 delipidation 시켜 poly-

acrylamide gel 전기영동을 실시함으로써 각 식이군간 apolipoprotein band

(apo A-I, apo B, apo C, apo E 등)를 비교분석한다. 아울러 각

apolipoprotein의 절대량은 immunoassay kit를 사용하여 측정한다.

혈장 lipoprotein(a) (Lp(a))

Lp(a)는 콜레스테롤이 풍부한 지단백질로 LDL의 일부 구조와 LDL의 apo B-100

에 disulfide 결합된 apo(a)로 구성되어 있으며 일반적으로 혈장 Lp(a)수준의

증가는 동맥경화 (atherosclerosis)의 위험인자로 간주된다.

혈장 Lp(a) 농도는 두 개의 monoclonal anti-apo(a)항체, 즉 Sepharose

microbeads에 결합하는 trapping 항체와 radioiodinated된 reporting 항체를

이용한 radioimmunoassay (Pharmacia Diagnostics AB)로 측정한다. 혈장과 표

준물질을 항체와 항온반응시켜 원심분리하여 beads에 결합된 antigen을 분리

한 다음, gamma counter로 측정하여 표준곡선을 이용하여 계산한다.

혈장 LDL-immune complexes (LDL-IC)

LDL-IC는 지단백질과 콜레스테롤 대사를 방해하여 동맥경화에 관여하는 것으

로 일반적으로 혈장LDL-IC는 동맥경화증에서 증가한다.

LDL-IC에 결합된 IgG를 측정하기 위해 enzyme-linked immunosorbent assays

(ELISA) 방법을 이용한다. Microtitre plate (Costar, Cambridge, USA)를 PBS

(20 ug/ml, 100 ul)용액에 정제된 monoclonal antibody BL3를 첨가하여 실온

에서 12시간 동안 coating시킨다. BL3는 인간 LDL의 apoB의 residue 4355로

향하게 되며, native LDL과 높은 친화력을 가지는 반면 ox-LDL과 낮은 친화력

을 나타낸다. 위의 각 plate는 capture antibody가 없는 negative control 들

을 포함시킨다. 0.05% Tween 20, 0.1% BSA, 0.001% aprotinin을 첨가한 0.1

mol/l PBS로 네 번 세척한 후, solid phase antibody는 0.1 mol/l PBS로 제조

한 5% BSA로 실온에서 2시간 동안 포화시킨다. 그 다음, plate는 0.1 mol/l

PBS로 네 번 세척한다. 세척 후, solid phase antibody는 100 ul 항원 (혈장

은 0.05% Tween 20, 0.2% BSA로 1:500 희석)과 duplication으로 실온에서 2시

간 동안 항온 반응시킨다. 이때 각 plate에 control 혈장을 첨가하며 PBS 용

액으로 구성되는 blank를 둔다. PBS용액 반응시킨 well은 0.1 mol/l PBS

(0.05% Tween 20, 0.2% BSA)로 네 번 세척한다. goat에서 제조한 peroxidase

conjugated anti-human IgG (Sigma)를 0.1 mol/l PBS (0.05% Tween 20, 0.1%

BSA)로 1:3000으로 희석하고 100 ul를 첨가하여 37℃에서 2시간동안 반응시킨

다. PBS 0.1mol/l로 네 번 세척한 후, hydrogen peroxide (3.5mmol/l)를 함유

하는 phosphate citrate buffer (pH 5.5) 용액으로 조제한 OPD (100ul, 3

g/l)를 각 well에 첨가하고 암실 (실온)에서 30분 동안 반응시킨다. 1 mmol/l

HCl 100 ul를 첨가하여 반응을 종료시킨 다음, 492 nm에서 흡광도를 측정한

다. control 혈장의 optical density 대한 실험 혈장의 optical density의 비

율인 AU로서 나타낸다.

혈장 lecithin: cholesterol acyltransferase (LCAT) 활성도 측정

Glomest와 Wright (1964)의 방법에 의해 방사성 동위원소를 이용하여 콜레스

테롤 기질에 대해 혈장의 esterification을 측정한다. 즉, 10 ml의

chloroform과 25 uCi의 7-3H(N)-cholesterol (New England Nuclear Co.), 2 g

의 celite 545 particle 및 10 mg의 비표식 콜레스테롤을 균일하게 섞은 후

질소가스를 이용하여 기화시키면 콜레스테롤이 celite에 흡착되어 4℃에서 수

주 보관이 가능하다. 기질로 사용하게 될 혈장은 56℃에서 30분 동안

incubation시켜 LCAT 활성도를 불활성화 시키고 혈장 1 ml당 50 mg의 분말 고

체 흡착 가능 표식 celite 입자와 함께 플라스크에 넣어 37℃에서 기계적으로

18-20분 동안 교반한 후 원심분리하여 celite입자를 제거한다.

LCAT 활성도 측정에는 혈장 0.2 ml와 표식기질 혈장 0.5 ml을 37℃ 진탕기에

서 3시간 방치하고, 대조 플라스크에는 56℃에서 30분 동안 가열한 시험혈장

을 사용한다. 지질 추출은 Folch 등 (1957)의 방법을 이용한다. 즉 0.5 ml의

혼합 방치액에 10 ml의 methanol-chloroform (2:1)용액을 가한 후 여과지에

걸러 침전물을 제거하고 0.2 ml의 물을 가하여 흔든 다음 하부 기질함유층에

서 1.5 ml을 취하여 질소가스로 건조 시킨다.이 기질을 소량의 chloroform에

녹여 thin-layer chromatography (TLC, Silica Gel 60F245, Sigma)에 점적한

후 petroleum ether-diethylether-glacial acetic acid (90:15:1.5)용매를 이

용하여 전개한 후 iodine vapors에 노출시키면 콜레스테롤과 콜레스테롤 에스

터 밴드가 나타난다. 각 밴드를 긁어 각기 다른 counting vial에 넣고 10 ml

의 counting cocktail (New England Nuclear Co.의 42 ml Liquiflour +

tolune 1000 ml)을 가하여 용해한 후 liquid scintillation counter로

radioactivity를 측정한다. LCAT 활성도는 반응 혼합액의 유리 콜레스테롤의

양을 측정하여 혈장 1 ml당, 시간당 형성된 콜레스테롤 에스터 양으로 나타낸

다.

Cholesteryl ester transport protein (CETP) 활성도 측정

사람의 지단백대사와 유사한 토끼와 마우스에 적용된다. CETP 활성분석법은

Park 등 (1992)이 발표한 새로운 방법을 사용하여 혈장 CETP가 HDL의 CE를

LDL이나 VLDL로 얼마나 이동시키는가를 측정한다. CETP 반응기질 중 CE-donor

로 합성 HDL (HDLR)을, CE-acceptor로는 합성 LDL(LDLR)을 제조하고 HDLR은

agarose에 고정시켜 사용한다. CE transfer활성도 측정을 위해 [3H]-CE로 표

식된 [3H]-CE-HDLR을 CE-donor로, 그리고 동위원소표식이 없고 cholesteryl

ester 성분이 거의 없는 상태로 합성되어진 LDLR을 CE-acceptor로 사용하며,

CETP source는 혈장을 사용한다. 30분간 혈장과 CE-donor 및 CE-acceptor를

넣고 incubation한 뒤 3000 xg에서 5분간 원심분리하여 [3H]-CE-HDLR-agarose

를 제거하고 상등액 중 일부를 scintillation vial에 옮겨 5 ml의

scintillation cocktail solution을 넣은 후 방사능 활성은 Liquid

scintillation counter로 계측하고, CETP활성도는 [3H]-CE-HDLR-agarose에서

LDLR로 이동된 % CE transfer로 나타낸다.

나. 간조직의 콜레스테롤대사 조절과 관련된 지표 분석

간조직의 콜레스테롤 정량

간조직의 지질은 Folch등 (1957)의 방법으로 추출하고, 조직지질정량은

Omodeo Sale등 (1984)에 의해 수정된 방법을 이용한다. 효소시액에 유화제로

0.5% Triton X-100와 3 mM sodium cholate를 혼합하여 발색시에 일어나는 탁

도를 제거하고, 콜레스테롤 함량은 혈장과 같은 방법으로 측정한다

HMG-CoA reducrtase 활성도

효소원인 microsome 분리는 Hulcher와 Oleson (1973)의 방법을 약간 수정하여

시행한다. 간 2 g을 0.1 M Triethanolamine, 0.02 M EDTA (pH 7.4), 2 mM DTT

가 포함된 완충용액으로 homogenization한 후, 10,000xg와 12,000xg에서 차례

로 원심분리한 상층액을 100,000xg에서 초원심분리하여 상층액을 버리고 현탁

하여 세척한 다음, 다시 100,000xg에서 초원심분리한다. 분리된 microsome을

1 ml 완충용액에 현탁시켜 액체질소에 보관하였다가 필요시마다 사용하고,

Bradford 방법으로 단백질을 정량한다. Assay 방법은 Shapiro 등 (1974)이 실

시한 방법을 수정 보완하여 실시한다. Microsome 100 ㎍~300 ㎍을 NADPH 500

nmole과 [14C]-HMG-CoA 50 nmole (1,200 cpm or 2,400 cpm/nmole specific

activity)에 혼합하여 37℃ 항온수조에서 15분간 반응시킨 후, 1/5 volume15

㎕) 6N HCl을 혼합하여 다시 15분간 37℃ 항온수조에서 반응시킨다. 이렇게

mevalonate를 lactone form으로 만든 후 Silica Gel 60F254 TLC plate에 점적

하여 전개시키고 mevalonate standard (lactone form)와 비교하여 Rf 값이

0.2 부근의 band를 잘라 scintilation counting한다.

활성도는 1분 반응당 microsome 단백질 1 mg이 생성하는 mevalonate양을

pmole로 나타낸다.

ACAT (acyl-CoA:cholesterol acyltransferase) 활성도

Erickson 등 (1980)과 Gillies 등 (1986)의 방법을 수정 적용한다. Triton

WR-1339에 녹인 cholesterol 6 ug (20 ul), 1M KPB (pH 7.4), 0.6 mM BSA 5

ul와 2)에서 분리한 50~100 ug microsome을 잘 섞은 후 물로 180ul까지 채우

고, 37℃에서 30분간 전반응시킨다. [14C]-Oleoyl-CoA (specific activity;

15,000 pm/nmole) 5.62 nmole을 섞어 전체 volume이 200 ul가 되게한 후 37℃

에서 30분간 반응시키고 500 ul의 Isopropanol:Heptane (4:1)용액, 300 ul의

heptane, 그리고 200 ul의 0.1MKPB (pH 7.4)를 넣고 잘 섞은 다음 실온에서 2

분간 방치한다. 상등액 중 200 ul를 취하여 Scintilation counting한 값을 2

배 (보정인자)로 곱하여 활성도를 측정한다. 활성도의 계산은 HMG-CoA

reductase와 마찬가지로 1 mg의 microsome 단백질이 1분간 생성하는

Cholesteryl Oleoate의 pmole수 (pmoles Cholesteryl Oleoate (CE)

formed/min/mg·microsomal protein)로 나타낸다.

Cholesterol 7α -hydroxylase 활성도

Cholesterol 7α -hydroxylase는 간의 microsome에서 측정한다. 최종 volume 2

ml에 microsomal protein 1.5-2.0 mg/ml, 0.1 M potassium phosphate buffer

(pH7.4), 0.1 mM EDTA, 50 mM NaF, 2 mM NADPH, 20 mM cysteamine, 200μ M

cholesterol, 1.5 mg/ml Tween 80, 6μ Ci[7(n)-3H] cholesterol 농도가 되도록

첨가한다. 37℃, 30분간 incubation 시킨 후, 20% TCA 6 ml을 가해 반응을 중

지시키고, 1,500×g에서 10분간 원심분리한다. 반응하지 않은 동위원소가 표지

된 cholesterol을 추출하기 위해 chloroform을 상등액에 가한다. chloroform

으로 2회 추출한 후, 상층액 1ml을 counting vial에 transfer한다.

Radioactivity를 scintillation fluid에서 측정하여 pmole/min/mg of

microsomal protein로 나타낸다.

다. 콜레스테롤 흡수 조절효소 활성 분석

Intestinal cholesteryl ester hydrolase (PCEH) 활성도 측정 (소장액과 점막

조직)

Harrison (1988)의 방법에 의하여 적당히 희석된 효소원 20 ㎕는 50 mM Tris-

maleate, PH8.0, 20 mM sodium cholate, 0.05μ Ci of cholesteryl

[1-14C]oleate (mCi/mmol)와 혼합하여 37℃에서 60분간 항온반응시킨 후 반응

생성물 [1-14C]oleic acid를 측정한다.

Intestinal cholesteryl esterase (PCE) 활성도 측정 (소장조직)

Cholesteryl esterase 활성은 PCEH 활성도 측정과 유사하며 cholesteryl

[1-14C]oleate를 함유하는 혼합물부터 [14C]oleic acid의 방출을 측정한다. 혼

합액은 1.33mM egg phosphatidylcholine 1ml (in hexane), 10 ul cholesteryl

[1-14C]oleate (2.2 x 106 cpm)(in chloroform)를 함유하는 1 mM cholesteryl

oleate 1.27 ml 용액을 질소가스로 용매를 휘발시킨 후 150 mM Tris buffer

(pH 7.5) 10 ml로 vortex 한다. 다음 질소로 20분간 얼음위에서 초음파 처리

한 후 48000 xg, 60분간 원심분리한다.

Cholesteryl [14C]oleate 혼합액 75ul, 100 mM taurocholate 25 ul, 150 mM

Tris buffer(pH 7.5) 175 ul를 혼합하고, 여기에 효소 25 ul를 첨가하여 37℃

에서 5분간 가수분해한 후. 0.3 N NaOH 600 ul와 benzene:methanol:

chloroform (1:1.2:0.5) 3 ml를 첨가하여 반응을 종료시킨다. 반응액을 원심

분리하여 수층 1ml의 방사능을 측정한다. 활성은 시간당, 1 ml당 방출되는

oleic acid의 nmole로 나타낸다.

Intestinal acyl-CoA:cholesterol acyltransferase (ACAT) 활성도 측정

소장 ACAT 활성도는 간 혹은 동맥조직의 ACAT 활성도 측정법과 동일하게

적용한다.

라. Fecal의 콜레스테롤 배설 분석

Fecal Neutral Sterol 정량

분변의 neutral sterol, 즉 coprostanol, coprostanone, cholesterol 배설량

은 Czubayko 등 (1992)에 의한 방법에 따라 건조된 분변을 막자시발에 갈아

1g을 취한 후 internal standard로서 1mg 5α -cholestane을 첨가한다.

여기에 1 N NaOH (in 90% ethanol) 10 ml를 가하여 67℃ 수조에서 1시간 동안

mild alkaline hydrolysis시키고 실온에서 식힌 다음 물 5 ml를 가하고 7 ml

cyclohexane으로 3번 추출한다. 추출된 용액은 질소기체하에서 건조시킨 다음

cyclohexane 600 ul에 용해시켜 GC로 정량한다.

Fecal Acidic Sterol 정량

총 bile acid 정량은 Michael 등 (1980)의 방법을 보완한 방법을 이용한다.

15psi하에서 10 N NaOH에 의해 가수분해된 bile acid 분획을 CHCl3:MetOH

(2:1)으로 추출건조시킨 후 3α -hydroxysteroid dehydrogenase와 반응시킨 생

성물의 양을 분광광도계를 사용하여 340 nm에서 측정한다.

마. 콜레스테롤 조절물질의 항동맥경화기능 검증을 위한 biomarker 분석법

동맥 및 조직의 플라그와 형태학적 분석

간과 동맥조직세포의 형태학적 관찰을 위해 동물 희생시 적출한 간과 동맥조

직 일부를 적출하여 10% formaldehyde 용액에 24시간 고정한 다음 같은 용액

으로 2회 교환한다. 이어서 2배수 ethanol로 탈수하여 paraffin에 포매하여 4

um 두께로 박절하여 hematoxylin-eosin으로 염색한 다음 광학현미경에서 200

배 및 400배 배율로 관찰함. 간은 Oil Red O로 염색후 지방세포수를 측정하고

동맥의 플라그 형성정도는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 자동계산한다.

조직의 PPAR (peroxisome proliferator activator receptor) 분석

혈관세포에서 동맥경화 진행을 막는 기능성 물질은 혈관에 대해 직접적으로

작용 하게되며 이는 PPAR에 대한 ligand 활성을 변화시킴. PPAR ligand는 지

방산 혹은 지방산 유래 화합물로 내피세포의 VACM의 발현을 막아 단핵구와 내

피세포의 부착을 감소시키며 대식세포의 염증작용도 억제함. 따라서 PPAR

ligand 분석은 매우 중요하며 Ricote 등의 방법에 의해 실시한다.

혈장과 플라그의 Oxidized LDL (oxLDL) 수준 분석

DLH3 (5 ug/ml in PBS, 100 ul/well)로 코팅된 microtiter wells은

tris-buffered saline (0.05 mol/L, pH 8), 1% BSA에 의해 block된다. 각각의

분석에서 적당히 희석된 혈장과 플라그 LDL 일부 100 ul을 well에 첨가하고

(혈장 LDL/: 2-10 g protein/well, plaque LDL: 0.5-5 ug protein/well) 표준

oxLDL을 0.2-8.0 ng/well로 첨가한다. 그 plate는 4℃에 overnight로 항온반

응시킨다. 세척 후 남은 oxLDL은 sheep anti-human apoB IgG antibody

(Boehringer) 100 ul와 alkaline phosphate-conjugated donkey anti-sheep

IgG antibody (Chemicon) 100 ul로 측정된다.

Alkaline phosphatase의 반응성은 p-nitrophenylphosphate hexahydrate

(Wako) 1 mg/ml이 함유된 100ul 기질용액에 37℃ 적당한 시간으로 항온반응한

후 405 nm에서 측정된다. ug protein 당 oxLDL은 표준선으로 계산된다. 포화

범위에 있는 시료의 data는 버린다. 동시에 ELISA parallel set는 동일한

lipoprotein 일부에서 anti-apoB mAb을 사용하여 apoB의 양을 측정하는데 사

용한다(OEM Concepts). apoB 측정을 위해서 native LDL (0.5-15 ng/well)은

표준물질로서 각각 ELISA plate에 첨가한다. OxLDL 수준은 apoB protein ug당

oxLDL 양으로 나타낸다.

혈장의 C-Reactive Protein (CRP) 수준 분석

간에서 급성 염증과 감염반응시 생성되는 CRP 수준의 증가는 내피혈관 확장의

기능이상과 경동맥경화증 진전과 관련되는 것으로 알려져 있다. 일반적으로

혈장내 높은 CRP 수준은 동맥경화와 관련된다.

혈장 CRP 수준은 ligand-labelled monoclonal 항체와 anti-ligand-coated

solid phase 분리법을 기초하여 chemiluminescent enzyme-labelled

immunometric 방법으로 측정한다 (Immulite, Dipesa SA, Madrid, Spain).

코팅된 항체 (rabbit IgG to human CRP)를 2.75 mg/l in sodium carbonate

buffer (16 mmol/l Na2CO3, 34 mmol/l NaHCO3, pH 9.5)에 희석하고 Nunc

Maxisorp microtiter plate의 well에 200μ l를 넣은 다은 4℃에서 18시간 항

온반응한다. Plate의 채워지지 않은 결합부위에는 well당 250 μ l PBS와 20

g/l BSA, pH 7.4로 2시간동안 block한다. 혈장, controls, calibrators, and

biotinylated CRP 는 희석 buffer (PBS plus 1.0 g/l Tween 20, 20 g/l BSA,

5 mmol/l EDTA, pH 7.4)로 희석한다. 혈장은 10배 희석으로 분석한다. 10

mg/l CRP로 시작하는 nine-point calibration curve을 사용하고, 3배 연속적

으로 희석한다. Well은 PBS (1.0 g/l, Tween 20, pH 7.4)로 2번 세척한 후,

well당 희석한 sample, control, calibrator를 100ul load 한 다음 희석한

biotinylated CRP 100 ul를 즉시 첨가하여 혼합한 후 4℃에서 overnight 항온

반응시킨다. Horseradish peroxidase- conjugated ABC (ABC reagent)에

PBS-Tween 20 (pH 7.4) 21 ml 당 시약 A 1방울과 시약 B 1방울을 첨가한 후,

실온에서 60분간 항온 반응시킨다. 분석 plate를 PBS-Tween 20으로 4번 세척

후에, well 당 ABC시약 200 ul을 첨가하고, 분석 plate를 90분간 항온반응한

다.

각각의 well에 기질용액 (0.02% o-phenylenediamine in citrate buffer),

(0.1 mol/l citric acid, 0.2 mol/l Na2HPO4, adjusted pH 5.0) 200 ul를 첨가

하고, 0.039 g/l H2O2를 넣어서 활성화시킨다. 암실에서 plate를 실온에서 30

분간 항온반응한 후에, well 당 4 mol/l H2SO4, 50μ l를 넣어서 효소적 반응을

종결시킨다. 생성된 색을 490nm에서 측정하며 분석의 표준화를 위해서 1st

International CRP Standard로 계산된 human CRP를 사용한다.

혈장 nitrite 및 nitrate (NO2-/NO3

-) 수준 분석

혈장 NO2-/NO3

- 농도는 자동화된 NO detector-HPLC system (ENO10; Eicom Co.,

Kyoto, Japan)으로 측정한다. NO 측정기 연결된 시료주입기에 시료를 넣는다.

Dialysates의 NO2-와 NO3

-는 polystyrene polymer로 paked된 reverse-phase

seperation column (NO-PAK, 4.6× 50 mm, Eicom)으로 분리한다.

NO3-는 copper-plated cadmium column으로 packed된 reduction column

(NO-RED, Eicom)에서 NO2-로 환원한다. NO2

-는 Griess reagent (0.5%

sulfonamide, 0.025% N-naphtylethyl-ethylenediamine dihydrochloride, 그리

고 1.25% HCl)과 혼합하여 반응 코일에서 보라색 azo dye를 형성을 한다.

Griess reaction 산물의 색은 flow-through spectometer (NOD-10, Eicom)에

의해 540 nm에서 측정한다.

혈관내피세포 nitric oxide synthase 활성 측정

혈관내피세포의 eNOS 활성은 동물의 대동맥을 채취하여 1 mM EDTA PBS으로 균

질화하여 원심분리하여 얻은 상층액의 5 ug 단백질을 효소원으로 하여 NOS 측

정 kit (Calbiochem-Novabiochem)로 활성을 측정한다. 표식되지 않은

L-arginine을 표식된 [3H]L-arginine에 3:1의 비율로 첨가하여 [3H]L-arginine

이 [3H]L-citrulline으로 전환되는 정도를 측정한다. 이때 경쟁적 NOS 저해제

인 L-NAME (1 mM)을 대조로 하여 활성을 나타낸다.

바. 콜레스테롤 조절물질에 의해 변화되는 항산화효소 biomarker 분석법

혈장의 paraoxonas (PON) 활성도 측정

PON 활성도 측정은 Mackness 등 (1991)의 방법을 수정, 적용한다. 반응액으로

2 mM CaCl2를 포함한 0.1 M Tris-HCl buffer(pH 8.0) 및 기질인 5.5 mM

paraoxon (O,O-diethyl-O-ρ -nitrophenylphosphate)에 효소원인 혈장을 첨가

하여 총 반응액부피를 1 ml로 한다. 효소원 첨가 즉시 25℃, 405 nm에서 90초

간 생성되는 ρ -nitrophenol의 흡광도를 측정한다.

동맥과 간조직의 항산화효소 활성도 측정

① 효소원의 조제

동맥 및 간조직 2 g을 취하여 10ml의 0.25 M sucrose buffer를 가하고

homogenization시킨 후 600×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취하고

10,000×g에서 20분간 원심분리하여 mitochondria 분획을 얻고, 상층액은 다

시 105,000×g에서 1시간동안 초원심분리하여 cytosol 분획을 분리한다.

Mitochondria 분획은 catalase 활성측정에, cytosol 분획은 GSH-Px 및 SOD

활성도 측정에 사용한다.

② Superoxide Dismutase (SOD)

SOD 활성도는 알칼리 상태에서 pyrogallol의 자동산화에 의한 발색을 이용한

Marklund와 Marklund의 방법 (1974)으로 측정한다. 즉, 50 mM Tris-HCl

buffer 2.8 ml과 15 mM의 pyrogallol 0.1 ml을 혼합하여 5℃에서 5분간 전반

응시킨 후 시료 0.1 ml를 가하여 25℃에서 10분간 반응시키고, 1 N HCl 0.1

ml을 가하여 반응을 종료시킨 후 440 nm에서 흡광도 변화를 측정한다. 효소

활성 단위는 효소액을 넣지 않고 반응시킨 15 mM pyrogallol 용액의 자동산

화를 50% 억제하는 단백질의 양으로 정한다.

③ Catalase

Catalase 활성도는 Abei (1974)의 방법으로 측정한다. 즉, 50 mM potassium

phosphate buffer (pH 7.0) 2.89 ml에 기질인 30 mM H2O2 100 ul를 넣어 25℃

에서 5분간 반응시킨다. 여기에 시료 10 ul를 가하여 25℃로 조절된

spectrophotometer를 이용하여 240 nm에서 5분간 흡광도를 측정한다. H2O2의

흡광도 변화와 H2O2의 몰흡광계수로 H2O2의 농도를 구한 다음 decreased H2O2

nmol/min/mg protein으로 효소활성도를 계산한다.

④ Glutathione Peroxidase (GSH-Px)

GSH-Px 활성도는 Paglia와 Valentine의 방법 (1967)으로 산화형 glutathion

이 glutathion reductase와 NADPH에 의하여 환원될 때 NADPH의 흡광도가 340

nm에서 감소하는 정도를 측정한다. 즉, 0.1M Tris-HCl (pH 7.2) buffer 2.6

ml과 30 mM 환원형 glutathion 0.1 ml을 넣고 6 mM NADPH 용액 0.1 ml에

6.25μ M H2O2를 넣은 뒤 25℃에서 5분간 전반응시키고, 여기에 0.1 ml의 시료

를 혼합하여 25℃에서 5분간 반응시킨 후 340 nm에서 흡광도를 측정한다. 효

소활성 단위는 1분간 1 nmol의 산화형 NADPH를 생성하는 효소의 양으로 나타

낸다.

혈장과 간 및 동맥조직의 지질과산화물 함량 (TBARS 분석)

혈장 지질과산화물 함량 측정은 Tarladgis 등 (1964)의 방법을 이용하여 혈

장 0.5 ml에 5% TCA (thiochloroacetic acid) 3 ml와 0.06 M TBA

(thiobarbituric acid) 1 ml을 첨가하여 80℃에서 90분 동안 반응시킨 후

이것을 실온으로 냉각시켜 2,000 rpm (25℃)에서 15분간 원심분리한 후 상층

액을 취하여 535nm에서 흡광도를 측정한다. MDA 표준용액은

tetramethoxypropane (TMP)을 가수분해하여 조제하며, 267 nm에서 나온 MDA

표준용액의 흡광도와 MDA 흡광계수로부터 정확한 표준용액의 농도를 계산한

다. 즉 TMP 1 mmol을 0.01 N HCl 용액 100 ml에 녹여 50℃에서 60분간 반응

시킨 후 실온으로 냉각시켜 MDA로 TMP를 가수분해시키며 가수분해된 TMP 용

액 1 ml을 0.01 M Na3PO4 (pH 7.0) buffer 100 ml에 희석시켜 MDA 표준용액

(1×10-4M)을 제조함. 제조된 표준용액은 혈장과 동일한 조건에서 반응시켜

TBA-MDA chromopore 표준곡선을 얻고, 이 곡선으로부터 TBA 반응 물질의 양

을 MDA equivalent로 산출한다.

동맥과 간조직의 TBARS 함량은 Ohkawa 등 (1979)의 방법을 이용하여 조직 1

g에 0.1M potassium phosphate buffer (pH 7.4) 4 ml을 첨가하여 빙냉상태에

서 glass teflon homogenizer (Glascol, 099C K44, USA)로 분쇄한다. 분쇄물

0.2ml, 8.1% sodium dodecyl sulfate (SDS) 용액 0.2 ml, 그리고 증류수 0.6

ml를 섞어 실온에서 5분간 방치한 후 20% acetate (pH 3.5) buffer 1.5 ml와

0.8% TBA 1.5 ml를 첨가하여 95℃에서 1시간 동안 반응시킨다. 반응 후 시료

를 실온으로 냉각시켜 증류수 1 ml와 n-butanol:pyridine (15:1) 용액 5 ml

를 첨가하고 3,000rpm 에서 15분간 원심분리한 후 상층액의 흡광도를 532 nm

에서 측정한다. MDA 표준용액은 혈장 TBARS와 동일한 방법으로 제조하여 이

용한다.