肖少波

华中农业大学动物病毒室

猪繁殖与呼吸综合征病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒基因工程疫苗研究基因工程疫苗研究

猪繁殖与呼吸综合征 (PRRS)，又称兰耳病1987年首次暴发于美国北卡罗纳州——“神秘病”，导致至少 100万头猪死亡1991年， PRRS席卷欧洲大陆1996年， PRRS在我国首次爆发；同年，丹麦再次暴发PRRS，全国 40-50%的母猪出现流产、死胎和断奶前仔猪的大量死亡2000年，美国再次大爆发 PRRS，并将其列为当前最严重的猪病毒性传染病目前， PRRS遍及世界养猪国，并呈流行态势

猪繁殖与呼吸综合征

猪繁殖与呼吸综合征的危害

母猪—早产、流产、死胎、弱仔公猪—精液品质下降初生仔猪—高死亡率其它年龄猪—呼吸系统疾病

蓝耳病流行新动向近年来，病原致病力似有所增强，表现为怀孕母猪更加严重的流产和新生仔猪的高死亡率（Oleksiewicz, et al.) 。

非典型性病原导致的“流产风暴”。

自1999年 Rossow等在蓝耳病高发猪群中分离到嗜神经型蓝耳病病毒以来，目前越来越多的嗜神经型蓝耳病病毒被分离，提示蓝耳病病毒可能在扩大其靶组织或器官。

蓝耳病流行新动向最近，欧洲型 PRRSV在北美洲被多次分离到，表明该病的流行已不再局限于原来欧洲型只出现在欧洲的格局，预示欧洲型 PRRSV可能正在向世界范围蔓延。

蓝耳病流行新动向PRRSV导致的直接经济损失越来越大

根据美国农业部 2005年统计的资料表明，2004年，蓝耳病导致的直接经济损失为5.6032 亿美圆。（ Neumann et al. J Am Vet Med Assoc. 2005 Aug 1;227(3):385-92) 。 

疾病 导致的直接经济损失（折合成 2004年）

蓝耳病（2004年） 5.6032 亿美圆猪瘟（根除计划启动前） 3.6409 亿美圆伪狂犬病（根除计划启动前） 0.3627 亿美圆

蓝耳病流行新动向

蓝耳病导致的间接危害越来越严重；

蓝耳病病毒容易与伪狂犬病毒、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪圆环病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪呼吸道冠状病毒（ PRCV)混合感染；

严重干扰猪瘟的免疫效果—免疫抑制！

最近，还从所谓“无名高热”病料中分离到PRRSV 。

能保护猪不出现临床症状，但不能阻止强毒感染。

只适合 3-18周龄的猪和非孕母猪使用。

存在散毒问题和返强性，并且返强的几率相当高（可达 30%)。

PRRS免疫预防现状—弱毒苗

丹麦事件的教训：丹麦 1996 年 7 月使用美洲型 PRRS

弱毒疫苗免疫后， 1996 年底至 1997 年初出现了PRRS的多次大暴发，全国 40-50%的母猪出现流产、死胎和断奶前仔猪的大量死亡。病毒分离与全基因组序列分 析 证 实 是 由 疫 苗 株 引 起 的 (Masden et

al,1998;Botner et al,2000)

与疫苗株同源性高达 98%以上的强毒株越来越多

   目前，许多国家已禁止使用弱毒苗。

PRRS免疫预防现状—弱毒苗

较弱毒苗安全，但产生的保护力不强，需要反复多次的免疫接种，而且效果不稳定，还经常导致免疫失败。

疫苗安全性与有效性的矛盾以及目前尚无更好的疫苗使 PRRS的免疫预防处于一种两难境况。

迫切需要更安全、高效、廉价的新型疫苗

PRRS免疫预防现状—灭活苗灭活苗

GP5 \E(ORF5)GP5 \E(ORF5)

M (ORF6)M (ORF6)

GP2, GP3, or GP4GP2, GP3, or GP4(ORF 2, 3, 4)(ORF 2, 3, 4)

N (ORF7)N (ORF7)

ssRNA(+)ssRNA(+)

Lipid bilayerLipid bilayer

AAA

蓝耳病病毒结构蓝耳病病毒结构50 10 15kb

p(A)3

45

672b1b

1a5cap

Non-structural Structural

2a

中和抗体相关性

疫苗研究价值 ?

亚单位疫苗  DNA疫苗   腺病毒载体疫苗伪狂犬病毒载体疫苗

新型疫苗研究现状新型疫苗研究现状主要集中在具有诱导机体产生最强中和抗体能力的GP5蛋白

但所有以GP5为目的抗原的新型疫苗免疫猪后均未检测到PRRSV的中和抗体，不能完全阻止蓝耳病及病毒血症的发生

GP5GP5 基因的修基因的修饰饰

   在 GP5基因N 端的覆盖表位与中和表位间插入辅助序列 ，使中和表位充分展示

5’---FAVLVNANSNSSSHFQLIYNLTLCELN---3’ 表位 A （覆盖表位）

表位 B（中和表位）

辅助序列

表达修饰的表达修饰的 ORF5mORF5m基因的基因的 DNADNA疫苗疫苗

CMVP ORF5m

polyApCI-52m

ORF5

polyA

pCI-52P

CMV

免疫小鼠，检测 ELISA抗体、中和抗体和细胞免疫

ELISAELISA 抗体（小鼠抗体（小鼠））

0

0. 1

0. 2

0. 3

0. 4

0. 5

0. 6

0. 7

0. 8

pCI - 52 pCI - 52M pCI - neoGroups

OD(6

30nm

)2 weeks af t erpr i mary vacci nat i on

4 weeks af t erpr i mary vacci nat i on6 weeks af t erpr i mary vacci nat i on

以修饰的ORF5m基因构建的 pCI-52M诱发特异性针对GP5蛋白的 ELISA抗体显著高于未经修饰的 pCI-52。

中和抗体（小鼠）中和抗体（小鼠）

以修饰的ORF5m基因构建的 pCI-52M于首免小鼠后 2周即产生可检测中和抗体（≥ 1 ： 4 ），并且诱发的中和抗体水平显著高于未经修饰的 pCI-52，最高达到 1 ：32。

细胞免疫（小鼠）细胞免疫（小鼠）

0

0. 5

1

1. 5

2

2. 5

3

pCI - neo pCI - 52 pCI - 52M免疫组groups

SI

刺激

指数

（）

stimulation index

以灭活的 PRRSV病毒为特异性刺激原，修饰的ORF5m基因构建的 pCI-52M诱发细胞免疫水平显著高于未经修饰的 pCI52

修饰型ORF5m基因具有更强的免疫原性，有希望成为新一代疫苗候选基因。

研究表明：

(Fang et al. Virus Genes, 2006,32:5-11)

ORF5ORF5 与与 ORF6ORF6基因共表达基因共表达 DNADNA疫苗疫苗

CMVP ORF6

polyA

pCI-ORF6

polyA

PCMV

ORF5

polyA

PCMV ORF6

pCI-ORF5/ORF6

ORF5

polyA

pCI-ORF5P

CMV

kDa

75.0

50.0

M (19kDa)

GP5 (25kDa)

M-M (35kDa)

GP5-M (42kDa)37.0

25.0

20.0

15.0

1 2 3 4 1 2 3 4

50mM DTT + + + + - - - - A B

Western blot检测

变性条件 (A)和非变形条件 (B)

体外共表达的 GP5 和 M 蛋白形成异源二聚体

1: pCI-ORF5/ORF6.

2: pCI-ORF6.

3: pCI-ORF5

4: pCI-neo.

ORF5/ORF6ORF5/ORF6双基因共表达对双基因共表达对 GP5GP5 和和MM 蛋白的亚细胞定位的影响蛋白的亚细胞定位的影响

CMVP ORF6pCI-6RFP

polyA

PCMV

ORF5

polyA

PCMV ORF6

pCI-5GFP6RFP

ORF5

polyA

pCI-5m4EGFPP

CMV m4EGFP

polyA

RFP

m4EGFP RFP

RFP

GP5 (mut4EGFP)

M (DsRed2)A B

C D

(A) pCI-5GFP

(B) pCI-6RFP

(C) pCI-5GFP/6RFP

(D) pCI-5GFP/6RFP

GP5蛋白单独表达时主要定位在细胞核周围的内质网，而与M 蛋白共表达形成异源二聚体时定位模式发生改变，主要定位在高尔基体。

ORF5/ORF6双基因共表达显著增强中和抗体

GP5 和M 蛋白共表达较单独表达所产生的中和抗体显著增强，最高达 1 ： 32。

0

5

10

15

20

25

30

pCI-ORF5

pCI-ORF6

pCI-ORF5+

pCI-ORF6

pCI-ORF5/

ORF6

pCI-neo

Groups

Neu

tralizin

g a

nti

bod

y

2 weeks after primary vaccination4 weeks after primary vaccination6 weeks after primary vaccination

GP5 和M 蛋白共表达较单独表达所产生的细胞免疫应答显著增强，同时联合免疫也表现出一定程度的提高。

1

1. 3

1. 6

1. 9

2. 2

2. 5

2. 8

pCI - neo pCI - ORF5 pCI -ORF5/ ORF6

pCI -52+pCI - 61

pCI - ORF6Groups

Stim

ulat

ing

inde

x

ORF5/ORF6双基因共表达显著增强细胞免疫

研究表明：1. 体外表达的GP5蛋白可以与M 蛋白通过二硫健形成异源二聚体，并且这种二聚体的形成有利于GP5蛋白从内质网向高尔基体的转运，有利于免疫提呈的增强，提高免疫应答。

2. GP5-M异源二聚体形成的几率和多少与免疫反应的强弱具有正相关性。

GP5 和M 蛋白共表达为新型疫苗的研究提供了新的思路。Jiang et al, 2006, Vaccine, 24(15):2869-2879

ORF5mORF5m 与与 ORF6ORF6 基因共表达基因共表达DNADNA疫苗疫苗

polyA

PCMV ORF5m

polyA

PCMV ORF6

pCI-ORF5m/ORF6

polyA

PCMV ORF5

polyA

PCMV ORF6

pCI-ORF5/ORF6

                 SN titers Times Groups

<1:8 1:8 1:16 1:32 the mean

pCI-neo

4W 6 0 0 0 NA

6W 6 0 0 0 NA

8W 6 0 0 0 NA

pCI-ORF54W 6 0 0 0 NA6W 5 1 0 0 NA8W 3 3 0 0 NA

pCI-ORF5m4W 4 2 0 0 NA6W 1 4 1 0 NA8W 0 3 2 1 14.67

pCI-ORF5/ORF64W 4 2 0 0 NA6W 0 4 2 0 10.678W 0 2 3 1 16

pCI-ORF5m/ORF64W 4 2 0 0 NA6W 0 3 3 0 12

8W 0 1 1 4 25.3

ORF5mORF5m 与与 ORF6ORF6 基因共表达增强中基因共表达增强中和抗体和抗体

ORF5mORF5m 与与 ORF6ORF6 基因共表达增强细基因共表达增强细胞免疫胞免疫

PRRSV新一代疫苗设计具有更好免疫原性的ORF5m基因为候选基因

；

采取GP5m 和M 蛋白共表达策略；

以 PRV基因缺失标志疫苗株表达系统，构建

PRV-PRRSV二价基因工程疫苗。

PRV-PRRSV重组病毒构建流程图

空斑纯化

通用转移载体 pgG-Uni

PCR筛选重组中间转移质粒

IBRS-2 细胞

检测

Southern blot

Western blot

TK-/gG-/LacZ+

RV5: TK-/gE-/GP5+

RV56: TK-/gE-/GP5+/M+

RV5m ： TK-/gE-/GP5m+

RV5m6:TK-/gE-/GP5m+/M+

构建的 rPRV-PRRSV重组病毒：

重组病毒免疫小鼠后的 PRV中和抗体

重组病毒免疫小鼠对 PRV的免疫保护

0

1

2

3

4

5

6

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Days after challenge

Su

rviv

al m

ice

TK-/gE-/gI-

rPRV-GP5

rPRV-GP5-M

rPRV-GP5m

rPRV-GP5m-M

Neg control

Time (W) <1:8 1:8 1:16 1:32 the mean

TK-/gE-/LacZ+ 6/8/10 6/6/6 0/0/0 0/0/0 0/0/0 0/0/0

TK-/gE-/GP5+ 6/8/10 6/6/5 0/0/1 0/0/0 0/0/0 NA

TK-/gE-/GP5+/M+ 6/8/10 6/2/1 0/4/5 0/0/0 0/0/0 NA/NA/NA

TK-/gE-/GP5m+ 6/8/10 5/1/0 1/3/4 0/2/2 0/0/0 NA/NA/10.7

TK-/gE-/GP5m+/M+ 6/8/10 6/1/0 0/4/1 0/1/4 0/0/1 NA/NA/17.3

Control 6/8/10 6/6/6 0/0/0 0/0/0 0/0/0 0/0/0

重组病毒免疫小鼠后的 PRRSV中和抗体

GP5与 M 双基因共表达能有效提高针对 PRRSV的中和抗体水平以修饰的 GP5m基因构建的重组病毒能显著提高 PRRSV中和抗体水平，其中以 TK-/gE-/GP5m+/M+最为明显。

重组病毒免疫小鼠后均能产生特异性的淋巴细胞增殖反应。以修饰的 GP5m基因构建的重组病毒均能显著提高特异性细胞免疫反应，其中以 TK-/gE-/GP5m+/M+最为明显。

TK-/gE-/

重组病毒免疫小鼠后的 PRRSV细胞免疫

重组疫苗对猪的免疫反应与攻毒保护

重组疫苗rPRV5m6

PRRSV灭活疫苗阴性对照PRV TK-/gE-/gI-

重组疫苗产生的针对 PRV的抗体Vaccine   28dc 42d 63d

Neg controlNAa -d - -

ELISAb - - -

PRRS KV vaccineNA - - -

ELISA - - -

TK-/gE-/gI-

NA 17.3±9.4 38.3±22.6 32±17.5

ELISA 1280 20480 20480

rPRV-GP5m-MNA 13.4±11.6 38.4±25.7 35±11.9

ELISA 1280 20480 20480

PRRSV中和抗体检测

针对 PRRSV的细胞免疫反应

RV5m6免疫组 PBMC中特异性针对 PRRSV的淋巴细胞增殖显著高于灭活苗对照组，尤其在攻毒后 RV5m6免疫组增殖水平迅速上升，表现出记忆T细胞免疫反应。

0

0. 5

1

1. 5

2

2. 5

42 63 77

Days af ter pr i mary vacci nat i on

Stim

ulat

ion

Inde

x (S

I)

TK-/gE-/gI- PRRS KV vaccine rPRV-GP5m-M Neg Control

攻毒后体温变化

阴性对照于攻毒后体温出现明显的发热（>40℃），并且波动较大， KV免疫组出现一过性的发热，但 RV5m6 一直未出现发热。

℃

38.8

39

39.2

39.4

39.6

39.8

40

40.2

40.4

40.6

40.8

-2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Days pre- and post- challenge

TK-/gE-/gI- PRRS KV vaccine rPRV-GP5m-M Neg Control

攻毒后的病毒血症和排毒组别

攻毒后天数7 10 14 17 21

血清

TK-/gE-/gI- +++++ +++++ +++++ +++++ ++++

KV control ++++ +++++ +++++ +++++ +++

RV5m6 +++ +++++ +++ - -

Neg control +++++ +++++ +++++ +++++ ++++

鼻拭子

TK-/gE-/gI- +++ ++++ +

KV control ++ +++ -

RV5m6 ++ + -

Neg control +++ +++ ++

扁桃体拭子

TK-/gE-/gI- +++++ ++++ +++

KV control +++++ +++ ++

RV5m6 +++ - -

Neg control +++++ ++++ ++++

肺部组织病理变化

Neg control PRRSV灭活苗

重组疫苗 健康猪

肺门淋巴结病理变化

Neg control PRRSV灭活苗

重组疫苗 健康猪

 

GroupsTissue Lymph nodes

Tonsi

lLung Splee

nKidney Sternal Mesente

ricTK-/gE-/

gI-

+++++b +++++ ++++ +++ +++++ +++

PRRS KV vaccine

++ +++ +++ +++ +++++ +

rPRV-GP5m-M

- + - - +++ -

Neg control

+++++ +++++ ++++ +++ +++++ +++

攻毒后病毒分布情况

  研究表明：

以伪狂犬病毒为载体共表达修饰的GP5m 和M 蛋白的重组疫苗能够同时诱发较强的针对 PRV 和

PRRSV的免疫应答，具有较好的免疫保护，有望成为新一代安全、高效的 PRRSV新型疫苗。

临床初步应用：

免疫预防

对发病猪的紧急接种

进一步对ORF5基因进行修饰，目前已获得 18个突变体，其中对ORF5进行糖基化修饰后的突变体ORF5/34-/51-较天然的GP5产生的中和抗体高100倍。

构建伪狂犬病 -蓝耳病 -圆环病毒 -猪瘟的四价基因工程疫苗。

  正在开展的研究：

“自杀性” DNA疫苗 以甲病毒复制子为载体，自主复制，保障外源基因的高效表达； 诱导被转染细胞发生细胞凋亡，增强免疫提呈，避免常规DNA疫苗整合到宿主基因组、细胞转化等潜在的安全性隐患。

是一种更安全、更有效的新型核酸疫苗。

26s subgenomic promoterThe framework of self-replicating

DNA vaccines

26s subgenomic promoter

PRRSV“自杀性” DNA疫苗

A69

PCMV ORF5mSFV nsPspolyA

26S 26S

ORF6

pSFV-5m6

中国授权发明专利（ ZL200410000238.0 ）

DNA疫苗（18种）pCI-52

pCI-5m

pCI-ORF6

pCI-56

pCI-5m6

pCI-52/IL2

pCI-53

pCI-VP22/5m

pCI-VP22/5m6

……

自杀性DNA疫苗（4种）pSFV-52

pSFV-5m

pSFV-56

pSFV-5m6

                           SN titers TimesGroups

<1:8 1:8 1:16

pCI-neo6W - - -

8W - - -

10W - - -

pCI-ORF56W 5 0 0

8W 5 0 0

10W 5 0 0

pCI-ORF5m6W 5 0 0

8W 4 1 0

10W 1 4 0

pCI-ORF5/ORF66W 4 1 0

8W 1 4 0

10W 0 4 1

pCI-ORF5m/ORF66W 4 1 0

8W 0 5 0

10W 0 3 2

pSFV-566W 3 2 0

8W 0 4 1

10W 0 3 2

pSFV-5m66W 4 1 08W 0 3 210W 0 1 4

自杀性 DNA疫苗免疫猪后诱导的中和抗体

0

0. 5

1

1. 5

2

2. 5

3

3. 5

Groups

Stim

ulat

ed i

ndex

(SI

)

6 weeks af t er pr i maryvacci nat i on

8 weeks af t er pr i maryvacci nat i on

免疫猪后诱导的细胞免疫

pSFV-5m6/RV5m6免疫猪后 PRRSV中和抗体

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

14 28 42 63 70 73 77 80 84Days ppi

SN t

iter

(2̂

n)TK- / gE- / LacZ+KV controlRV5m6pSFV-5m6neg control

Challenge with PRRSV

pSFV-5m6 和 RV5m6免疫组于首免后 42d即可检测到中和抗体（≥ 1 ：4 ），并趋于上升。攻毒后 pSFV-5m6 和 RV5m6免疫组中和抗体水平快速上升，显著高于灭活苗对照组。

PBMC的淋巴细胞增殖

1

1. 2

1. 4

1. 6

1. 8

2

2. 2

2. 4

2. 6

42 63 77Days ppi

Stimulated index (SI)

Tk- / gE- / gI - KV control RV5m6 pSFV-5m6 neg control

pSFV-5m6 和 RV5m6免疫组 PBMC中特异性针对 PRRSV的淋巴细胞增殖显著高于灭活苗对照组，尤其在攻毒后 pSFV-5m6 和 RV5m6免疫组增殖水平迅速上升，表现出记忆T细胞免疫反应。

攻毒后体温变化

38. 2

38. 4

38. 6

38. 8

39

39. 2

39. 4

39. 6

39. 8

40

40. 2

40. 4

-2 1 4 7 10 13 16 19

Days pre- and post- exposure

TK- / gE- / gI - KV cont rol RV5m6 pSFV- 5m6 neg cont rol

所有猪只攻毒后都未表现出明显的临床症状。阴性对照于攻毒后体温出现明显的发热（>40℃），并且波动较大，而 KV免疫组出现一过性的发热，但RV5m6 与 pSFV-5m6一直未出现发热。

℃

病毒血症和排毒组别

攻毒后天数7 10 14 17 21

血清

TK-/gE-/gI- +++++ +++++ +++++ +++++ ++++

KV control ++++ +++++ +++++ +++++ +++

RV5m6 +++ +++++ +++ - -

pSFV-5m6 +++ +++ + - -

Neg control +++++ +++++ +++++ +++++ ++++

鼻拭子

TK-/gE-/gI- +++ ++++ +

KV control ++ +++ -

RV5m6 ++ + -

pSFV-5m6 + + -

Neg control +++ +++ ++

扁桃体拭子

TK-/gE-/gI- +++++ ++++ +++

KV control +++++ +++ ++

RV5m6 +++ - -

pSFV-5m6 ++ - -

Neg control +++++ ++++ ++++

本研究由国家“ 973”基础研究、国家“ 863”和国家自然科学基金资助