Полимеразная Полимеразная цепная реакцияцепная реакция

Метод, который перевернул Метод, который перевернул современную молекулярную биологиюсовременную молекулярную биологию

ИсторияИстория Искусственный синтез ДНК с использованием Искусственный синтез ДНК с использованием

праймеров был описан еще в праймеров был описан еще в 19711971 г. г. KleppeKleppe et et al.al.

В В 19831983 г. г. Kary Mullis Kary Mullis предложил метод, предложил метод, обеспечивающий накопление (амплификацию) обеспечивающий накопление (амплификацию) синтезируемого фрагмента ДНК, получивший синтезируемого фрагмента ДНК, получивший название полимеразная цепная реакция название полимеразная цепная реакция (Нобелевская премия по химии 1993 г).(Нобелевская премия по химии 1993 г).

Принцип реакции опубликован в Принцип реакции опубликован в 19851985 г г Science. 1985 Dec 20;230(4732):1350-4. Science. 1985 Dec 20;230(4732):1350-4.

Распространение метода ПЦРРаспространение метода ПЦР

Год Число публикаций1985 1

1986 3

1987 8

1988 139

1989 698

1990 2 668

1995 11 890

2000 16 430

2004 20 075

Основные достоинства ПЦРОсновные достоинства ПЦР

Высокая чувствительностьВысокая чувствительность Высокая специфичностьВысокая специфичность Проста в исполненииПроста в исполнении Нет необходимости в выделении или Нет необходимости в выделении или

сложной очистке матричной ДНКсложной очистке матричной ДНК Возможность работы с практически Возможность работы с практически

любым биологическим материаломлюбым биологическим материалом

Значение для современной науки Значение для современной науки и медицины и медицины

Решение самых различных научных задачРешение самых различных научных задач Генотипирование организмовГенотипирование организмов Диагностика инфекционных заболеванийДиагностика инфекционных заболеваний Диагностика генетических заболеваний и Диагностика генетических заболеваний и

генетической предрасположенностигенетической предрасположенности Установление родства, идентификация Установление родства, идентификация

личностиличности Анализ древних останков, криминалистикаАнализ древних останков, криминалистика Детекция ГМОДетекция ГМО

Репликация ДНК Репликация ДНК in vivoin vivo

Матричная цепь

Новая цепь

Новая цепь

I. I. Разделение цепей (денатурация)Разделение цепей (денатурация)

95°C

II. II. Отжиг праймеровОтжиг праймеровIII. III. Синтез ДНК (удлинение цепи)Синтез ДНК (удлинение цепи)

Праймер

Стадии ПЦРСтадии ПЦР

ДенатурацияДенатурация (94°C) (94°C)– Обеспечивает разделение нитей ДНКОбеспечивает разделение нитей ДНК

Гибридизация (отжиг) праймеров на матрицеГибридизация (отжиг) праймеров на матрице ( (4545-65°C)-65°C)– Формирует структуры узнаваемые ДНК-Формирует структуры узнаваемые ДНК-

полимеразойполимеразой Синтез (удлинение) цепиСинтез (удлинение) цепи (72°C) (72°C)

– Происходит синтез комплементарных цепей и Происходит синтез комплементарных цепей и удваивает число молекул ДНК мишениудваивает число молекул ДНК мишени

Схема ПЦРСхема ПЦР

Денатурация

Отжиг праймеровСинтез

1 копия(матрица)

2 копии

Продукт ПЦР

ДенатурацияОтжигСинтез

Продукты после 1-го цикла реакции

Продукты после 2-го цикла реакции

Основные принципы ПЦРОсновные принципы ПЦР

Амплификация фрагмента происходит между двумя Амплификация фрагмента происходит между двумя праймерамипраймерами

Амплификацию проводят в течение 30-40 цикловАмплификацию проводят в течение 30-40 циклов Каждый цикл состоит из смены температурных режимовКаждый цикл состоит из смены температурных режимов В реакции используют термостабильные ДНК-В реакции используют термостабильные ДНК-

полимеразыполимеразы За 30 циклов происходит умножение амплифицируемого За 30 циклов происходит умножение амплифицируемого

фрагмента ДНК в 1 000 000 000 разфрагмента ДНК в 1 000 000 000 раз Кинетика ПЦР характеризуется выходом на «плато»Кинетика ПЦР характеризуется выходом на «плато»

Основные причины выхода на Основные причины выхода на «плато»«плато»

истощение субстратов (дНТФ и праймеров)истощение субстратов (дНТФ и праймеров) падение активности реактантов (дНТФ и падение активности реактантов (дНТФ и

фермента)фермента) накопление ингибиторов, включая накопление ингибиторов, включая

пирофосфаты и ДНК-дуплексыпирофосфаты и ДНК-дуплексы конкуренция за реактанты неспецифическими конкуренция за реактанты неспецифическими

продуктами или праймер-димерамипродуктами или праймер-димерами концентрация специфического продукта и концентрация специфического продукта и

неполная денатурация при высокой неполная денатурация при высокой концентрации продуктов амплификацииконцентрации продуктов амплификации..

Компоненты реакцииКомпоненты реакции

Буфер Буфер ((Tris-HCl, pH = 8,0-8,8Tris-HCl, pH = 8,0-8,8; ; KCl)KCl) MgClMgCl2 2 (1-3 mM)(1-3 mM) ПраймерыПраймеры ( (0.4 мкМ каждого0.4 мкМ каждого)) dNTP (40-200 dNTP (40-200 мкМ каждого)мкМ каждого) ДНК-полимераза (1 ед)ДНК-полимераза (1 ед) МатрицаМатрица ( (1 до 1000 нг1 до 1000 нг))

ФерментыФерментыНекоторые характеристики ДНК-полимераз

ПолимеразыВремя

полужизни при 95С (min)

Экзонуклеазная активность 5'-3'

(+/-)

Экзонуклеазная активность 3'-5'

(+/-)

Достройка 3'-концов

Taq 40 + - А-он

Tth 20 + - A-он

Pfu 120 - + blunt ends

Vent 400 - + blunt ends

Deep Vent 1300 - + blunt ends

UlTma 50 - + blunt ends

Pwo 120 при 100С - + blunt ends

ПраймерыПраймеры Длина праймеров 18-30 нуклеотидовДлина праймеров 18-30 нуклеотидов GC-GC-состав 45-55%, близок к состав 45-55%, близок к GC-GC-составу составу

матрицыматрицы Разница в температурах отжига не более 5Разница в температурах отжига не более 5ооСС Не должны формировать шпилек на 3-концеНе должны формировать шпилек на 3-конце

Не должны формировать димеры по 3-концамНе должны формировать димеры по 3-концам

Оптимизация ПЦРОптимизация ПЦР

Температурный профиль реакции Температурный профиль реакции Временной профиль реакции Временной профиль реакции Состав реакционной смеси Состав реакционной смеси конц. ионов магнияконц. ионов магния

конц. праймеровконц. праймеровконц. полимеразыконц. полимеразыдобавки (глицерин, ДМСО, формамид, БСА и добавки (глицерин, ДМСО, формамид, БСА и

др.)др.)

Подбор температуры Подбор температуры отжигаотжига

Подбор концентрации Подбор концентрации ионов магнияионов магния

10 причин, по которым ПЦР 10 причин, по которым ПЦР может не идтиможет не идти

Плохой дизайн праймеровПлохой дизайн праймеров Неверная концентрация праймеровНеверная концентрация праймеров Слишком много dNTP или деградированные Слишком много dNTP или деградированные dNTPdNTP Не перемешанный раствор Не перемешанный раствор MgClMgCl22

Неверная концентрация Неверная концентрация MgClMgCl22

Наличие ингибиторовНаличие ингибиторов Плохое качество минерального маслаПлохое качество минерального масла Слишком много ферментаСлишком много фермента Ошибки в программе амплификатораОшибки в программе амплификатора Недостаток или избыток матрицыНедостаток или избыток матрицы

Оценка результатов реакцииОценка результатов реакции

ЭлектрофорезЭлектрофорез

Гибридизация с зондамиГибридизация с зондами

Разновидности ПЦР Разновидности ПЦР

ПЦР с «горячим» ПЦР с «горячим» стартостартомм (hot (hot--start PCR)start PCR) TouchdownTouchdown МультиплекснаяМультиплексная Гнездовая Гнездовая (nested)(nested) In situ PCRIn situ PCR Reverse transcriptase (RT-PCR)Reverse transcriptase (RT-PCR) Real-time PCR (RT-PCR)Real-time PCR (RT-PCR)

Другие методы амплификацииДругие методы амплификации

Лигазная цепная реакция (ЛЦРЛигазная цепная реакция (ЛЦР,, LCR)LCR) NASBA (nucleic acid sequence-based NASBA (nucleic acid sequence-based

amplification)amplification)

Организация технологического Организация технологического процессапроцесса

КонтаминацияКонтаминация Организация лаборатории (рабочих мест) по принципу Организация лаборатории (рабочих мест) по принципу

изолированных рабочих зонизолированных рабочих зон Раздельное использование оборудования и Раздельное использование оборудования и

принадлежностей при работе с чистыми растворами и принадлежностей при работе с чистыми растворами и растворами, содержащими ДНК или продукты ПЦРрастворами, содержащими ДНК или продукты ПЦР

Обязательная постановка в каждом эксперименте Обязательная постановка в каждом эксперименте отрицательного и положительного контролейотрицательного и положительного контролей

Стоковые растворы разделять на аликвоты и Стоковые растворы разделять на аликвоты и периодически заменятьпериодически заменять

Real-time PCRReal-time PCR

Интеркалирующие красителиИнтеркалирующие красители SYBR greenSYBR greenГибридизационные зондыГибридизационные зонды TaqmanTaqman Molecular beaconsMolecular beacons FRET probesFRET probes