НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІООРГАНІЧНОЇ ХІМІЇ ТА НАФТОХІМІЇ

На правах рукопису

Кобзар Олександр Леонідович

УДК 577.152.3:547.898:546.26.043

ПОТЕНЦІЙНІ ІНГІБІТОРИ ПРОТЕЇНТИРОЗИНФОСФАТАЗ

НА ОСНОВІ ТЕТРААЗАМАКРОЦИКЛІВ І ФУЛЕРЕНІВ

02.00.10 – біоорганічна хімія

Дисертація на здобуття наукового ступеня

кандидата хімічних наук

Науковий керівник:

чл.-кор. НАН України,

д. х. н., професор

Вовк Андрій Іванович

Київ – 2015

2

ЗМІСТ

Ст.

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ…………………………................... 5

ВСТУП…………………………………………………………………….... 8

РОЗДІЛ 1. ПРОТЕЇНТИРОЗИНФОСФАТАЗИ,

ТЕТРААЗАМАКРОЦИКЛИ І ФУЛЕРЕНИ (ОГЛЯД

ЛІТЕРАТУРИ)……………………………………………………………… 13

1.1. Протеїнтирозинфосфатази та їх роль в біологічних процесах……... 13

1.1.1. Протеїнтирозинфосфатази і механізми їх активності…………….. 13

1.1.2. Протеїнтирозинфосфатаза 1B ……………………………………… 15

1.1.3. Т-клітинна протеїнтирозинфосфатаза ………...…………………... 17

1.1.4. Протеїнтирозинфосфатаза SHP2………………………………….... 19

1.1.5. Протеїнтирозинфосфатаза CD45…………………………….……... 21

1.1.6. Внутрішньоклітинна регуляція активності та синтетичні

інгібітори протеїнтирозинфосфатаз………..……………………………... 23

1.2. Біологічна активність і застосування тетраазамакроциклів………... 25

1.2.1. Тетраазамакроцикли як біологічно активні сполуки, контрастні

та флуоресцентні агенти.………………………........................................... 25

1.2.2. Інгібітори CXCR4 на основі тетраазамакроциклів.……………….. 28

1.3. Біологічна активність похідних фулеренів………………………….. 31

1.3.1. Антивірусна і бактерицидна активність похідних фулеренів……. 31

1.3.2. Фотоактивність і антиоксидантні, цитотоксичні та антиракові

властивості похідних фулеренів…………………….……………….……. 36

1.3.3. Медико-біологічні дослідження полігідроксильованих похідних

фулерену.……………………………….…………………...……………… 38

РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ……………….…………………….. 42

2.1. Матеріали…..………………………..…………………………………. 42

2.2. Дослідження впливу похідних тетраазамакроциклів та фулеренів

3

на активність протеїнтирозинфосфатаз…………………………………... 44

2.2.1. Дослідження кінетики інгібування протеїнтирозинфосфатаз

похідними тетраазамакроциклів…...…………..…………………..……… 44

2.2.2. Дослідження кінетики інгібування протеїнтирозинфосфатаз

похідними фулеренів………………………………………………….…… 45

2.3. Кінетичні дослідження…….………………………………….………. 46

2.4. Методи розрахунків та статистичного аналізу……………………… 48

2.5. Моделювання відкритої конформації каталітичного домену CD45

та закритої конформації TC-PTP……...…………………………………... 50

2.6. Дослідження інгібіторів протеїнтирозинфосфатаз методом

молекулярного докінгу..……………………………………………..…….. 57

2.6.1. Підготовка структур лігандів та білків для докінгу…..…..………. 57

2.6.2. Моделювання ензим-інгібіторного комплексу Т-клітинної

протеїнтирозинфосфатази з N1,N

4,N

8,N

11-тетракіс{3-[1′-оксо-2′,2′-

дифтор-2′-(фосфоно)етил]бензил}-1,4,8,11-

тетраазациклотетрадеканом……………………………………………….. 58

2.6.3. Моделювання ензим-інгібіторного комплексу PTP1B та CD45 з

піролідино[60]фулерен-трис-карбоновою кислотою……………………. 61

2.6.4. Моделювання ензим-інгібіторних комплексів CD45 з похідними

фулерену С60………………………………………………………….…….. 62

2.6.5. Моделювання ензим-інгібіторних комплексів PTP1B з

полігідроксильованими фулеренами C60(OH)6-36……………...…………. 62

РОЗДІЛ 3. ТЕТРААЗАМАКРОЦИКЛИ ЯК МОЛЕКУЛЯРНА

ПЛАТФОРМА ДЛЯ КОНСТРУЮВАННЯ ІНГІБІТОРІВ

ПРОТЕЇНТИРОЗИНФОСФАТАЗ…...……………………………….…… 64

РОЗДІЛ 4. ПОХІДНІ ФУЛЕРЕНІВ ЯК НОВИЙ КЛАС ІНГІБІТОРІВ

ПРОТЕЇНТИРОЗИНФОСФАТАЗ.…………………….………………….. 78

4.1. Карбоксилатні похідні фулеренів як інгібітори

4

протеїнтирозинфосфатаз…………………………………………………... 78

4.2. Порівняння in silico інгібувальної здатності ряду похідних

фулерену С60 ………………………..……………...................................... 99

РОЗДІЛ 5. ОСОБЛИВОСТІ ВПЛИВУ ПОЛІГІДРОКСИЛЬОВАНИХ

ФУЛЕРЕНІВ НА АКТИВНІСТЬ ПРОТЕЇНТИРОЗИНФОСФАТАЗИ

1B……………………………………………………………………………. 103

ВИСНОВКИ……………………………………………………….……….. 116

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ………………….………………. 118

5

ПЕРЕЛІК УМОВНИХ ПОЗНАЧЕНЬ

PTP1B – протеїнтирозинфосфатаза 1В

TC-PTP – Т-клітинна проеїнтирозинфосфатаза

SHP2 – протеїнтирозинфосфатаза SHP2

SH2 – два Src гомологічні домени

CD45 – протеїнтирозинфосфатаза CD45, відома як загальний лейкоцитарний

антиген

TCR – рецептори, що знаходиться на поверхні Т-лімфоцитів та відповідають за

розпізнавання антигенів

BCR – рецептори, що знаходиться на поверхні B-клітин та відповідають за

розпізнавання антигенів

PTPβ – протеїнтирозинфосфатаза β

MEG1 – протеїнтирозинфосфатаза MEG1

MEG2 – протеїнтирозинфосфатаза MEG2

pTyr – фосфотирозиновий залишок

IR – інсуліновий рецептор

JAK1 – Янус-кіназа 1

JAK2 – Янус-кіназа 2

JAK3 – Янус-кіназа 3

STAT1 – білок трансдуктор і активатор транскрипції 1

STAT3 – білок трансдуктор і активатор транскрипції 3

STAT5a – білок трансдуктор і активатор транскрипції 5a

STAT5b – білок трансдуктор і активатор транскрипції 5b

TYR2 – тирозинкіназа 2

EGF – епідермальний фактор росту

EGFR – рецептор епідермального фактору росту

PDGFR – рецептор тромбоцитарного фактору росту

VEGFR-2 – рецепторний фактор росту ендотеліальних судин-2

6

IL-3 – інтерлейкін-3

IL-4 – інтерлейкін-4

IL-6 – інтерлейкін-6

AMPK – 5'АМФ-активуюча протеїнкіназа

IFN-α – інтерферон-α

IFN-γ – інтерферон-γ

CSF-1 – колонії стимулюючий фактор-1

PRLR –рецептор пролактину

Erk – позаклітинна регулююча кіназа

RSK – рибосомальна S6 кіназа

CagA – цитотоксин-асоційований ген А бактериї H. pylori

EPO – еритропоетин

SKAP55 – Src-кіназа асоційований протеїн 55 кД

PAG/Cbp – фосфопротеїни, пов’язані з GEMS/CSK-зв’язуючим протеїном

MMP-1 – матриксний металопротеїн-1

MMP-3 – матриксний металопротеїн-3

MMP-7 – матриксний металопротеїн-7

PHD3 – пролілгідролаза 3

CXC – хемокін підсімейства CXC

CXCR4 – С-Х-С-хемокіновий рецептор типу 4

CCR5 – С-С-хемокіновий рецептор типу 5

gp120 – глікопротеїн 120, що експресується на поверхні оболонки ВІЛ

SDF-1α (CXCL12) – стромальний клітинний фактор-1α (хемокін підродини

CXC, який у людини закодований геном CXCL12)

ПЕТ – позитронно-емісіонна томографія

МРТ – магнітно-резонансна томографія

uPAR – рецептор урокіназного активатора плазміногену

GRPR – рецептор гастрит-релізинг пептиду

DMSO – диметилсульфоксид

7

EDTA – етилендіамінтетраоцтова кислота

DTT – дитіотриетол

pNPP – п-нітрофенілфосфат

4-MUP – 4-метилумбеліферилфосфат

Km – константа Міхаеліса

Km´ – уявна константа Міхаеліса

Vmax – швидкість ензиматичної реакції

Vmax´ – уявна швидкість ензиматичної реакції

Ki – константа інгібування

Ki´ – константа інгібування (за неконкурентним типом)

IC50 – концентрація інгібітора, за якої ензиматична активність знижувалася на

50 %

n – коефіцієнт Хіла – показник кооперативності, що відображає мінімальну

кількість молекул інгібітора, зв’язаних з однією молекулою ензиму

∆Gdoc – розрахована енергія докінгу

M – молярна концентрація

мМ – мілімолярна концентрація

нМ – наномолярна концентрація

нм – нанометр

E – ензим

S – субстрат

I – інгібітор

EI – ензим-інгібіторний комплекс

IEI – комплекс ензим-інгібітор-інгібітор, утворений при облаштуванні

інгібітора в активний та алостеричний центр зв’язування

IES – комплекс ензим-субстрат-інгібітор, утворюється при облаштуванні

інгібітора в алостеричний центр зв’язування в той час як активний центр

зайнятий субстратом.

8

ВСТУП

Актуальність теми. Один із підходів до створення потенційних

інгібіторів протеїнтирозинфосфатаз включає ковалентну модифікацію

органічних сполук замісниками, біоізостерними стосовно залишку

фосфотирозину. Так, фосфонові кислоти, ковалентно приєднані до верхнього

вінця калікс[4]арену, виявились ефективними інгібіторами бактеріальної

протеїнтирозинфосфатази [1], а також здатні зв’язуватись в області активного

центру протеїнтирозинфосфатази 1В [2]. Використовуючи таку стратегію, як

інгібітори протеїнтирозинфосфатаз нами вперше досліджено макроциклічні

поліаміни і фулерени, функціоналізовані аніоногенними групами.

Відомо, що похідні тетраазамакроциклів виявляють бактерицидну,

антиракову та антивірусну активність [3]. Крім того, вони здатні утворювати

стійкі за фізіологічних умов комплекси з іонами металів, що важливо для

створення контрастних і радіоізотопних агентів та флуоресцентних сенсорів [4].

Водорозчинні фулеренові сполуки проявляють цитотоксичну дію на ракові

клітини та in vitro інгібують карбоангідразу, ацетилхолінестеразу і деякі інші

ензими. Антивірусна активність цих сполук пов’язана з інгібуванням вірусної

протеази та РНК-залежної ДНК-полімерази. Завдяки своїй унікальній хімічній

природі, фулерени можуть впливати на перебіг біохімічних реакцій кількома

шляхами, безпосередньо зв’язуючись з клітинними ензимами та іншими

білками, а також продукуючи або утилізуючи активні форми кисню [5].

Вивчаючи властивості похідних тетраазамакроциклів та фулеренів, ми

зосередили свою увагу на ряді людських протеїнтирозинфосфатаз (РТРаз). Ці

ензими відіграють ключову роль в механізмах клітинної сигналізації,

регулюючи процеси росту, розвитку, диференціації, міграції і апоптозу живих

клітин. Підвищена активність РТРаз може бути причиною ряду захворювань, а

інгібітори цих ензимів розглядаються як перспективні сполуки для подальших

медичних досліджень [6]. Зокрема, інгібітори РТР1В вивчаються як можливі

9

ліки від діабету 2 типу та раку. Інгібування Т-клітинної

протеїнтирозинфосфатази може сприяти лікуванню вірусних інфекцій та

ожиріння, а також може бути використано в онкології, гематології та

регенеративній медицині. Протеїнтирозинфосфатаза CD45, відома як

лейкоцитарний загальний антиген, завдяки своїй ролі в регуляції імунних

відповідей є терапевтичною мішенню для лікування IgE-опосередкованих

алергічних і автоімунних захворювань, а також для запобігання відторгнення

трансплантатів. Пригнічення гіперактивних форм протеїнтирозин-фосфатази

SHP2 могло б бути результативним для лікування пацієнтів з синдромом Нунна

та при різноманітних ракових захворюваннях. Однак, багато відомих на

сьогоднішній день інгібіторів цих ензимів не можуть бути введені в практику

через наявність побічних негативних ефектів. Тому актуальним для

біоорганічної хімії є пошук і вивчення нових ефективних і селективних

інгібіторів людських протеїнтирозинфосфатаз, в тому числі дослідження

потенційно біоактивних сполук на молекулярній платформі фулеренів і

макроциклів.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота була частиною науково-дослідних робіт ІБОНХ НАН

України за темами: 5.18.2.8 "Дослідження фізико-хімічних властивостей і

біоактивності синтетичних нанорозмірних макроциклічних об’єктів та їх

функціоналізованих похідних щодо терапевтично важливих білкових мішеней

in vitro", № держреєстрації 0112U004108; Ф53/120-2013 "Синтез похідних

циклічних поліамінів як інгібіторів протеїн-тирозинфосфатаз", №

держреєстрації 0113U005213; ЦНП 9.1-12 "Розвиток методів синтезу,

дослідження властивостей та механізмів дії нових потенційно біоактивних

сполук», № держреєстрації 0112U002657.

Мета і задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи був пошук і

встановлення закономірностей та механізмів дії потенційних інгібіторів

10

протеїн-тирозинфосфатаз на молекулярній платформі тетраазамакроциклів і

фулеренів.

Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити наступні завдання:

- з’ясувати основні закономірності і селективність інгібування

окремих протеїнтирозинфосфатаз похідними тетраазамакроциклів і фулеренів;

- встановити кінетичні закономірності і механізми інгібування ТС-

РТР бензил-α,α-дифтор-β-кетофосфонатними похідними тетраазамакроциклів;

- встановити особливості інгібувального впливу полікарбоксилатних

похідних фулеренів на активність CD45 і PTP1B;

- на основі дослідів in vitro та in silico проаналізувати інгібувальну

здатність полігідроксильованих фулеренів стосовно РТР1В та інших

протеїнтирозин-фосфатаз.

Об’єкт дослідження – синтетичні похідні тетраазамакроциклів і

фулеренів як інгібітори протеїнтирозинфосфатаз.

Предмет дослідження – інгібування людських протеїнтирозинфосфатаз

фосфонатними похідними тетраазамакроциклів і полікарбоксилатними та

іншими похідними фулеренів.

Методи дослідження – ензиматична кінетика, спектральні методи

аналізу, молекулярний докінг, теоретичні розрахунки.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше продемонстровано

можливість використання тетраазамакроциклів як молекулярної платформи для

конструювання фосфонатних інгібіторів протеїнтирозинфосфатаз. Встановлено,

що активність таких інгібіторів визначається природою замісників і структурою

макроциклічної платформи. Знайдено, що тетракіс-заміщений циклам, що

вміщує чотири бензил-α,α-дифтор-β-кетофосфонатні групи, є сильним і

селективним інгібітором Т-клітинної протеїнтирозинфосфатази. На основі

проведених кінетичних досліджень та результатів молекулярного докінгу

обґрунтовано конкурентний стосовно субстрату механізм інгібування. Вивчено

залежність між структурою ряду водорозчинних похідних фулерену та їх

11

активністю як інгібіторів РТРаз. Вперше з’ясовано, що фулерени,

функціоналізовані карбоксильними групами, можуть бути ефективними і

селективними інгібіторами протеїнтирозин-фосфатази CD45. Показано, що

вплив цих сполук на активність ензиму описується механізмом змішаного типу.

Знайдено, що полігідроксильовані фулерени здатні ефективно інгібувати

РТР1В та СD45. За результатами комп’ютерних розрахунків виявлено

залежність енергії докінгу фулеренолів в активний та алостеричний центри

PTP1B від ступеня гідроксилювання фулеренового ядра.

Практичне значення одержаних результатів. Запропоновано і

розроблено нові ідеї, що можуть бути враховані при обґрунтуванні механізмів

фізіологічної активності відомих похідних тетраазамакроциклів і фулеренів в

живих організмах. Результати дисертаційної роботи є важливими для

конструювання нових інгібіторів протеїнтирозинфосфатаз, що можуть бути

використані для з’ясування механізмів внутрішньоклітинних біохімічних

перетворень і створення потенційних лікарських засобів.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом проведено огляд даних

літератури, повністю виконано експериментальну частину роботи, а також

здійснено обробку результатів кінетичних та комп’ютерних досліджень. Всі

публікації оформлено за безпосередньою участю дисертанта. Планування

досліджень та обговорення їх результатів проводилось спільно з науковим

керівником – чл. кор. НАН України А.І. Вовком. Окремі етапи роботи

обговорювались з к.х.н. В.Ю. Танчуком та м.н.с. В.В. Трушом. Моделювання

необхідних конформацій ензимів та ензим-інгібіторних комплексів виконано

дисертантом у співпраці з к.х.н. В.Ю. Танчуком. Дисертант висловлює щиру

подяку всім співавторам робіт за їх вклад у підготовку друкованих праць.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи були представлені

на наукових конференціях ІБОНХ НАН України (Київ, 2013 р. та 2014 р.);

міжнародній міждисциплінарній науковій конференції «Біологічно активні

речовини і матеріали: фундаментальні та прикладні питання отримання та

12

застосування (Новий світ, 2013 р.); ІІ міжнародній науково-практичній

конференції «Координаційні сполуки: синтез і властивості» (Ніжин, 2013);

ХХІІІ Українській конференції з органічної хімії (Чернівці, 2013 р.); XI

Українському біохімічному конгресі (Київ, 2014 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 статей у фахових

наукових журналах, 1 статтю в колективній монографії і тези 4 доповідей.

Структура та об’єм роботи. Дисертаційна робота складається зі вступу,

огляду літератури, експериментальної частини, викладу отриманих результатів

та їх обговорення, висновку і списку посилань на літературні джерела (373

найменувань). Дисертаційна робота викладена на 162 сторінках друкованого

тексту, проілюстрована 14 таблицями, 45 рисунками та 4 схемами.

13

РОЗДІЛ 1

ПРОТЕЇНТИРОЗИНФОСФАТАЗИ, ТЕТРААЗАМАКРОЦИКЛИ

І ФУЛЕРЕНИ (ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ)

1.1. ПРОТЕЇНТИРОЗИНФОСФАТАЗИ ТА ЇХ РОЛЬ В БІОЛОГІЧНИХ

ПРОЦЕСАХ

1.1.1. ПРОТЕЇНТИРОЗИНФОСФАТАЗИ І МЕХАНІЗМИ ЇХ АКТИВНОСТІ

Відомо, що людський геном кодує 107 протеїнтирозинфосфатаз (РТРаз), з

яких 38 належить до групи класичних тирозин-специфічних РТРаз (рис.1.1.1).

Ці ензими, в залежності від локалізації в клітині, поділяються на дві підгрупи –

17 нерецепторних (або цитоплазматичних) та 21 рецепторних (або

трансмембранних) РТРаз [7]. Вони відіграють важливу роль в механізмах

сигнальних процесів живих клітин і можуть впливати на їх ріст, розвиток,

диференціацію, міграцію і апоптоз. Проте їх підвищена активність може

викликати розвиток ряду захворювань, включаючи рак, цукровий діабет 2 типу,

автоімунні та інші порушення [8]. Тому РТРази розглядаються як клас

потенційних терапевтичних мішеней, а їх інгібітори, всебічно вивчені

експериментальним шляхом, можуть стати перспективними ліками [8-10].

Протеїнтирозинфосфатази каталізують реакцію дефосфорилювання

амінокислотних залишків фосфотирозину у внутрішньоклітинних і

рецепторних білках, регулюючи таким чином трансдукцію клітинних сигналів

[11]. Механізм каталітичної реакції дефосфорилювання є подібним для цих

ензимів і протікає за наведеною нижче схемою (рис. 1.1.2). Зв’язування

субстрату в активному центрі РТРази ініціює конформаційні зміни, що

пов’язані в першу чергу з рухом WPD-петлі. При цьому відбувається

наближення консервативного залишку Asp цієї петлі до фосфоестерного зв’язку

14

субстрату. Гідрофобний контакт між фенілаланіном WPD-петлі та фенільним

кільцем фосфотирозинового фрагменту стабілізує закриту конформацію

ензиму, а бічний ланцюг залишку Arg фосфатазної петлі переорієнтовується

для стабілізації положення субстрату [12]. Після цього іонізований атом сірки

консервативного залишку цистеїну PTP-петлі атакує атом фосфору, в результаті

чого відбувається розрив О-Р-зв'язку та формування ковалентного інтермедіату

E-PO32-

(PDB код для цього перехідного стану 1A5Y) [13]. Аспарагінова

кислота, діючи як загальна кислота, протонує кисень фенольного фрагменту,

що відходить з активного центру [14, 15], причому розрив О-Р-зв’язку та стадія

протонування відбувається одночасно. Після цього аспартат, діючи як загальна

основа, активує молекулу води, що її утримує Glu [13], та полегшує

нуклеофільну атаку на атом фосфору інтермедіату. Після вивільнення

неорганічного фосфату з активного центру тіольна група залишку Cys у

депротонованому стані стабілізується за рахунок взаємодії з залишками Ser або

Thr (в залежності від ензиму) [12, 15].

Рис. 1.1.1. Схематичне зображення структур нерецепторних (non-

transmembrane) та рецепторних (receptor-like) РТРаз [16].

15

Рис. 1.1.2. Загальна схема механізму каталітичної активності

протеїнтирозинфосфатаз.

1.1.2. ПРОТЕЇНТИРОЗИНФОСФАТАЗА 1B

Нерецепторна протеїнтирозинфосфатаз 1В (РТР1В) є внутрішньо-

клітинним ензимом, що зв’язаний з мікросомальними мембранами ендо-

плазматичного ретикулуму через С-термінальні амінокислотні залишки, а його

фосфатазний домен розміщується у цитоплазмі [17]. С-термінальна частина не

тільки відповідає за локалізацію ензиму, але й частково залучена до

каталітичних перетворень субстрату [18]. Структурно РТР1В представлена

16

одним доменом, на дні каталітичної впадини якого розміщується каталітичний

центр (рис. 1.1.3) [19].

Рис. 1.1.3. Структура каталітичного домену РТР1B (PDB код кристалу 2HNP) з

позначенням петель [16].

РТР1В розглядається як один з ключових ензимів регуляції інсулінової

сигналізації та інсуліноподібного фактору росту-1 [20]. Внутрішньоклітинною

мішенню цього ензиму є фосфотирозиновий залишок інсулінового рецептора

(IR), дефосфорилювання якого зменшує спорідненість клітин до інсуліну і

може сприяти розвитку цукрового діабету 2 типу [21, 22]. Дослідження

свідчать, що миші з ослабленою активністю РТР1В залишаються чутливими до

інсуліну і є стійкими до ожиріння за умов дієти з високим вмістом жиру [23].

Негативну роль РТР1В в розвитку ожиріння пов’язують з дефосфорилюванням

Янус-кінази 2 (JAK2), що приводить до блокування трансдукції сигналу через

шлях JAK2/STAT3 [24, 25]. Відзначається, що мішенню ензиму також можуть

17

бути сигнальний білок-трансдуктор і активатор транскрипції 3 (STAT3) [26] та

тирозинкіназа 2 (TYR2) [27]. Обговорюються також дані про можливість

залучення PTP1B до регуляції рецептора епідермального та тромбоцитарного

факторів росту (EGFR та PDGFR) [28, 29].

В залежності від внутрішньоклітинного субстрату, що задіяний в

сигнальних шляхах, та виду клітин РТР1В може бути промоутером або

супресором розвитку ракових захворювань [30]. Так, цей ензим інгібує neu-

залежний онкогенез, що показано на TM-трансформованих клітинах [31]. З

іншого боку, PTP1B негативно регулює IL-4/JAK/STAT6 сигнальний шлях, що

важливий для антиракової стійкості [32]. До того ж, надлишкова експресія

РТР1В відмічається при ракових гінекологічних захворюваннях [33, 34].

Таким чином, через негативну роль в контролі інсулінової та лептинової

сигналізації, а також через участь у промотуванні онкогенезу РТР1В є

визнаною терапевтичною мішенню для лікування цукрового діабету 2 типу,

ожиріння і ракових захворювань [35-37].

1.1.3. Т-КЛІТИННА ПРОТЕЇНТИРОЗИНФОСФАТАЗА

Т-клітинна протеїнтирозинфосфатаза (TC-PTP) належить до ензимів

нерецепторного типу. Дві ізоформи TC-PTP на 48 кДа та 45 кДа розміщуються

на ендоплазматичному ретикулумі та в ядрі клітини, відповідно. Як і у випадку

РТР1В, внутрішньоклітинна локалізація ензиму визначається С-термінальною

амінокислотною послідовністю [38]. Однак, деякі стресові фактори, що

приводять до активації протеїнкіназ, зокрема 5'АМФ-активуючої протеїнкінази

(AMPK) та епідермального фактору росту (EGF), можуть викликати

накопичення ядерної форми TC-PTP в цитоплазмі клітини [39, 40]. За даними

Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) [41], TС-РТР є структурно подібною

до РТР1В з 69% ідентичності в амінокислотній послідовності (PDB коди 1L8K

та 1NL9, відповідно). Однак, в роботі [42] зазначено, що положення Lys122 в

18

основному ланцюзі TC-PTP відхилено від положення відповідного Lys120 в

основному ланцюзі РТР1В на 6 Å, що може бути використано для дизайну

селективних інгібіторів. Автори зазначеної вище роботи не виключають, що

саме таке положення Lys122 є результатом процесу кристалізації. Проте аналіз

98 конформацій РТР1В показав, що рухливість петлі Lys 110-120 є обмеженою

та не перевищує 3 Å [43].

Дослідження свідчать, що TC-PTP є негативним регулятором запальних

процесів. Гомозиготні миші з нокаутованим геном цього ензиму мають дефекти

в кістковому мозку, порушений лімфопоез та еритропоез, відхилення в

функціях Т- та В-клітин, а також системні запальні захворювання, що неминуче

призводить до їх смерті на 3-5 тиждень після народження [44, 45]. Виявлено,

що порушення в лімфопоезі асоціюється з абнормальною секрецію

інтерферону-γ (IFN-γ) [46], а можливість TC-PTP дефосфорилювати залишки

pTyr в структурі колонії стимулюючого фактору-1 (CSF-1) – з розвитком

запальних захворювань [47]. Ядерна форма TC-PTP може дефосфорилювати

ядерні STAT1 [48], STAT3 [49], STAT5a та STAT5b [50]. Цитоплазматична

форма ензиму більш схильна дефосфорилювати β-субодиницю IR [51, 52],

JAK1 та JAK3 [53], а також негативно регулювати активність PDGFR-β [54],

рецепторного фактора росту ендотеліальних судин-2 (VEGFR-2), EGFR та

адаптерного протеїну р52Shc

[40].

Хоча експериментальні дослідження продемонстрували важливість TC-

PTP для нормального розвитку і функціонування організму, проте інгібування

цього ензиму все ж таки має сенс. Це підтверджено дослідженням TC-PTP+/-

мишей, які характеризувалися нормальним розвитком без відхилень [55].

Здатність TC-PTP–дефіцитної строми продукувати проінфламаторні і

інфламаторні цитокіни може бути перспективною стратегією для лікування

ранньої B-клітинної лейкемії, вірусних інфекцій та онкологічних захворювань

[46, 55]. Підвищений рівень ензиму може бути асоційований зі стійкістю клітин

до лептину [56] та В-лімфомою [57]. Однак, інші дані свідчать, що понижена

19

активність ензиму може бути пов’язана з розвитком лімфобластомної лейкемії

[58] та раку грудей [59]. Дослідження геномних асоціацій продемонстрували,

що T-клітинна протеїнтирозинфосфатаза пов’язана з розвитком діабету 1 типу,

хворобою Крона і ревматоїдним артритом [60, 61].

1.1.4. ПРОТЕЇНТИРОЗИНФОСФАТАЗА SHP2

SHP2 належить до нерецепторної групи протеїнтирозинфосфатаз. В

залежності від локалізації виділяють цитоплазматичний, нуклеарний і

мітохондріальний тип цього ензиму (рис.1.1.4). Відзначається можливість

переміщення SHP2 у комплексі з сигнальними білками між цитоплазмою та

ядром клітини [62]. Структурно SHP2 вміщує два Src гомологічні домени (SH2)

та один РТРазний домен [63].

Рис. 1.1.4. Функції SHP2 в різних клітинних компартментах [64]

20

SHP2 є важливою протеїнтирозинфосфатазою, що залучена до регуляції

різноманітних клітинних сигнальних шляхів. Ензим відіграє позитивну роль в

пролактин-сигнальній активації промоутера β-казеїну. При цьому утворюється

тримерний комплекс PRLR-JAK2-SHP2 для трансдукції сигналу, що

характеризується ліганд-залежним формуванням [65]. С-термінальна частина

пролактинового рецептора (PRLR) зв’язується з N-термінальним SH2 доменом

ензиму [66], тоді як JAK2 (чи JAK1) взаємодіє з амінокислотних залишками

лінкерної області між Src гомологічним та фосфатазним доменами SHP2. В

цьому тримерному комплексі відбувається кіназне фосфорилювання двох

тирозинових залишків в структурі SHP2 домену [67]. Фосфорилювання ензиму

також помічено і при інших внутрішньоклітинних сигнальних процесах [68].

Фосфатазний домен SHP2 виконує певні функції, що позитивно впливають на

JAK2/STAT5 трансдукцію сигналу [69]. Ензим формує стійкий комплекс зі

STAT5, що транспортується в ядро, де утворює потрійний комплекс з ДНК та

регулює генну транскрипцію [62]. Показано, що STAT5 є субстратом для SHP2

[70]. Подібний механізм можливий під час перебігу сигнальних процесів через

gp130 субодиницю інтерлейкіну-6 (IL-6) для індукції гену плазматичних білків

гострої фази запалення [71]. Варто відзначити, що SHP2 in vivo регулює

активність Src-кіназ за некаталітичним механізмом, тоді як in vitro ці кінази є

субстратами для ензиму [72].

Геномні мутації PTPN11, що забезпечують продукування гіперактивних

форм SHP2, асоційовані з розвитком ракових захворювань, особливо з

нейробластомою [73]. Підвищена активність ензиму є загальним фенотипом

різних видів лейкемії, асоційованих з проліфераційним потенціалом лейкозних

бластів [74], відіграє одну з основних ролей у розвитку раку грудей [75, 76], а

також відзначається у пацієнтів з синдромом Нунна [77] та у мієлоїдних

клітинах пацієнтів з синдромом Костмана [78]. На противагу цьому, SHP2

проявляє інгібувальну дію на розвиток гепатоцелюлярної карциноми [79].

Ензим може бути втягнутий до механізмів туморогенезу та метастазів, оскільки

21

регулює клітинну міграцію та фокальну адгезію [80], а також є посередником в

активації позаклітинної регулюючої кінази (Erk) у відповідь на стимул EGF,

імовірно, через дефосфорилювання р90 рибосомальної S6 кінази (RSK) [81].

Вірулентний фактор H. pylori CagA здатен асоціюватися з SH2 доменом ензиму,

фіксуючи таким чином його в активній формі, що може привести до розвитку

раку шлунку [82, 83]. Підвищення активності ядерної SHP2 пов’язують з

перетворенням парафіброміну в тирозин-дефосфорильовану форму, що може

утворювати стійкий онкогенний комплекс з β-катеніном [84].

1.1.5. ПРОТЕЇНТИРОЗИНФОСФАТАЗА CD45

Протеїнтирозинфосфатаза CD45, відома як лейкоцитарний загальний

антиген, є трансмембранним глікопротеїном, знайденим в мембранах

практично всіх гемопоетичних клітин, за виключенням зрілих еритроцитів та їх

найближчих попередників [85]. Цей ензим є одним з найбільш поширених

клітинно-поверхневих глікопротеїнів лімфоцитів, за винятком макрофагів і

гранулоцитів [86]. В залежності від функцій розрізняють кілька ізоформ CD45,

що формуються в результаті клітинно-специфічного альтернативного

сплайсингу [85]. Як і багато інших протеїнтирозинфосфатаз рецепторного типу,

CD45 складається з позаклітинної рецепторної області, короткого

трансмембранного сегмента і цитоплазматичної області, що включає

фосфатазний доменний тандем (рис.1.1.5) [87]. Довжина позаклітинного

сегмента варіює серед ізоформ. Цитоплазматична область складається з двох

доменів, серед яких мембранно-проксимальний (D1) з каталітичним Cys828

відповідає за активність ензиму [88, 89]. Іншому домену, мембранно-

дистальному (D2), відводять регулюючу функцію.

Дослідження показали, що CD45 належить важлива роль в антиген-

стимульованій проліферації Т-лімфоцитів і розвитку тимусу [90, 91]. Отримано

також дані про роль цього ензиму як активатора В-клітин [91-93]. Механізм

22

впливу CD45 на формування імунної відповіді включає дефосфорилювання

сигнальних молекул сім’ї Src кіназ (р56Lck

и р59Fyn

) і, як наслідок, регуляцію

TCR- та BCR-залежних сигнальних шляхів [87, 94-96]. Дефосфорилювання

р56Lck

(по Tyr505) і р59Fyn

(по Tyr531) та їх автофосфорилювання по Tyr394 і

Tyr420, відповідно, необхідно для активації кіназної активності цих білків [97,

98]. CD45, регулюючи стан фосфорильованості Tyr394, також контролює

онкогенну трансформацію р56Lck

[99]. Ензим може бути втягнутий в регуляцію

JAK/STAT сигнальних шляхів у відповідь на такі цитокіни як IL-3, IL-4, EPO та

IFN-α [100]. Крім того, субстратами CD45 також можуть бути SKAP55 та

PAG/Cbp [101, 102].

Рис. 1.1.5. Структура CD45. Ензим представлений у вигляді множинних

ізоформ, що формуються в результаті альтернативного сплайсингу трьох

екзонів (A, B і C) [87].

23

Завдяки своїй ролі в регуляції імунної відповіді, загальний

лейкоцитарний антиген представляє інтерес як терапевтична мішень для

лікування IgE-опосередкованих алергічних [103] і автоімунних захворювань

[104-106], а також для запобігання відторгнення трансплантату [107-109].

1.1.6. ВНУТРІШНЬОКЛІТИННА РЕГУЛЯЦІЯ АКТИВНОСТІ ТА

СИНТЕТИЧНІ ІНГІБІТОРИ ПРОТЕЇНТИРОЗИНФОСФАТАЗ

Регуляція активності протеїнтирозинфосфатаз та інших білків

відбувається на рівні транскрипції, трансляції та пострансляційної модифікації.

Після проходження цих процесів активність білка регулюється передусім

внутрішньоклітинною локалізацією та зв’язуванням з мембраною клітини або

ендоплазматичним ретикулумом, що обмежує доступ РТРаз до потенційних

субстратів [38, 110]. Окиснення цистеїну в активному центрі ензиму з

утворенням неактивного інтермедіату – сульфенової кислоти [111] з подальшим

незворотним перетворенням її в сульфенамід є одним з механізмів регуляції

активності РТРаз, що показано на прикладі РТР1В [112]. Цей процес

відбувається за участю пероксидів, які накопичуються в клітині у відповідь на

стимуляцію клітинних процесів інсуліном, епідермальним фактором росту та

іншими цитокінами (рис. 1.1.6) [113-115]. Для SHP2 характерна

внутрішньомолекулярна регуляція її активності, коли N-термінальний SH2

домен блокує фосфатазний центр ензиму [63]. В такому разі, перехід ензиму в

активну конформацію відбувається за рахунок зв’язування субстрату чи

фосфорилювання тирозинових залишків в структурі SHP2 домену [63, 68].

Регуляція активності рецепторних протеїнтирозинфосфатаз, як показано на

прикладі RPTPα та RPTPδ, може відбуватися за участю N-термінального клину

[116, 117]. Проте, розуміння цього механізму є недостатнім для пояснення

регулювання активності CD45 [89].

24

Рис. 1.1.6. Оборотне окиснення-відновлення каталітичного залишку

цистеїну протеїнтирозинфосфатаз в процесі внутрішньоклітинної регуляції

[118]

Порушення в зазначених та інших регуляційних процесах може

приводити до надмірної активності РТРаз і, як показано вище, спричинити

різноманітні захворювання, що свідчить про практичну цінність інгібіторів цих

ензимів як потенційних лікарських засобів. На сьогодні запропоновано ряд

інгібіторів PTP1B, серед яких є похідні фосфонових [119-121], карбонових

[122-125], сульфонових кислот [126], а також деякі гетероциклічні сполуки

[127-132]. Однак, через значну гомологічність цього ензиму з ТС-РТР,

більшість з зазначених інгібіторів може також сильно пригнічувати активність

T-клітинної протеїнтирозинфосфатази, для якої на сьогодні знайдено лише

декілька селективних інгібіторів [133-135]. Як інгібітори СD45 вивчено 9,10-

фенантрендіони [136], нафтилхінонові похідні [137] і заміщені бензімідазоли

25

[138]. Як інгібітори SHP2 запропоновано похідні карбонових [139],

сульфонових кислот [140], оксіндолу [141] і саліцилової кислоти [142].

Практичне використання стосується таутоміцетину, що є інгібітором SHP2, як

імуносупресора при трансплантації органів [143], та стибоглюконату натрію

(лікарського засобу від лейшманіозу), що здатен інгібувати SHP1, SHP2 і

PTP1B [144]. Перспективною для лікування ожиріння є структура MSI-1436, що

здатна інгібувати РТР1В [145]. Однак, безліч з вище зазначених сполук досі не

введені в практику через наявність ряду побічних ефектів.

1.2. БІОЛОГІЧНА АКТИВНІСТЬ І ЗАСТОСУВАННЯ

ТЕТРААЗАМАКРОЦИКЛІВ

1.2.1. ТЕТРААЗАМАКРОЦИКЛИ ЯК БІОЛОГІЧНО АКТИВНІ СПОЛУКИ,

КОНТРАСТНІ ТА ФЛУОРЕСЦЕНТНІ АГЕНТИ

Серед похідних тетраазамакроциклів знайдено сполуки, що здатні

інгібувати активність пролілгідролази 3 (PHD3) [146], натрієвих каналів [147]

та ріст ракових клітин (сполуки 1.1-1.3) [148, 149], зокрема, шляхом

виснаження внутрішньоклітинного рівня АТФ [150]. Кон’югат циклам-триазол-

меримастат 1.4 продемонстрував гіршу активність проти матриксного

металопротеїну-1 (MMP-1) та MMP-3 у порівнянні з нефункціоналізованим

меримастатом, однак властивість тетраазамакроциклічної платформи зв’язувати

катіони металів може бути використана для детекції локалізації зазначених

ензимів в організмі [151].

26

Дослідження металокомплексів цикламу свідчать, що ці сполуки здатні

зв’язуватися з ДНК та викликають її фрагментацію [152, 153], проявляють

гідролазну, катехолазну, антигрибкову та антимікробну активність [154, 155], а

також інгібують β-глюкуронідазу та мають слабкий цитотоксичний ефект [156,

157].

На основі тетраазамакроциклів конструюють радіоімунодіагностичні та

радіоімунотерапевтичні агенти для медицини, а також флуоресцентні сенсори.

Серед комплексів похідних тетраазамакроциклів з 99m

Tc [158-160] сполуки 1.5

та 1.6 можуть бути використані для ПЕТ діагностики ракових захворювань

[161, 162]. 99m

Tc-металокомплексні похідні цикламу 1.7, 1.8 та 1.9 дозволяють

детектувати порушення в активності гіпоксії-індукованого фактору,

надекспресію CD4/T4 рецепторів та проліфераційну активність ракових клітин,

відповідно [163-165].

27

Металокомплекси на основі тетраазамакроциклів та іонів міді (ІІ) є

стабільними за фізіологічних умов [166-168], і можуть бути використані при

ПЕТ діагностиці раку [169-173], метастазів [174-178] та васкулогенезу

(фундаментального процесу пухлинної прогресії) [179]. Крім того, комплекси

тетраазамакроциклів з 64/67

Cu виявились не тільки радіоімунодіагностичними,

але й потенційними радіоімунотерапевтичними засобами, так як при

одноразовому введені здатні знищувати невеликі пухлини без істотної

токсичності для нормальних клітин [180]. На основі Cu-тетраазамакроциклів

синтезовано кон'югати, специфічні до рецептора соматостатину [181, 182],

рецептора урокіназного активатора плазміногену (uPAR) [183], рецептора

гастрит-релізинг пептиду (GRPR) [184], а також хемокінового рецептора 4 [185-

187].

МРТ-агенти тетраазамакроциклів (в основному похідні циклену) націлені

на комплекс фібрин-фібронектин, транспортний білок глутаміну, молекули

нейронної адгезії, β-галактозидазу та MMP-7 [188, 189].

Флуоресцентні сенсори на основі тетраазамакроциклів дозволяють

специфічно детектувати деякі катіони металів як in vitro, так і in vivo. Так,

сполука 1.10 здатна формувати стабільний комплекс з іоном міді (ІІ) зі значною

селективністю порівняно з катіонами цинку (ІІ) та інших металів [190]. В

присутності Zn2+

спостерігається підняття, а в присутності Hg2+

та Cu2+

–

гасіння флуоресценції пуринової похідної цикламу 1.11 [191]. Проте сполука

1.12, з 7-нітробензо-2-окса-1,3-діазоліловим замісником в протилежному до

пурину положенні демонструвала зростання флюоресценції у випадку

комплексоутворення з Hg2+

[192]. Інша похідна 1.13 також є селективним

сенсором для катіону меркурія [193]. На основі цикламу (сполуки 1.14 та 1.15)

28

розроблено селективні сенсори на іони Zn (II) та показано можливість їх

застосування для детектування його рівня в апоптичних клітинах [194-196].

1.2.2. ІНГІБІТОРИ CXCR4 НА ОСНОВІ ТЕТРААЗАМАКРОЦИКЛІВ

Хемокіновий рецептор CXCR4 є важливою терапевтичною мішенню в

лікуванні вірусної інфекції імунодефіциту людини (ВІЛ) [197], мобілізації

гемопоетичних стовбурових клітин та кровотвірних клітин попередників [198],

а також для діагностики і лікування ракових захворювань та метастазів [199,

200]. Саме на основі тетраазамакроциклів синтезовано ряд похідних, що

виявляють високу селективність та антагоністичну ефективність до цього

рецептора.

Димеризація тетраазамакроциклів та їх комплексоутворення з металами

сильно змінює інгібуючу активність проти ВІЛ та цитотоксичність [201]. Так,

похідні 1,4,8,11-тетраазатетрадекану (цикламу), в яких два цикламні кільця

з’єднані через різні лінкери та різним чином (N,N´- та С,С´-зв’язані

біоциклами), виявилися ефективними проти ВІЛ-1 та ВІЛ-2. Зокрема, сполуки

1.16 (JM1657) та 1.17 (JM2763) продемонстрували значення ІС50 в діапазоні

29

0,14-1,4 мкМ. При цьому не модифікований циклам виявився малоефективним

проти ВІЛ. Встановлено, що антивірусна активність біцикламів пов’язана з

блокуванням процесу інфікування вірусною частинкою після її адсорбції на

клітинній мембрані та перед зворотною транскрипцією вірусної РНК [202].

Сполука 1.18 (AMD3100; плеріксафор), в структурі якої два цикламні

кільця зв’язані один з одним через 1,4-фенілен-біс-метиленовий місток, інгібує

реплікацію ВІЛ-1 та ВІЛ-2 при концентрації EC50 1-10 нг/мл в MT-4 клітинах,

що в 100 разів нижча від концентрації, необхідної для сполуки 1.17, та в

100000-разів нижча за цитотоксичну концентрацію (>500 мкг/мл). Крім того,

сполука 1.18 інгібує утворення синцитія вірусної частинки з клітиною при

коцентрації 1-2 мкг/мл [203, 204]. Зазначені біциклами, зокрема сполука 1.18,

також інгібують активність котячого вірусу імунодефіциту, що вказує на

аналогічність його механізму запису в клітину з записом ВІЛ [205, 206]. В

присутності Zn (ІІ) в концентрації 0,2-0,6 мМ покращується ефективність

сполуки 1.18 як інгібітора ВІЛ [207], проте у випадку оксованадія (IV) її

активність знижується [208].

Сполука 1.18 має краще значення EC50, ніж похідна 1.19 та її

металокомплекс. Вочевидь це пов’язано з наявністю трьох фрагментів

вторинних амінів в структурі 1.18, а отже більшою рухливістю цієї сполуки, що

забезпечує знаходження нею найвигіднішої конфігурації для взаємодії з

рецептором [209]. Сполука 1.20 (AMD3465) показала кращу спорідненість до

хемокінового рецептора та практично аналогічну активність проти ВІЛ у

30

порівнянні з похідною 1.18. Це порушило раніше встановлену концепцію про

необхідність двох цикламних кілець в структурі антагоніста корецептора

CXCR4 [210]. N-пирідинілметилциклам, аналог сполуки 1.21 (AMD3451),

здатен зв’язуватися як з CXCR4 так і з CCR5-рецептором, блокуючи таким

чином запис ВІЛ в Т-лейкоцити за цими двома основними шляхами

інфікування [211].

Аналіз мутантних форм білка gp120 та CXCR4 вказує на їх залученість до

антивірусної активності біцикламів, зокрема таких сполук як 1.17 та 1.18 [207,

212-216]. Блокування взаємодії хемокінового рецептора 4 з моно-клональним

антитілом 12G5 та стромальним клітинним фактором SDF-1α (CXCL12)

свідчить про зв’язування сполуки 1.18 саме з цим рецепторним білком. При

цьому відсутній вплив на сигнальний шлях через CCR5 [217]. Дослідження

молекулярної взаємодії похідних цикламу з CXCR4 продемонструвало

важливість карбоксильних груп Asp171, Asp262 та Glu288 [218-220]. Підвищена

активність металокомлексів 1.18 обумовлена кращим зв’язуванням за рахунок

утворення водневого зв’язку між катіоном металу та карбоксилатною групою

Asp262 [221]. Сполука 1.20 зв’язується з CXCR4 подібно до 1.18, при цьому

цикламне кільце займає область Asp171, а N-піридинілметиленовий фрагмент,

міметик іншого цикламного кільця, зв’язується в області His113, Asp262,

His281 та Glu288 [222, 223].

При клінічних випробуваннях сполуки 1.18 як анти-ВІЛ препарату на

добровольцях було виявлено ряд незначних побічних ефектів, одним з яких був

дозозалежний лейкоцитоз, що, очевидно, пов’язано з блокування CXCR4 [224].

Подальші дослідження показали, що блокування сигнального шляху

CXCR4/SDF-1α спричиняє мобілізацію гемопоетичних стовбурових

31

клітин [225]. На сьогодні ця активність препарату плеріксафор (Mozobil®), в

основі якого похідна 1.18 в комплексі з гранулоцитарним колонії стимулюючим

фактором (G-CSF) використовується для лікування пацієнтів з лімфомою та

іншими раковими захворюваннями [226-228].

1.3. БІОЛОГІЧНА АКТИВНІСТЬ ПОХІДНИХ ФУЛЕРЕНІВ

Фулерени, як третя алотропна модифікація вуглецю, були відкриті в 1985

році англо-американською групою вчених [229], і це відкриття в 1996 році було

відзначено Нобелівською премією з хімії [230]. Ці сполуки представляють

собою замкнену сферичну структуру, яка складається з пентагональних і

гексагональних правильних призм, сформованих атомами вуглецю [229, 231].

На сьогодні, коли з часу відкриття цих нанорозмірних структур минуло 30

років, накопичено багато даних про їх біологічні властивості [232-236]. Вони

виявляють активність проти деяких вірусів, бактерій і ракових клітин та

інгібують ряд терапевтично важливих ензимів. Механізми регуляції

біологічних процесів за наявності похідних фулеренів можуть бути різними,

включаючи в тому числі: а) блокування активності природних біополімерів

завдяки нековалентним взаємодіям; б) продукування, в першу чергу за умов

фотосенсибілізації, активних форм кисню (АФК), таких як супероксидний

радикал та синглетний кисень, що чинять деструкційний вплив на білкові,

ліпідні, вуглеводні та нуклеїнові структури живої клітини; в) утилізація

вільнорадикальних продуктів.

1.3.1. АНТИВІРУСНА І БАКТЕРИЦИДНА АКТИВНІСТЬ ПОХІДНИХ

ФУЛЕРЕНІВ

В 1993 році Фрідман з колегами вперше показали, що фулерен C60 може

ефективно інгібувати протеазу вірусу імунодефіциту людини першого типу

32

(ВІЛ-1) [237]. Цей ензим здійснює протеолітичне розщеплення поліпротеїнових

попередників, що кодують структурні протеїни та ензими ретровірусу.

Протеолітична активність протеази ВІЛ-1 необхідна для продукування зрілих,

інфекційно спроможних вібріонів, і тому вона є найпривабливішою мішенню

для терапії вірусного захворювання [238]. Попередні комп’ютерні розрахунки з

C60 показали, що саме гідрофобні взаємодії фулеренового ядра з гідрофобною

поверхнею активного центру ВІЛ-1 протеази можуть забезпечити стабілізацію

ензим-інгібіторного комплексу. Експеримент in vitro з водорозчинною

похідною біс-фенетиламіносукцинатом С60 (сполука 1.22) продемонстрував, що

похідна фулерену є конкурентним інгібітором ВІЛ-1 протеази зі значенням

константи інгібування (Ki) 5,3 мкМ [237]. Це була перша робота, в якій

теоретично та практично обґрунтовано антивірусну ефективність похідних

фулеренів. Подальші дослідження відзначили ефективність сполуки 1.22 проти

ВІЛ-2 та її здатність інгібувати ВІЛ-1 зворотну транскриптазу і ДНК-

полімеразу альфа майже з однаковою ефективністю [239].

Пошук поміж похідних фулерену C60 інгібіторів ВІЛ-1 протеази,

ефективніших ніж біс-фенетиламино-сукцинат C60, привів до відкриття сполук

1.24, 1.25 та 1.26, які демонстрували значення констант інгібування 320 нМ,

103 нМ та 150 нМ, відповідно [240, 241]. Комп’ютерне моделювання ензим-

інгібіторного комплексу з похідною 1.25 показало, що стан іонізації ВІЛ-1

протеази впливає на зв’язування інгібітора в активному центрі ензиму [242]. Як

інгібітори ВІЛ-1 протеази запропоновано також похідні 1.27 та 1.28 [243]. Крім

того, для цілеспрямованого синтезу похідних фулеренів як інгібіторів цього

ензиму було застосовано арсенал комп’ютерних методів, таких як

молекулярний докінг і QSAR, що допомагають знайти певні закономірності між

структурою і активністю сполук [244-249].

33

Іншою не менш важливою терапевтичною мішенню в процесі реалізації

анти-ВІЛ-активності похідних фулеренів є РНК-залежна ДНК-полімераза, або

зворотна транскриптаза вірусу імунодефіциту людини. Відомо, що цей ензим

необхідний для здійснення життєвого циклу ретровірусу та забезпечує синтез

ДНК з вірусної РНК [250]. На сьогодні одним з препаратів, націлених на РНК-

залежну ДНК-полімеразу вірусу, є невірапін, відомий під торговою назвою

Вірамун®. Встановлено, що піролідино[60]фулерен-трис-карбонова кислота

1.29 в 1000 разів краще інгібує зворотну транскриптазу вірусу імунодефіциту

(IC50 0,0029 мкМ), ніж невірапін (IC50 3 мкМ) [251].

34

Похідна 1.30 характеризується середньою активністю проти ВІЛ-1 та

ВІЛ-2 зі значенням ІС50 20 ± 10 та 29 ± 1 мкМ, відповідно [252]. Ізомери біс-

N,N-диметилфулеропіролідиніуму 1.32 та полікарбоксильовані похідні 1.34 та

1.35 також демонстрували активність проти ВІЛ-1 та ВІЛ-2 [253].

Полікарбоксильовані похідні фулерену С70 (сполука 1.36 та 1.37) проявляють

активність проти ВІЛ шляхом взаємодії з глікопротеїном gp120. Крім того,

сполука 1.37 має виражену активність проти А-вирусів підтипу H1N1 і

35

H3N2 [254]. Серед ряду похідних фулеренів, досліджених в роботі [255], саме

катіонна похідна біс-N,N-диметилфулеропіролідиніуму 1.32 виявилась

найефектив-нішою проти H1N1 та H3N2 зі значенням ІС50 20 та 31 мкМ,

відповідно. Сполуки 1.38 та 1.39 ефективно інгібують вірус герпесу, а сполука

1.40 – цитомегаловірус [256]. Сірковмісні полікарбоксильовані фулерени 1.41

та 1.42 проявляють активність проти ВІЛ-1, ВІЛ-2 та респіраторного

сенцитіального вірусу [257]. N-Фулерен-трис-амінокапронова кислота 1.43

показала активність проти респіраторно-синцитіальної вірусної інфекції при

інкубації HEp-клітин зі сполукою за дві години до інфікування, чи

безпосередньо під час нього [258], а α-циклодекстрин-[60]фулереновий

кон’югат продемонстрував здатність блокувати запис вірусу гепатиту С зі

значенням ІС50 0,17 мкМ [259].

Бактерицидний ефект ізомерів біс-N,N-диметилфулеропіролідиніуму 1.32

пов'язаний з негативним впливом на активність дихального (електрон-

транспортного) ланцюга мітохондрій, імовірно завадяки інгібуванню глутатіон-

редуктази, що приводить до пригніченням росту E. Coli [260].

Антибактеріальна активність водної суспензії немодифікованого фулерену

може бути пов’язана з окисненням мембранних білків, зміною мембранного

потенціалу та блокуванням клітинного дихання [261]. Похідна фулерену 1.44

виявляє бактерицидну активність шляхом необоротного зв’язування з

мембраною E.Coli та проникнення в клітину. Ця дія обумовлена відповідним

zeta-потенціалом сполуки та клітинної мембрани. Натомість сполука 1.34, що

має позитивний zeta-потенціал, слабко зв’язується з мембранами E.Coli [262].

36

1.3.2. ФОТОАКТИВНІСТЬ І АНТИОКСИДАНТНІ, ЦИТОТОКСИЧНІ ТА

АНТИРАКОВІ ВЛАСТИВОСТІ ПОХІДНИХ ФУЛЕРЕНІВ

Під дією світла фулерени можуть продукувати синглетний кисень (1O2)

[263], а при взаємодії з елетрон-донорними сполуками (аміни, антиоксиданти

тощо) перетворюватися в радикал-аніон (C60•-

), який при взаємодії з киснем

генерує супероксидний радикал (O2•-

) [264, 265]. Також показано, що фулерени

можуть продукувати O2•-

та гідроксильний радикал за рахунок енергії НАДН.

In vitro було продемонстровано, що карбоксильовані похідні 1.23 та 1.24,

не впливаючи у мікромолярній концентрації на ракову культуру клітин HeLa S3

та суперспіралізовану pBR322 ДНК в темряві, при дії світла спричиняли

цитотоксичний ефект та викликали фрагментацію генетичного матеріалу [266].

Припускалося, що цей ефект є наслідком здатності похідних фулерену

продукувати активні форми кисню під дією світла [265, 266]. Фрагментація

генетичного матеріалу, що відбувалася переважно за участю гуанінових основ,

найсхильніших до окиснювального розщеплення, підтверджувала цю думку

[240]. Така властивість фулеренів відкрила для них перспективи використання

як фотосенсибілізаторів – хімічних агентів фотодинамічної терапії.

Дослідження ряду похідних С60, наприклад 1.31-1.33 та 1.45-1.47, з замісниками

різної хімічної природи виявило, що введення в структуру сполуки донора

електронів безпосередньо біля фулеренового ядра може знижувати її

фотосенсибілізаційні властивості [267]. Тому похідні 1.32 та 1.33, маючи

дефіцит елетронів на атомі азоту, є високоефективними фотосенсибілізуючими

агентами, що викликають апоптичну загибель ракових клітин [267].

37

За відсутності фотосенсибілізуючих властивостей похідні С60 проявляють

себе як антиоксиданти, перешкоджаючи перекисному окисненню ліпідів [268].

Ліпосоми з інкорпорованим фулереном інгібують розвиток радикальних

процесів краще, ніж вітамін C та E [269], а також можуть стримати УФ- та t-

BuOOH-індуковану генерацію активних форм кисню в клітинах шкіри [270,

271]. Гексасульфобутил[60]фулерен перешкоджає радикальному окисненню

ліпопротеїдів низької густини, що має вагоме значення для лікування

патогенезу атеросклерозу [272]. Малонатні похідні 1.49 та 1.50 здатні

поглинати різні типи радикалів та мають нейропротекторний ефект [273-275].

Гідратований немодифікований фулерен гасить радикали, виникнення яких

обумовлено рентгенівським опроміненням [276]. Модельні експерименти

свідчать, що похідні фулеренів здатні знижувати гостре запалення через

стимуляцію вивільнення гістидину, продукування фактора некрозу пухлин α, а

також поглинання активних форм кисню, виникнення яких відіграє важливу

роль у запальній відповіді [277].

Цитотоксичність фулеренів є функцією їх модифікації. Так,

немодифікований C60 та ізомер C3 похідної 1.50 демонстрували набагато більшу

токсичність, ніж C60(OH)24. Негативний ефект немодифікованого C60

ґрунтується на перекисному окисненні ліпідних структур, утворення

мембранних «дірок» значного діаметру [278], підвищенню рівня глутатіону

[279] та АФК-залежного некрозу клітин [280]. При додаванні разом з

фулереном L-аскорбінової кислоти, яка є сильним антиоксидантом,

цитотоксичність практично повністю блокувалась [280].

Водний розчин немодифікованого фулерену продемонстрував антиракові

та антиметастатичні ефекти в експериментах на мишах з трансплантованою

карциномою легенів Льюїса [281] та синергічний вплив з доксорубіцином в

експерименті з раковими клітинами шийки матки. Виявилося, що фулерен за

нетоксичної концентрації викликає автофагію ракових клітин [282]. Хоча in

vitro суспензія немодифікованого фулерену показала анти-меланомний ефект, а

38

мічений радіоізотопом фулерен демонстрував кращу спорідненість до ракових

клітин, in vivo ефект був протилежний. Фулерен забезпечив ріст ракових клітин

шляхом блокування імунної відповіді організму [283].

1.3.3. МЕДИКО-БІОЛОГІЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ ПОЛІГІДРОКСИЛЬОВАНИХ

ПОХІДНИХ ФУЛЕРЕНУ

Фулероли (або фулереноли) – це полігідроксильовані похідні фулеренів.

В біологічних дослідженнях вони демонструють значно меншу токсичність у

порівнянні з немодифікованим фулереном [278, 279], не виявляють

генотоксичного ефекту в концентрації 11-221 мкМ та знижують частоти

мікроядерних та хромосомних аберацій [284]. Позитивна дія фулеролу

спостерігається при низьких концентраціях, тоді як високі концентрації

викликають інгібування мітохондріального мембранного потенціалу [285].

Токсичність фулеролу для LLC-PK1-клітин пов’язана з порушенням структури

цитоскелету, утворенням аутофагічних вакуолей, мітохондріальною

дисфункцією та виснаженням рівня АТФ [286], тоді як їх цитотоксичний ефект

на клітини CHL, CHO та L929 пов’язаний з затримкою їх розвитку у G1 фазі

[287]. Результати дослідження впливу полігідроксифулеренів на епідермальні

кератиноцити людини свідчать про залежність цитотоксичності цих сполук від

ступеня гідроксильованості [288].

Ефективна взаємодія фулеролів з супероксидним радикалом, що в

експериментальних умовах генерувався ксантином і ксантиноксидазою, дає

підставу розглядати ці сполуки як антиоксиданти [274, 289].

Полігідроксильовані фулерени здатні запобігати індукованому нітропрусидом

натрію зниженню активності антиоксидантних ензимів, утилізуючи оксид азоту

[290]. Експерименти, проведені з нейрокортикальною культурою клітин,

свідчать, що фулероли, перешкоджаючи виникненню оксидативного стресу,

знижують ексайтоксичну та апоптозну загибель нейронів [291].

39

На моделях тварин показано, що фулерол в концентрації 100 мг/кг

захищає від згубної дії рентгенівського випромінювання шляхом модуляції

активності імунної системи, функцій мітохондрій та активності

антиоксидантних систем [292, 293], тоді як при концентрації 10 мг/кг, навпаки,

підсилює радіаційні пошкодження [294]. Результати протекторної дії фулеренів

від УФ-освітлення було отримано в експериментах на людських кераноцитах

HaCaT [295]. Однак, є також експериментальні дані про те, що під дією

ультрафіолетового та видимого світла фулероли здатні продукувати АФК [296].

Це може стати причиною радикального пошкодження ліпідів та білків

біологічних мембран [297]. До того ж встановлено, що фулерол може

зв’язуватися з фосфатним остовом ДНК в області великої борозни [298], а отже,

цілком імовірно, може викликати її окиснювальні зміни. В експерименті на

епітеліальних клітинах кришталика ока було помічено апоптичну дію фулеролу

через пошкодження клітинних мембран як в умовах освітлення, так і без нього

[299].

Фулерол модулює цитотоксичний ефект антиракових препаратів, таких як

адриаміцин, цисплатин, таксол і тиазофурин [300-302] та знижує

гепатотоксичність і нефротоксичність, що обумовлена дією тетрахлорметану

[303]. Негативний вплив доксорубіцину на внутрішні органи практично

повністю зникав, коли щурам перед терапією цим препаратом вводили С60(ОН)х

[304-309]. Кон’югант фулеролу і доксорубіцину проявляв антиракову

активність, характерну для самого доксорубіцину з мінімальною системною

токсичністю [310]. Сам же фулерол в модельній системі демонстрував

інгібувальний вплив на розвиток раку, його інфільтрацію в сусідні нормальні

тканини та імуномоделюючий ефект [311, 312], підвищував продукцію деяких

ангіогенних факторів та викликав неоваскуляризацію в межах тканин раку

[313]. В експерименті на еритролейкозній лінії ракових клітин людини

виявлено вплив полігідроксильованих похідних фулерену на активність

супероксиддисмутази та глутатіонпероксидази [314]. Однак, застосування

40

фулеролу як доксорубіцинового протектора може бути обмежено його

здатністю в дозо-залежній манері акумулюватися в жировій тканині [315]. Крім

того, помічено хронічну токсичність фулеролів при тривалому використанні за

низьких концентрацій (10 мкМ/мл), що може привести до серцево-судинних

захворювань, в тому числі атеросклерозу та ішемічної хвороби серця [316].

Встановлено, що фулероли можуть зв’язуватися з плазматичною мембраною

еритроцитів та проникати всередину клітин. При цьому відбувається зміна

анізотропії мембрани, знижується активність Na+, K

+-АТФази, Ca

2+-АТФази та

Mg2+

-АТФази [317], інгібується іонний відтік калію та автогемоліз [318].

Таким чином, представлені в цьому огляді дані літератури підсумовують

результати дослідження біоактивності терапевтично значимих протеїнтирозин-

фосфатаз, а також біоактивності похідних тетраазамакроциклів та фулеренів.

На основі проаналізованих публікацій можна відзначити, що протеїнтирозин-

фосфатази, зокрема PTP1B, TC-PTP, SHP2 та CD45, є потенційними

терапевтичними мішенями в лікуванні диабету 2 типу, ожиріння, злоякісних

новоутворень, вірусних захворювань, автоімунних та інших порушень. Аналіз

літературних джерел щодо біоактивності похідних тетраазамакроциклів [3, 4]

та фулеренів [5, 257] дозволив зробити висновок, що ці сполуки могли б бути

перспективними об’єктами для конструювання на їх платформі інгібіторів

протеїнтирозинфосфатаз, зокрема через свою низьку токсичність та

перспективність як терапевтичних засобів. З огляду на це формувалася мета і

завдання представленої дисертаційної роботи.

Головний напрям дисертаційних досліджень полягав у пошуку і

встановленні закономірностей та механізмів дії потенційних інгібіторів

протеїнтирозинфосфатаз на молекулярній платформі тетраазамакроциклів і

фулеренів. У відповідності з цим було вивчено інгібування окремих РТРаз,

передусім PTP1B, TC-PTP, CD45 і SHP2 фосфонатними похідними

тетраазамакроциклів, а також полікарбоксилатними та іншими похідними

41

фулеренів. Для досягнення поставленої мети необхідно було встановити

основні закономірності і селективність інгібування, в тому числі з’ясувати

кінетичні закономірності і механізми дії бензил-α,α-дифтор-β-кетофосфонатних

похідних тетраазамакроциклів на активність ТС-РТР, встановити

закономірності та особливості впливу полікарбоксилатних фулеренів на

активність CD45 і PTP1B, проаналізувати вплив полігідроксильованих

фулеренів на активність РТР1В та інших протеїнтирозинфосфатаз.

Результати виконаних нами робіт, які викладені в наступних розділах цієї

дисертації та опубліковані в наукових публікаціях [319-324], повною мірою

інтегруються в загальний науковий комплекс знань, що в загальному наведені в

цьому літературному огляді, і поряд з відомими результатами інших

дослідницьких груп дозволяють окреслити нові напрями біоорганічних

досліджень похідних тетраазамакроциклів і фулеренів як потенційних

інгібіторів терапевтично значимих людських протеїнтирозинфосфатаз.

42

РОЗДІЛ 2

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

2.1. МАТЕРІАЛИ

В роботі використовували рекомбінантні людські препарати

протеїнтирозинфосфатаз – PTP1B, TC-PTP, CD45, SHP2, PTPβ, MEG1 та MEG2,

які були придбані у фірми “Sigma-Aldrich”. Всі вони були отримані шляхом

експресії в E. сoli, за винятком CD45, що була експресована в клітини комах,

інфікованих бакуловірусом. Короткодовжинна протеїнтирозинфосфатаза

PTP1B мала масу 37,4 кДа та містила каталітичний домен з 1-322 залишками

амінокислотної послідовності. Ензим поставлявся у вигляді розчину 50 мМ

HEPES-буферу (pH 7,2) з 1 мМ EDTA, 5 мМ DTT та 0,05% NP-40.

Повнодовжинна PTP1B мала масу 76 кДа та містила 1-436 амінокислотні

залишки каталітичного домену людського ензиму. Розчин РТРази містив 45 мМ

трис-НСІ-буфер з рН 8,0, а також 124 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 3 мМ DTT, 18 мМ

глутатіон та 10% гліцерин. Використана в роботі Т-клітинна

протеїнтирозинфосфатаза мала молекулярну масу 62,3 кДа та 2-315

послідовності амінокислотних залишків людської TC-PTP. Ензим знаходився в

розчині, що вміщував 25 мМ трис-НСІ-буферу (рН 8,0), 75 мМ NaCl, 2 мМ

EDTA, 1 мМ DTT, 10 мМ глутатіон, 50% гліцерин та 0,05% Твін-20.

Рекомбінантний білок CD45 з молекулярною масою 75 кДа та 584-1256

послідовності амінокислотних залишків людського ензиму містився в розчині з

25 мМ трис-НСІ-буфером (рН 8,0), 75 мМ NaCl, 5 мМ DTT, 50% гліцерином та

0,05% Твіном-20. Каталітичний домен SHP2 масою 59,5 кДа, що представлений

224-529 амінокислотними залишками людського ензиму, був розчинений в 25

мМ трис-НСІ-буфері (рН 8,0) з 75 мМ NaCl, 2 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 10 мМ

глутатіоном, 50% гліцерином та 0,05% Твіном-20. Повнодовжинна

43

рекомбінантна людська протеїнтирозинфосфатаза-β з молекулярною масою

~250 кДа була експресована в E. сoli K12. Використаний в роботі ензим був у

розчині 25 мМ трис-НСІ-буферу (рН 8,0) з 75 мМ NaCl, 2 мМ EDTA, 1 мМ

DTT, 10 мМ глутатіоном, 50% гліцерином та 0,05% Твіном-20. Ензим MEG1

мав молекулярну масу 60,3 кДа та 637-926 послідовності амінокислотних

залишків людського ензиму, що відповідала каталітичному домену. Розчин

ензиму містив 40 мМ трис-НСІ-буфер з рН 8,0, 110 мМ NaCl, 2,2 мМ KCl, 3 мМ

DTT, 16 мМ глутатіон та 20% гліцерин. MEG2 мав молекулярну масу 60,3 кДа

та 285-593 амінокислотні залишки каталітичного домену. Ензим містився в

розчині з 25 мМ трис-НСІ-буфером (рН 8,0), 67 мМ NaCl, 1,4 мМ KCl, 3 мМ

DTT, 10 мМ глутатіоном та 50% гліцерином. Отримані препарати зберігалися в

морозильний камері за температури -70 оС.

Штучні субстрати, що використовувались для вимірювання активності

ензимів, п-нітрофенілфосфат (pNPP) та флуоресцентний субстрат 4-

метилумбеліферилфосфат (4-MUP), а також препарати для приготування

буферів, зокрема біс(2-гідроксиетил)аміно-трис(гідроксиметил)метан та його

гідрохлорид, були придбані у фірми “Sigma-Aldrich”.

Похідні тетраазамакроциклів були синтезовані в Інституті біоорганічної

хімії та нафтохімії НАН України під керівництвом академіка НАН України

В.П. Кухаря та професора В.Д. Романенка. Піролідино[60]фулерен-трис-

карбонова кислота та полігідроксильований фулерен були придбані у фірми

“Sigma-Aldrich”. Інші функціоналізовані фулерени було синтезовано в Інституті

проблем хімічної фізики РАН в лабораторії канд. хім. наук П.А. Трошина за

описаною методикою [253-256, 325]. Структура синтезованих сполук доведена

за допомогою елементного аналізу, мас-спектроскопії та ЯМР-спектроскопії.

44

2.2. ДОСЛІДЖЕННЯ ВПЛИВУ ПОХІДНИХ ТЕТРААЗАМАКРОЦИКЛІВ ТА

ФУЛЕРЕНІВ НА АКТИВНІСТЬ ПРОТЕЇНТИРОЗИНФОСФАТАЗ

2.2.1. ДОСЛІДЖЕННЯ КІНЕТИКИ ІНГІБУВАННЯ

ПРОТЕЇНТИРОЗИНФОСФАТАЗ ПОХІДНИМИ ТЕТРААЗАМАКРОЦИКЛІВ

Перед проведенням експерименту похідні тетраазамакроциклів

розчиняли, в залежності від структури, у воді, DMSO чи біс-трис-буфері (pH

7,2). Після цього інгібітор у необхідній концентрації вносили в реакційну

суміш, що складалася з 50 мМ біс-трис-буферу з pH 7,2, 2 мМ EDTA, 1 мМ

DTT, 100 мМ NaCl, 1 об. % DMSO та pNPP як субстрату. Концентрація pNPP

була наближена до значення констант Міхаеліса для ензимів, що

досліджувались [18, 326-328]. Суміш термостатували впродовж 5 хвилин при

37 °C (у випадку PTP1B), 30 °C (у випадку TC-PTP, CD45, SHP2 та PTPβ) та

25 °C (у випадку MEG2). Кожен з комерційних розчинів ензимів попередньо

розбавляли 50 мМ біс-трис-буфером з pH 7,2, що містив 3 мМ EDTA, 2 мМ

DTT, 75 мМ NaCl, 30% гліцерин та 0,05% Твін-20. Ензим додавали до

реакційної суміші безпосередньо перед вимірюваннями швидкості гідролізу

субстрату, яку детектували за зміною абсорбції при довжині хвилі 410 нм.

Концентрація ензиму в реакційній суміші становила 4–10 нМ.

З результатів аналізу кінетики накопичення п-нітрофенолу (продукту

реакції) розраховували значення IC50, коефіцієнт Хіла, константу Міхаеліса,

максимальну швидкість ензиматичної реакції та константу інгібування. На

основі цих кінетичних параметрів зроблено висновки щодо ефективності

інгібіторів, їх селективності та типу інгібування (конкурентний,

неконкурентний, змішаний чи безконкурентний).

45

2.2.2. ДОСЛІДЖЕННЯ КІНЕТИКИ ІНГІБУВАННЯ

ПРОТЕЇНТИРОЗИНФОСФАТАЗ ПОХІДНИМИ ФУЛЕРЕНІВ

PTP1B, що містила 1-322 та 1-436 амінокислотні залишки, було

використано в дослідженнях з субстратами 4-MUP та pNPP, відповідно. Перед

використанням в експериментах комерційні препарати протеїнтирозинфосфатаз

були попередньо розведені в 50 мМ біс-трис-буфері (pH 7,2), що містив 75 мМ

NaCl, 3 мМ EDTA, 2 мМ DTT, 20 мМ глутатіон, 30% гліцерин та 0,05% Твін-20.

Похідні фулеренів було розчинено у воді, за винятком препарату

піролідино[60]фулерен-трис-карбонової кислоти, що була розчинена в DMSO

та доведена до необхідної концентрації водою. В експерименті з 4-MUP як

субстратом інгібітор був доданий до реакційної суміші, що вміщувала ензим

(3–6 нМ), 50 мМ біс-трис-буфер (pH 7,2), 3 мМ EDTA, 1 мМ DTT, 100 мМ

NaCl, 1 об. % DMSO та воду. Після інкубації впродовж 5 хвилин при 37 °C (у

випадку PTP1B), 30 °C (у випадку TC-PTP, CD45, SHP2 та PTPβ) та 25 °C (у

випадку MEG1 та MEG2) реакція гідролізу була ініційована додаванням

субстрату. Реакція контролювалась спектрофлуориметрично. Інтенсивність

флуоресценції вимірювали при хвилі збудження та емісії 360 та 450 нм,

відповідно. В експерименті з pNPP гідроліз субстрату був ініційований

введенням в реакційну суміш розчину ензиму після термостатування за

зазначених вище температур. Концентрація ензиму у модельній системі

становила 4–10 нМ. Ензиматична активність детектувалася спектрофото-

метрично при довжині хвилі 410 нм.

На основі результатів кінетичних досліджень швидкості гідролізу

субстратів в присутності різних концентрацій похідних фулеренів було

розраховано значення IC50, коефіцієнт Хіла, константу Міхаеліса та

максимальну швидкість ензиматичної реакції. Константу інгібування та тип

інгібування визначено на основі аналізу співвідношення Km´/Km та Vmax´/Vmax.

46

2.3. КІНЕТИЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ

Перебіг ензиматичних реакцій контролювали за допомогою вимірювання

концентрації продукту спектрофотометричним та спектрофлуориметричним

методами. Дослідження ензиматичних реакцій проводилось за умов, коли

[S]0 >> [E]0 та [S]0 ≤ Km ,

де [E]0 та [S]0 – початкова концентрація ензиму та субстрату, відповідно; Km –

константа Міхаеліса, що чисельно рівна концентрації субстрату, за якої

швидкість ензиматичної реакції складає половину від максимальної. Таким

чином було створено умови стаціонарності, за яких концентрація проміжного

ензим-субстратного комплексу була постійною, а відповідно і постійною була

каталітична швидкість реакції. Оскільки неорганічний фосфатат як продукт

реакції також може чинити інгібуючий вплив на ензиматичну активність,

кінетичні дані отримували з початкового відрізку накопичення продукту реакції

в часовому діапазоні 3 – 10 хвилин після ініціювання гідролізу субстрату (в цей

час концентрація продукту не перевищувала 10%). Відкидання перших 3

хвилин обумовлено можливістю впливу на результати експерименту певних

чинників, що могли б мати місце в процесі встановлення рівноваги в модельній

системі. У випадку полігідроксильованого фулерену розрахунки велися з 5 по

10 хвилину перебігу реакції на відрізку кінетичної кривої, що відповідала

стаціонарній швидкості.

Ензиматична активність визначалась з прямої лінії тренду, дотично

проведеної до лінійної частини кінетичної кривої, що являла собою часо-

залежне накопичення продукту гідролітичної реакції. Дані залишкової

ензиматичної активності, що були отримані за умови [S]0 ≈ Km та різних

концентраціях інгібітора, наносили на графік і з отриманої дозо-залежної

кривої визначали ІС50 та коефіцієнт Хіла. Представлені в роботі значення ІС50

47

являють собою концентрації інгібіторів, за яких ензиматична активність

знижувалася на 50%. Коефіцієнт Хіла є показником кооперативності; він

відображає мінімальну кількість молекул інгібітора, що зв’язуються з однією

молекулою ензиму. ІС50 представлено в роботі як значення ± стандартне

відхилення, а коефіціент Хіла – як значення ± стандартна помилка.

Кінетичні параметри Vmax та Km (за відсутності в модельній системі

інгібітора), а також уявні значення Vmax´ та Km´ (за наявності в модельній

системі інгібітора) визначали з графічної залежності швидкості ензиматичної

реакції від концентрації субстрату в обернених подвійних координатах

Лайнуівера-Берка (графік залежності 1/V від 1/[S]). Кінетичні дані для побудови

графіків такого типу отримували з серії вимірювань, що їх проводили за умов

пропорційного зменшення концентрації субстрату. Таким чином було отримано

пряму за відсутності інгібітора та серію прямих за його наявності при різних

концентраціях. Вид такого графіку свідчив про тип інгібування.

В роботі представлено конкурентний та змішаний тип інгібування з

точкою перетину на осі ординат та під віссю абсцис, відповідно. У випадку

полігідроксильованого фулерену нам не вдалося отримати єдину точку

перетину для всіх прямих. Тому визначені з графіка Лайнуівера-Берка кінетичні

параметри Vmax, Km, Vmax´ та Km´ було використано для якісної оцінки графічної

залежності їх числових значень від концентрації інгібітора.

При конкурентному інгібувані початкова швидкість ензиматичної реакції

визначається з рівняння (2.1). Константу інгібування Ki знаходили з рівняння

(2.2) та з координат залежності Km´ від [I] [329, 330].

(2.1)

48

(2.2)

2.4. МЕТОДИ РОЗРАХУНКІВ ТА СТАТИСТИЧНОГО АНАЛІЗУ

Всі розрахунки було проведено з викорстанням стандартного

програмного забезпечення Microsoft Excel та GraphPad Prism 6.

Для знаходження попередніх значень IC50 результати серії вимірювань

залишкової ензиматичної активності за різних концентрацій інгібітора

наносили на відповідний графік залежності (залишкова активність від [I]) та

аналізували методом регресійного аналізу з використанням лінії тренду, що

описується рівнянням:

(2.3)

З цього рівняння визначали значення IC50:

(2.4)

Оскільки в більшості випадків залежність ензиматичної активності від

концентрацій інгібітора має гіперболічний характер, лінію тренда намагались

провести так, щоб вона якнайближче проходила до гіперболи в області 50 %

активності.

З двох-трьох попередніх значень IC50, що були отримані з відповідної

кількості серій експериментів, за допомогою Microsoft Excel розраховували

середнє значення та стандартне відхилення.

В частині дослідів значення IC50 та коефіцієнт Хіла розраховувались за

допомогою програми GraphPad Prism 6 за чотирипараметровим рівняння

нелінійної регресії:

49

(2.5)

де Х – логарифм концентрації інгібітора; Y – залишкова ензиматична

активність; Top і Bottom – верхне і нижне плато, відповідно, в тих же одиницях,

що і Y; HillSlope – коефіцієнт Хіла.

Рис. 2.1. Графік Лайнуівера-Берка та кінетичні параметри, які з нього

можна визначити.

Константи інгібування розраховували з графіків Лайнуівера-Берка з

використанням Microsoft Excel. Для цього через серію даних, що були отримані

за різних концентрацій субстрату, проводили лінію тренда (рис.2.1). На основі

даних лінійного рівняння (2.3) розраховували Vmax, Km, Vmax´ та Km´ за рівнянням

(2.6) та (2.7), а також Ki за рівнянням (2.2).

50

(2.6)

(2.7)

2.5. МОДЕЛЮВАННЯ ВІДКРИТОЇ КОНФОРМАЦІЇ КАТАЛІТИЧНОГО

ДОМЕНУ CD45 ТА ЗАКРИТОЇ КОНФОРМАЦІЇ TC-PTP

Структурно важливими областями протеїнтирозинфосфатаз для

зв’язування субстратів чи інгібіторів, що були визначені на основі результатів

відомих досліджень PTP1B, можуть бути амінокислотні залишки PТР-петлі

(Pro214-Arg221), WPD-петлі (Thr177-Pro185), Q-петлі (Gln262-Phe269), pTyr-

розпізнаючої петлі (Asn40-Tyr46), R-петлі (Val113-Ser118) та додаткового

центру зв’язування (Tyr20, Arg24, His25, Ala27, Phe52, Arg254, Met258, Gly259).

Аналіз кристалічних структур PTP1B, що доступні в RCSB Protein Data Bank

[331], виявив значні відмінності в положенні WPD-петлі цього ензиму [332-

335]. Ця петля знаходиться в закритому стані в багатьох кристалічних

структурах PTP1B в комплексі з лігандами [332, 333]. Однак, було показано, що

WPD-петля також може залишатися і у відкритому положенні [334, 335]. Отже,

конформаційні зміни протеїнтирозинфосфатаз, особливо WPD-петлі, можуть

мати вирішальне значення для зв’язування інгібітора і тому повинні братися до

уваги при комп’ютерному моделюванні ензим-інгібіторних комплексів [336].

Моедлювання відкритої конформації CD45. Дослідження in vitro

продемонструвало, що похідні фулеренів проявляють значну інгібувальну

активність щодо протеїнтирозинфосфатази CD45 та дещо меншу активність

стосовно PTP1B та SHP2. На основі докінг-дослідження похідної фулерену C60 було

встановлено, що енергетично вигідніший ензим-інгібіторний комплекс з PTP1B

формується у випадку відкритої конформації WPD-петлі (PDB код 1NL9) [337],

51

тоді як її закрите положення (PDB код 2CM8) [338] перешкоджає облаштуванню

інгібітора в область активного центру ензиму. Це пов’язано з тим, що при

відкриванні WPD-петлі формується каталітична впадина глибиною ~ 9 Å [339] з

діаметром, що практично еквівалентний розміру C60 (~ 0,7 нм). Таким чином,

молекулярна поверхня в області активного центру відкритої конформації ензиму

формує впадину на зразок кишені для фулеренового ядра. Однак, на відміну від

PTP1B, CD45 є менш вивченою і представлена в RCSB Protein Data Bank лише

двома рентгеноструктурними кристалами (PDB код 1YGR та1YGU) [89], що мають

закриту WPD-петлю. Тому для аналізу молекулярних основ механізму впливу

фулеренових інгібіторів на активність CD45 її кристалічна структура з відкритою

WPD-петлею була змодельована за допомогою програм MODELLER 9.12, Chimera

1.9 (UCSF, USA) та GROMACS. Моделювання проводили згідно протоколу [340].

Відомо, що РТРазну активність має мебранно-проксимальний домен (D1)

CD45, а не мембрано-дистальний [88, 89], тому саме ця частина ензиму була

змодельована. Амінокислотну послідовність CD45-D1 (рис. 2.2) було отримано з

роботи [16]. Також цю послідовність можна отримати з сайту RCSB Protein Data

Bank, завантаживши файл «FASTA sequence», однак, в такому випадку дещо

складніше визначити амінокислотну послідовність, що входить до складу D1.

Спершу було здійснено моделювання CD45-D1 з відкритою

конформацією WPD-петлі на основі шаблонної структури 1NL9, що за даними

серверу BLAST [41] має ідентичність 35% в амінокислотній послідовності з

послідовністю на рис. 2.2. Це дало можливість порівняти молекулярні поверхні

в області активних центрів PTP1B та CD45. Однак, оскільки для отримання

якісної тривимірної структури білків однією з вимог методу гомологічного

моделювання є висока ідентичність амінокислотної послідовності поміж

шаблонною та модельованою структурою, отриманий кристал CD45-D1 було

небажано використовувати в докінг-дослідженнях.

52

>P1;qseq1

sequence:qseq1:::::::0.00: 0.00

DILLETYKRKIADEGRPFLAEFQSIPRVFSKFPIKEARKPFNQNKNRYVDILP

YDYNRVELSEINGDAGSNYINASYIDGFKEPRKYIAAQGPRDETVDDFWR

MIWEQKATVIVMVTRCEEGNRNKCAEYWPSMEEGTRAFGDVVVKINQH

KRCPDYIIQKLNIVNKKEKATGREVTHIQFTSWPDHGVPEDPHLLLKLRRR

VNAFSNFFSGPIVVHCSAGVGRTGTYIGIDAMLEGLEAENKVDVYGYVVK

LRRQRCLMVQVEAQYILIHQALVEYNQFGETEV*

Рис. 2.2. Амінокислотна послідовність, що була використана для

гомологічного моделювання домену 1 CD45 з відкритою WPD-петлею

За допомогою BLAST серверу було знайдено тирозин-специфічні

фосфатази рецепторного типу (табл. 2.1) з максимальною можливою

ідентичністю в амінокислотної послідовності до послідовності рис. 2.2. З цих

чотирьох кристалічних структур було обрано 2C7S як структуру, що найбільше

підходила для наступних етапів моделювання з точки зору ідентичності в

амінокислотній послідовності, структури, а також роздільної здатності. На

основі цього шаблону було змодельовано тривимірну структуру CD45-D1 з

відкритою WPD-петлею (модель 1), проте, як і у випадку з PTP1B, також не

належної якості. Наступним етапом було моделювання CD45-D1 на основі її ж

шаблонної структури 1YGR (модель 2). Це дало змогу позбутися деяких

мутантних амінокислотних послідовностей кристалічної структури, а саме,

було здійснено заміну Ser828 на Cys828 та амінокислотні фрагменти селен-

метіоніну на фрагмент метіоніну. Якість отриманих моделей 1 та 2, які було

попередньо покращено за допомогою програми 3Drefine

[341], перевірялася з

використанням програм ERRAT, PROCHEK, PROVE, Verify 3D та WHAT

CHECK сервера SAVES (the Structure Analysis and Verification Server) [342-344].

53

Таблиця 2.1.

Шаблонні структури, що були використані для гомологічного моделювання

тривимірної структруи CD45-D1

PDB

код Опис

Ідентичність

амінокислотної

послідовності,

(%)

Структурна

ідентичність,

(%)

Роздільна

здатність,

(Å)

2C7S

Кристалічна структура

людської протеїнтирозин-

фосфатази, капа-ізоформа

47 46,5 1,95

2JJD

Рецепторна протеїн-

тирозинфосфатаза,

епсилон-ізоформа

47 14 3,2

2NV5

Кристалічна структура C-

термінального

фосфатазного домену

пацюка сірого, ортолог

людської протеїнтирозин-

фосфатази рецепторного

типу, D (PTPRD)

46 51,75 2,0

1LAR Фосфатазний домен RPTP

LAR 45 53,26 2,0

За допомогою програми Chimera 1.9 (UCSF, USA) було здійснено

вирівнювальне накладання моделі 1 та 2 CD45-D1 в 3D-просторі (рис. 2.3). Крім

того, через цю програму було переписано нумерацію амінокислотної

послідовності модельних структур, що дало можливість провести наступні

етапи роботи.

54

Рис. 2.3. Вирівнювальне накладання моделей CD45-D1 в тривимірному

просторі. RMSD поміж структур складає 0,863 Å

Координати положення атомів амінокислотної послідовності поміж

точками перекривання основних ланцюгів (рис. 2.3) в модельній структурі з

закритою WPD-петлею були переписані на координати відповідних атомів

амінокислот з структури, що має відкриту WPD-петлю. Отриманий кристал

піддавався оптимізації за допомогою програми GROMACS до тих пір, поки не

було отримано оптимальні перевірочні результати в програмах ERRAT,

PROCHEK, PROVE, Verify 3D та WHAT CHECK. Таким чином було отримано

модельну структуру відкритої конформації домена 1 CD45 зі зміненим

положенням тільки WPD-петлі, без врахування незначних змін положень інших

петель, що відбулися під час етапів моделювання. На рис. 2.4 представлено

результати перевіряння згідно програми ERRAT, яка аналізує нековалентні

взаємодії між атомами різних типів [342].

55

Загальний коефіцієнт якості:**99,273

*Вісь (Y) перетинають дві лінії, що вказують на довірчий інтервал, відповідно

до якого можуть бути відхилені області (Х), що перевищують величину

помилки. **Виражено як відсоток білка, для якого обчислене значення помилки

знаходиться нижче 95% межі відхилення. Cтруктура високої роздільної

здатності зазвичай має значення близьке 95% або вище. Для нижчої роздільної

здатності (2,5–3 Å) загальна середня якість становить близько 91%.

Рис. 2.4. Результати верифікації модельної структури CD45 з відкритою

WPD-петлею за допомогою програми ERRAT після проведених оптимізацій

програмою GROMACS.

Результати докінгу, проведені з модельною структурою каталітичного

домену CD45, свідчать про неможливість облаштування фулеренового ядра

інгібітора в область активного центру. Це обумовлено положенням

амінокислотних залишків Gln872 та Lys736 (нумерація з PDB кристалу 1YGR),

які виходять в область каталітичної впадини активного центру наявної

структури. Шляхом аналізу ряду PDB кристалів, а також літературних джерел

[43, 345] було встановлено, що зазначені амінокислоти (в структурі PTP1B це

Gln262 та Lys120, відповідно) беруть активну участь в каталітичних

перетвореннях субстрату, а отже є рухомими. Тому положення Gln872 та

56

Lys736, а також деяких інших амінокислотних залишків (Asp660, Cys828,

Ser829, Arg834) було відкореговано шляхом зміни торсійних кутів, відповідно

до їх положення в кристалічній структурі CD45, PTP1B, а також лужної

фосфатази. Скорегована структура має дещо гірші результати верифікації

(загальний коефіцієнт якості в ERRAT складає 97,455), проте може зв’язувати

фулеренове ядро в області каталітичної впадини активного центру.

Моедлювання закритої конформації TC-PTP. Значний інтерес до PTP1B,

як потенційної мішені в лікуванні діабету 2 типу, ожиріння та раку, обумовив

отримання великої кількості кристалічних структур цього ензиму, що

розміщені в RCSB Protein Data Bank. Однак, ТС-PTP, найближчий гомолог

PTP1B по амінокислотній послідовності, є менш вивченою і представлена в базі

даних лише одним кристалом 1L8K з відкритою WPD-петлею [42]. Тому для

знаходження імовірних режимів зв’язування інгібітора в активному центрі

ензиму кристалічна модель TC-PTP з закритою WPD-петлею була змодельована

за аналогічною з CD45-D1 методикою.

Амінокислотну послідовність ензиму (рис. 2.5.) для моделювання було

отримано з файлу «FASTA sequence», який було завантажено з серверу RCSB

Protein Data Bank. Як шаблонні структури використовували кристал 2СМ8

PTP1B, що має 69% ідентичність в акмінокислотній послідовності до

амінокислотної послідовності на рис. 2.5. Моделювання відкритої конформації

TC-PTP не проводили в зв’язку з значною амінокислотною ідентичнісю поміж

модельною та шаблонною структурою, а також відсутністю у відкритій

конформації TC-PTP мутантних амінокислотних залишків. Координати атомів

амінокислотної послідовності WPD-петлі в кристалі 1L8K було замінено на

координати відповідних атомів закритої конформації цієї петлі з модельної

структури TC-PTP. Ця дія обумовлена перш за все збереженням

конформаційних положень інших каталітично важливих петель, зокрема R-петлі,

що має дещо відмінне положення від аналогічної петлі в структурі PTP1B [42].

57

>P1;qseq1

sequence:qseq1:::::::0.00: 0.00

MPTTIEREFEELDTQRRWQPLYLEIRNESHDYPHRVAKFPENRNRNRYRDVS

PYDHSRVKLQNAENDYINASLVDIEEAQRSYILTQGPLPNTCCHFWLMVWQ

QKTKAVVMLNRIVEKESVKCAQYWPTDDQEMLFKETGFSVKLLSEDVKSY

YTVHLLQLENINSGETRTISHFHYTTWPDFGVPESPASFLNFLFKVRESGSLN

PDHGPAVIHCSAGIGRSGTFSLVDTCLVLMEKGDDINIKQVLLNMRKYRMG

LIQTPDQLRFSYMAIIEGAKCIKGDSSIQKRWKELSKEDLSPAFDHSPNKIMT

EKYN*

Рис. 2.5. Амінокислотна послідовність, що була використана для

гомологічного моделювання TC-PTP з закритою WPD-петлею

Загальний коефіцієнт якості для отриманої модельної структури за

програмою ERRAT становивив 87,17, що не є досить добрим результатом. Він

не дуже відрізняється від вихідного кристалу 1L8K з відповідним коефіцієнтом

90,57, що свідчить про недостатньо добрі вихідні умови для проведеного

моделювання.

2.6. ДОСЛІДЖЕННЯ ІНГІБІТОРІВ ПРОТЕЇНТИРОЗИНФОСФАТАЗ

МЕТОДОМ МОЛЕКУЛЯРНОГО ДОКІНГУ

2.6.1. ПІДГОТОВКА СТРУКТУР ЛІГАНДІВ ТА БІЛКІВ ДЛЯ ДОКІНГУ

Підготовку лігандів для докінгу проводили за допомогу комп’ютерних

програм MarvinSketch, Avogadro та AutoDockTools. Програма MarvinSketch

була використана для створення 3D-структур та обрахунків станів іонізації

лігандів. Після цього хімічні структури в іонізованій формі було оптимізовано в

силовому полі MMFF94s за допомогою програми Avogadro [346]. Отримані

58

таким чином структури лігандів було використано під час докування.

Виключення становлять полігідроксильовані фулерени, стан іонізації яких нам

розрахувати не вдалося. AutoDockTools було застосовано для підготовки

спеціального докінг-формату *.pdbqt ліганду з *.mol2, що окрім просторових

координат атомів вміщує їх заряди та типи.

Білкові структури протеїнтирозинфосфатаз для докінгу було завантажено

з RCSB Protein Data Bank (http://www.rcsb.org) або змодельовано, як описано

вище, та підготовлено до докінгу за допомогою програм Discovery Studio 3.5 та

AutoDockTools. Підготовка білкових структур включала видалення молекул

лігандів, води та створення з *.pdb файлу необхідного для докінгу формату

*.pdbqt.

2.6.2. МОДЕЛЮВАННЯ ЕНЗИМ-ІНГІБІТОРНОГО КОМПЛЕКСУ Т-

КЛІТИННОЇ ПРОТЕЇНТИРОЗИНФОСФАТАЗИ З N1,N

4,N

8,N

11-ТЕТРАКІС{3-

[1′-ОКСО-2′,2′-ДИФТОР-2′-(ФОСФОНО)ЕТИЛ]БЕНЗИЛ}-1,4,8,11-

ТЕТРААЗАЦИКЛОТЕТРАДЕКАНОМ

Докінг-дослідження проведено з використанням програмного

забезпечення AutoDock Vina [347]. Рухливий ліганд було доковано в область

активного центру нерухомого ензиму. Отриманий результат показав, що

інгібітор має декілька енергетично вигідних поз зв’язування, що обумовлено

великим числом його ступенів свободи. Тому нами було використано

статистичний підхід для знаходження найвигіднішої моделі зв’язування. Так,

набір моделей з 90 ензим-інгібіторних комплексів було отримано з десяти

незалежно проведених докінгів. Візуально оглянуто кожен комплекс та

розділено набір моделей на групи за конформаційною подібністю. Кожну групу

оцінено через число моделей в ній та середнє значення оціночної вільної енергії

зв’язування. Група, що мала найкращі ці два параметри, була обрана як

найімовірніша модель зв’язування. Ензим-інгібіторний комплекс з цієї групи,

59

що мав найнижчу оціночну енергію зв’язування, був використаний для

наступної докінг-оптимізації. Поперемінна фіксація двох протилежних атомів

фосфору в чотирьох бензил-α,α-дифтор-β-кетофосфонатних замісниках

забезпечила фіксацію макроциклічної платформи інгібітора в певному

положенні, тоді як інші замісники, маючи високий ступінь свободи, могли

знайти енергетично вигідніші позиції для зв’язування з молекулярною

поверхнею ензиму. Таку докінг-оптимізацію було здійснено за допомогою

модифікованої версії AutoDock [348]. Фінальний ензим-інгібіторний комплекс

було оцінено за допомогою AutoDock Vina. На рис. 2.6 продемонстровано

послідовність етапів моделювання ензим-інгібіторного комплексу.

Така оптимізація дозволила нам знайти кращу модель зв’язування

інгібітора з відкритою конформацією TC-PTP (PDB код кристалу, що був

використано для докінгу 1L8K [42]) з ΔGdoc -9,6 ккал/моль у порівнянні з

попередньо отриманим значенням -9,2 ккал/моль після першого етапу. При

цьому такий вид оптимізації не дав ніякого поліпшення для конформації

ензиму з закритою WPD-петля (для докінгу був використаний змодельований

кристал).

Характеристики найважливіших взаємодій, що формуються в

представлених ензим-інгібіторних комплексах поміж TC-PTP та похідною

1,4,8,11-тетраазациклотетрадекану охарактеризовано за допомогою програми

Discovery Studio 3.5 за наявності атомів гідрогену в структурі ензиму.

60

Рис. 2.6. Послідовність етапів моделювання ензим-інігібіторного

комплексу TC-PTP з тетра-заміщеною бензил-α,α-дифтор-β-кетофосфонатною

похідною 1,4,8,11-тетраазациклотетрадекану.

61

2.6.3. МОДЕЛЮВАННЯ ЕНЗИМ-ІНГІБІТОРНОГО КОМПЛЕКСУ PTP1B ТА

CD45 З ПІРОЛІДИНО[60]ФУЛЕРЕН-ТРИС-КАРБОНОВОЮ КИСЛОТОЮ

Кінетичні дослідження продемонстрували, що піролідино[60]фулерен-

трис-карбонова кислота інгібує активність PTP1B за конкурентним механізмом.

Тому докування з використанням програми AutoDock 4.2 проводили в область

активного центру. При цьому використовували параметри розміру Grid Box

40×40×40 з дефаултним значенням Spacing (angstrom) 0,375. Докінг було

проведено як у звичайному режимі, так і при орієнтуванні замісників до

каталітично важливого Cys215, що було здійснено з використанням версії

AutoDock, описаної в роботі [348].

Результати кінетичних досліджень свідчать, що піролідино[60]фулерен-

трис-карбонова кислота інгібує активність CD45 за змішаним механізмом. Для

з’ясування молекулярних основ формування ензим-інгібіторних комплексів

було здійснено їх комп’ютерне моделювання за допомогою програми AutoDock

4.2. При цьому було застосовано параметри Grid Box 160×160×160 з центром на

макромолекулі та дефаултним значенням Spacing (angstrom) 0,375. Таким

чином було залучено всю молекулярну поверхню ензиму до процесу

докування. В результаті дослідження було отримано по 3415 моделей

зв’язування для кристалу 1YGR та модельної структури домену 1 CD45.

Отримані ензим-інгібіторні комплекси були ієрархічно згруповані в 30

найбільш відмінних кластерів на основі RMSD позицій атомів структури

ліганду. Простіше кажучи, групування відбувалося на основі місця локалізації

та орієнтації ліганду на молекулярній поверхні CD45. Ензим-інгібіторний

комплекс з найнижчою енергією докінгу, що входить до групи з найбільшим їх

числом, обирався як ймовірна модель зв’язування. Таким чином було

теоретично обґрунтовано припущення, що піролідино[60]фулерен-трис-

карбонова кислота може облаштовуватись як в активний центр CD45

(модельної структури) так і в область R-петлі (кристалу 1YGR).

62

Характеристики найважливіших водневих зв’язків в представлених

модельних ензим-інгібіторних комплексах PTP1B та CD45 з

піролідино[60]фулерен-трис-карбоновою кислотою здійснена за допомогою

програми Discovery Studio 3.5 за умов наявності полярних атомів гідрогену в

структурі ензимів.

2.6.4. МОДЕЛЮВАННЯ ЕНЗИМ-ІНГІБІТОРНИХ КОМПЛЕКСІВ CD45 З

ПОХІДНИМИ ФУЛЕРЕНУ С60

Комерційно доступні похідні С60 було знайдено на сайті фірми “Sigma-

Aldrich”. Структури лігандів було доковано за допомогою програми AutoDock

4.2 в активний центр модельного кристалу домену 1 СD45. При цьому

використовували параметри розміру Grid Box 40×40×40 з дефаултним

значенням Spacing (angstrom) 0,375.

2.6.5. МОДЕЛЮВАННЯ ЕНЗИМ-ІНГІБІТОРНИХ КОМПЛЕКСІВ PTP1B З

ПОЛІГІДРОКСИЛЬОВАНИМИ ФУЛЕРЕНАМИ C60(OH)6-36

Кінетичні дослідження продемонстрували, що полігідроксильований

фулерен C60(OH)30 може облаштовуватись як в активному центрі ензиму, так і

за його межами. В такому випадку, для з’ясування імовірних режимів

зв’язування, програмою AutoDock Vina було змодельовано комплекси

полігідроксильованого фулерену з рентгеноструктурними кристалами

протеїнтирозинфосфатази 1В, що мали відкриту та закриту WPD-петлю (1NL9

та 2CM8, відповідно). При цьому було використано файл конфігурцій, що

містив параметри розміру Grid Box 60×60×60 з центром на молекулі білка. Вся

молекула протеїнтирозинфосфатази була вміщена в Grid Box і докування

проводилось по всій поверхні ензиму.

63

Моделювання структур фулеренолів для докінгу було здійснено на основі

теоретичних розрахунків, відповідно до яких близько семи OH-груп

розташовуються з одного боку фулеренового каркасу у вигляді острівка з

внутрішніми водневими зв’язками. Наступні гідроксильні групи (з 8 по 14)

займають протилежний полюс наночастинки [349, 350]. Відповідно до такої

структури, у водних розчинах фулереноли можуть формувати аморфні

полідисперсні кластери завдяки гідрофобним та водневим зв’язкам. Такі

кластери було виявлено при мікромолярній концентрації, і тому за менших

концентрацій, очевидно, утворюються супрамолекулярні агрегати. На розмір

кластерів впливає pH, температура та хімічні компоненти розчину [351].

Результати докінг-дослідження, що демонстрували облаштування

інгібітора переважно в область активного та алостеричного центрів ензиму,

повторялися щонайменше п’ять разів. Крім того, повторне моделювання ензим-

інгібіторних комплексів за допомогою AutoDock 4.2 продемонструвало

подібний результат. Аналогічним чином було проведено докування молекул

інших фулеренолів та немодифікованого фулерену. Лише у випадку високої

спорідненості до області активного центру було застосовано обмеження

простору докування (для з’ясування енергії зв’язування в області

алостеричного центру).

Характеристика найважливіших зв’зків в модельних ензим-інгібіторних

комплексах при облаштуванні C60(OH)30 в області активного та алостеричного

центру PTP1B здійснена з використанням програмного забезпечення Discovery

Studio 3.5 та за умови відсутності атомів гідрогену в структурі ензиму та

ліганду.

64

РОЗДІЛ 3

ТЕТРААЗАМАКРОЦИКЛИ ЯК МОЛЕКУЛЯРНА ПЛАТФОРМА ДЛЯ

КОНСТРУЮВАННЯ ІНГІБІТОРІВ ПРОТЕЇНТИРОЗИНФОСФАТАЗ

Відомо, що моноалкілфосфонатні групи є міметиками фосфорильованих

фрагментів білків. Тому деякі з похідних фосфонових, α,α-дифторфосфонових і

α,α-дифтор-β-кетофосфоних кислот можуть виявляти значну інгібувальну дію

стосовно РТРаз [120, 121, 133, 352]. Однак, важливим в структурі біоактивних

фосфонатів є також наявність молекулярного скафолду, що ковалентно утримує

один або кілька біоізостерних стосовно фосфотирозинового фрагменту

замісників, забезпечуючи тим самим формування специфічних взаємодій з

амінокислотними залишками в області активного центру та поза ним. В

дисертаційній роботі для конструювання нових інгібіторів РТРаз нами вперше

було використано тетраазамакроцикли – циклам і його структурні аналоги.

Головна ідея цього дослідження полягала в припущенні, що об’єднання двох

або більше α,α-дифтор-β-кетофосфонатних фрагментів на молекулярній

платформі тетраазамакроциклу забезпечить зростання інгібувальної здатності

та селективності дії інгібітора.

65

Інгібувальний вплив сполук 3.1-3.10 на активність ряду

протеїнтирозинфосфатаз (TC-PTP, PTP1B, SHP2, MEG2, PTPβ, CD45) було

вивчено in vitro з використанням pNPP як штучного субстрату. Оцінку

ефективності та селективності дії сполук здійснювали на основі значень IC50

(табл. 1), що були розраховані з дозозалежних кривих.

66

Таблиця 3.1.

Значення IC50 (мкМ) для похідних тетраазамакроциклів 3.3-3.10 як інгібіторів

протеїнтирозинфосфатаз*

Інгібі-

тор TC-PTP PTP1B SHP2 MEG2 PTPβ CD45

3.3 1100 ± 240 > 100 > 100 - > 100 670 ± 260

3.4 230 ± 67 750 ± 100 > 100 - > 100 > 100

3.5 110 ± 6,6 65 ± 16 86 ± 25 - 160 ± 48 35 ± 4

3.6 217 ± 47 270 ± 30 > 100 - > 100 780 ± 240

3.7 9,7 ± 1,6 105 ± 29 > 100 - > 100 > 100

3.8 0,075 ± 0,013 1,08 ± 0,29 87 ± 26 44 ± 6 34 ± 3 > 100

3.9 0,59 ± 0,15 4,04±0,13 27 ± 6 180 ± 18 53 ± 5 340 ± 90

3.10 0,091 ± 0,019 1,48 ± 0,08 137 ± 23 > 100 82 ± 23 > 100

*Концентрації pNPP була 2 мМ (PTP1B, TC-PTP), 7 мМ (SHP2), 6 мМ (MEG2), 1

мМ (PTPβ) та 5 мМ (CD45).

Порівняння інгібувальної здатності похідних 1,4,8,11-тетраазацикло-

тетрадекану (цикламу) 3.3-3.7 з замісниками різної хімічної природи свідчить

про наступне. Наявність двох фрагментів 1,1-дифтор-2-оксоетилфосфонової

кислоти в структурі інгібіторів 3.3-3.5 забезпечує інгібування TC-PTP, PTP1B і

CD45 в концентраційному діапазоні 1200 – 4000 мкМ. При цьому

малоактивною була сполука 3.3 з метильними замісниками. Однак, введення

бензильних замісників (інгібітор 3.4) замість метильних значно підвищило

спорідненість до TC-PTP. Похідна цикламу 3.5 з двома протилежно

розташованими 2-нафтилметильними фрагментами виявила кращу інгібувальну

здатність до всіх протестованих PTPаз, особливо щодо CD45. Очевидно,

наявність в хімічній структурі гідрофобних замісників забезпечує тісніші

контакти цього інгібітора з ензимом. Введення в структуру 3.6 чотирьох 1,1-

дифтор-2-оксоетилфосфонатних фрагментів не привело до значного збільшення

67

активності інгібітора. При цьому інгібування зростало при переході від сполуки

3.4 до сполуки 3.7 завдяки бензильному лінкеру між 1,1-дифтор-2-

оксоетилфосфонатним фрагментом і макроциклом. Біс-функціоналізована

похідна цикламу 3.7 демонструвала приблизно на порядок більшу активність

стосовно ТС-РТР з ІС50 9,7 мкМ, виявляючи при цьому значну селективність у

порівнянні з іншими РТРазами.

Рис. 3.1. Кінетика гідролізу pNPP, що її каталізує TC-PTP за наявності

сполуки 3.8. Концентрація інгібітора 0 (1), 0,05 мкМ (2), 0,1 мкМ (3), 3 мкМ (4).

Лінії тренду характеризують лінійність кінетичних кривих.

Тетракіс-заміщені похідні тетраазамакроциклів 3.8-3.10 з (1-оксо-2,2-

дифтор-2-фосфоно)етилбензильними замісниками продемонстрували найвищу

інгібувальну здатність відносно Т-клітинної протеїнтирозинфосфатази,

виявляючи значно меншу активність щодо PTP1B, PTPβ, MEG2, SHP2 та CD45.

68

Типовий кінетичний графік, що відображає вплив сполуки 3.8 на

активність TC-PTP, представлено на рис. 3.1. ІС50 для цієї сполуки складає

75 нМ. При цьому експерименти з модельною сполукою 3.1 свідчили про її

низьку спорідненість до РТРаз (значення IC50 понад 100 мкМ).

Немодифікований 1,4,8,11-тетраазациклотетрадекан 3.2 при концентрації 100

мкМ не виявляв інгібувального ефекту, а в деяких випадках навіть підвищував

активність ензиму. Ці дані вказують на те, що інгібувальні властивості сполук

3.8-3.10 є результатом об’єднання в одній структурі бензил-α,α-дифтор-β-

кетофос-фонатних фрагментів та тетраазамакроциклічної платформи.

Рис. 3.2. Селективність дії сполук 3.8 (А), 3.9 (Б) та 3.10 (В) на активність

ТС-РТР та РТР1В.

Інгібувальна здатність і селективність тетракіс-заміщених бензил-α,α-

дифтор-β-кетофосфонатних похідних тетраазамакроциклів 3.8-3.10 залежить

від розміру макроциклічного кільця. Найактивніша сполука 3.8, як інгібітор TC-

69

PTP виявилась в 14 разів селективнішою у порівнянні з PTP1B, в 900 разів – у

порівнянні з PTPβ та більше ніж у 1000 разів – у порівнянні з MEG2, SHP2, та

CD45. Заміна цикламної платформи на цикленову (сполука 3.9) привела до

зниження інгібувальної активності відносно TC-PTP та PTP1B приблизно в 7 та

4 рази, відповідно. Однак, розширення поліамінного циклу у разі сполуки 3.10

мало незначний вплив на інгібувальні властивості інгібітора. Селективність

сполук 3.8-3.10 як інгібіторів TC-PTP та PTP1B графічно представлена на

рис. 3.2.

Коефіцієнти Хіла, розраховані з дозозалежних кривих інгібування TC-

PTP та PTP1B (рис. 3.3 та 3.4) становлять 0,74 ± 0,22 та 1,04 ± 0,52 для сполуки

3.8 та 0,89 ± 0,18 та 0,79 ± 0,19 для сполуки 3.10, відповідно, що свідчить про

залученість одного центру зв’язування у механізмах інгібування TC-PTP та

PTP1B.

Рис. 3.3. Дозозалежне інгібування TC-PTP (○) та PTP1B (□) сполукою 3.8.

pNPP було використаний як субстрат.

70

Рис. 3.4. Дозозалежне інгібування TC-PTP (○) та PTP1B (□) сполукою

3.10. pNPP було використаний як субстрат.

Рис. 3.5. Інгібування TC-PTP сполукою 3.8 при концентрації 0 (■), 0,02

мкM (◊), 0,04 мкM (▲), 0,08 мкM (○). Значення r2 становлять 0,999, 0,993, 0,999

та 0,937, відповідно.

Графік Лайнуівера-Берка (рис. 3.5), побудований на основі кінетичних

даних інгібування TC-PTP за наявності макроциклу 3.8, узгоджується з

71

конкурентним механізмом стосовно субстрату. В такому разі тип інгібування

описується схемою 3.1. Розрахована константа інгібування складає 57 ± 7 нМ.

Схема 3.1.

Методом молекулярного докінгу встановлено, що сполука 3.8 може

локалізуватись в області активного центру TC-PTP з відкритою (модель А; рис.

3.6) та закритою (модель Б; рис. 3.7) WPD-петлею з енергіями зв’язування -9,6

ккал/моль та -6,9 ккал/моль, відповідно. Характеристика найважливіших

зв’язків, що забезпечують стабілізацію можливих ензим-інгібіторних

комплексів, наведена в табл 3.2.

Рис. 3.6. Модель (А) зв’язування сполуки 3.8 в області активного центру

TC-PTP з відкритою WPD-петлею (PDB код ензиму, що його було використано

для докінгу, 1L8K).

72

Рис. 3.7. Модель (Б) зв’язування сполуки 3.8 в області активного центру

TC-PTP з закритою WPD-петлею (змодельована кристалічна структура ензиму

була використана для докінгу).

В енергетично вигіднішому випадку (модель А; рис. 3.6), коли WPD-

петлю знаходиться у відкритому положенні, інгібітор накриває активний центр

ензиму, обмежуючи доступ субстрату до каталітично важливих амінокислотних

залишків. При цьому бензил-α,α-дифтор-β-кетофосфонатні замісники

утворюють численні водневі зв’язки з Arg47, Lys122, Trp180, Phe183, Gly184,

Arg222, Gln260 і Gln264. Додаткові взаємодії спостерігалися між атомами

фтору інгібітора та Val51 і Ile220. Внутрішньомолекулярна контакти між

ароматичними кільцями замісників тетраазамакроциклу допомагає

стабілізувати конформацію інгібітора. У випадку моделі Б (рис. 3.7) ліганд

формує водневі зв’язки з Arg49, Asp50, Asp182, Gln260. Ця модель цікава

наявністю зв’язків з мотивом YRD, що може певною мірою пояснити

селективне інгібування Т-клітинної протеїнтирозинфосфатази тетра-

заміщеними бензил-α,α-дифтор-β-кетофосфонатними похідними тетрааза-

макроциклів [353].

73

Таблиця 3.2.

Характеристика найважливіших зв’язків, що формують ензим-інгібіторні

комплекси TC-PTP зі сполукою 3.8

Донор (D)

зв’язку

Акцептор (A)

зв’язку Дистанція, Å

Кут DHA,

град

Кут HAY,

град

Модель А

Arg47 Ліганд 2,71 154,4 117,3

Arg114 Ліганд 1,83 174,9 155,1

Lys122 Ліганд 2,12 145,7 131,7

Trp180 Ліганд 2,45 136,9 94,5

Trp180 Ліганд 2,52 122,4 91,9

Phe183 Ліганд 3,16 122,7 135,4

Gly184 Ліганд 1,88 154,0 159,8

Arg222 Ліганд 2,20 165,2 97,9

Arg222 Ліганд 2,15 148,0 109,4

Gln260 Ліганд 2,28 134,6 148,0

Gln264 Ліганд 2,09 124,9 115,8

Gln264 Ліганд 2,25 135,5 116,0

Модель Б

Arg49 Ліганд 2,46 132,9 99,9

Asp50 Ліганд 2,22 146,5 134,6

Arg114 Ліганд 1,74 177,0 157,7

Asp182 Ліганд 2,09 134,3 142,1

Arg222 Ліганд 2,37 147,9 108,4

Gln260 Ліганд 3,13 148,6 162,0

Молекулярний докінг макроциклічного інгібітора 3.8 в область активного

центру ТС-РТР свідчить про його фіксацію за участю Arg114, тоді як утворення

подібного зв’язку в структурі PTP1B з відповідним Arg112 ускладнюється через

74

стеричні перешкоди амінокислотних залишків R-петлі. Це вказує на те, що

однією з причин селективної дії тетракіс-заміщених бензил-α,α-дифтор-β-

кетофосфонатних похідних тетраазамакроциклів на активність TC-PTP у

порівнянні з впливом на PTP1B може бути різне взаємне розташування WPD-

та R-петлі в структурі TC-PTP та відповідних петель в структурі PTP1B (рис.

3.8 та 3.9, відповідно) [42]. Хоча автори роботи [42] і відзначають, що дане

положення зазначених петель може бути зумовлено кристалізацію, проте, не

варто виключати, що причиною цього може бути і дещо змінений

амінокислотний склад ензиму.

Рис. 3.8. Молекулярна поверхня області активного центру TC-PTP (PDB

код рентгеноструктурного кристалу 1L8K).

75

Рис. 3.9. Молекулярна поверхня області активного центру PTP1B (PDB

код рентгеноструктурного кристалу 1NL9).

Для з’ясування причин селективності похідних тетраазамакроциклів як

інгібіторів протеїнтирозинфосфатаз ми порівняли гідрофільність області

активного центру РТР1В, TC-PTP, PTPβ, SHP2 та CD45 (табл. 3.3). Сумарне

значення LogP областей молекулярної поверхні ензимів, відповідальних за

зв’язування субстрату (рTyr-розпізнаючої петлі, Q-петлі, WPD-петлі, PTP- петлі

та R-петлі), добре узгоджується зі значеннями IC50 сполук 3.8-3.10. Ймовірно,

що такий вплив цих інгібіторів пов'язаний з площинною структурою

макроциклічної платформи та чотирма рівноцінними функціональними

групами, закріпленими на ній. Якщо припустити, що ці сполуки зв’язуються

приблизно однаково в області активних центрів ензимів, то їх селективність

76

залежить від заряду амінокислотних залишків, з якими взаємодіють бензил-α,α-

дифтор-β-кетофосфонатні замісники.

Таблиця 3.3.

Розраховані значення LogP каталітично важливих петель досліджуваних

ензимів*

Ензим

Області розташування амінокислотних залишків, що були

використані для обчислення LogP № п/п

за знач.

LogP***

рTyr-

петля Q-петля

WPD-

петля

PTP-

петля R-петля

Сума Послідовність амінокислот

**

40-50 260-270 176-185 211-220 116-125

TC-PTP -13,38 -5,58 -0,27 -4,76 -3,38 -27,37 1

PTP1B -12,6 -6,01 -0,27 -4,32 -3,23 -26,43 2

PTPβ -10,32 -2,74 0,17 -6,28 -4,52 -23,69 3

SHP2 -9,11 -4,29 -1,33 -4,32 -4,29 -23,34 4

CD45 -8,11 -0,93 -1,77 -4,32 -7,11 -22,24 5

*Розрахунок здійснено за допомогою програми MarvinSketch.

**Амінокислотні

послідовності областей активних центрів ензимів, що мають значення для

зв’язування субстрату чи інгібітора. ***

Порядок цифр відображає зменшення

гідрофільності області активного центру ензимів.

Таким чином, однією з умов селективної дії похідних

тетраазамакроциклів 3.8-3.10 може бути характер молекулярної поверхні

області активного центру протеїнтирозинфосфатаз. Це також підтверджується

тим фактом, що сполука 3.5, яка у своїй структурі має два фрагменти 1,1-

дифтор-2-оксоетилфосфонової кислоти та дві 2-нафтилметильні групи, краще

інгібує CD45 відповідно до даних табл. 3.1. Проте, в цьому випадку не

77

спостерігається кореляція, як у випадку похідних тетраазамакроциклів 3.8-3.10,

а зменшення інгібувального впливу відбувається в такій послідовності:

CD45 > PTP1B > SHP2 > TC-PTP > PTPβ.

Очевидно, що похідна 3.5 при зв’язуванні з молекулярними поверхнями

різних РТРаз набуває різних конформацій або має різний механізм інгібування,

що не дає можливості оцінити вклад гідрофобних та гідрофільних взаємодій

інгібітора з областями активних центрів різних ензимів.

Підсумовуючи викладений у цьому розділі матеріал, слід зазначити, що

тетраазамакроцикли, відомий клас сполук, похідні яких характеризуються

широким спектром біологічних активностей, можуть бути молекулярними

платформами для дизайну інгібіторів РТРаз. Серед них циклам з чотирма

бензил-α,α-дифтор-β-кетофосфонатними замісниками (сполука 3.8) може

ефективно інгібувати активність TC-PTP з IC50 75 нМ. Порівняння з іншими

тетраазамакроциклічними інгібіторами показало, що інгібувальний ефект

обумовлений наявністю в структурі молекули біоізостерних фосфонатних

фрагментів та макроциклічного поліамінного кільця. Кінетичні дані та

результати докінг-дослідження припускають, що інгібітор 3.8 може

зв'язуватись в області активного центру TC-PTP з відкритою WPD-петлею,

запобігаючи формуванню ензим-субстратного комплексу. Крім того,

результати свідчать, що інгібітори TC-PTP на основі цикламу та циклену з

чотирма бензил-α,α-дифтор-β-кетофосфонатними фрагментами є значно

селективнішими у порівнянні з впливом на PTP1B, CD45, SHP2 та PTPβ. Це

дослідження відкриває шлях до синтезу і дизайну специфічних інгібіторів

PTPаз на основі поліазамакроциклів, що могли б забезпечувати регуляцію

сигнальних шляхів в живих клітинах.

78

РОЗДІЛ 4

ПОХІДНІ ФУЛЕРЕНІВ ЯК НОВИЙ КЛАС ІНГІБІТОРІВ

ПРОТЕЇНТИРОЗИНФОСФАТАЗ

4.1. КАРБОКСИЛАТНІ ПОХІДНІ ФУЛЕРЕНІВ ЯК ІНГІБІТОРИ

ПРОТЕЇНТИРОЗИНФОСФАТАЗ

Результати виконаного нами дослідження фосфонатних похідних

тетраазамакроциклів (розділ 3) демонструють їх потенціал як селективних

інгібіторів ТС-РТР, що визначається як природою біоізостерних замісників, так

і структурою макроциклу. Слід зазначити, що селективне інгібування РТР1В

спостерігалося у випадку фосфонатних похідних на платформі калікс[4]аренів

[2]. Тому був значний інтерес до вивчення інгібіторів РТРаз на основі інших

об'ємних органічних скафолдів, таких як фулерени.

З літературних джерел відомо, що похідні фулерену інгібують цистеїнові,

серинові та аспарагінові протеази [240]. Завдяки гідрофобним та

електростатичним властивостям фулеренового ядра немодифікований C60

впливає на глутатіон-S-трансферазу шляхом алостеричної модифікації ензиму

[354]. Малонатні похідні C60 демонструють інгібувальний вплив на три

ізоформи NO-синтази (нейрональну, ендотеліальну та цитокін-індуковану)

[355], глутатіонредуктазу [356] та taq ДНК-полімеразу [357]. Крім того, вони

сильніше за полігідроксильований фулерен пригнічують активність M-MuLV-

зворотньої транскриптази [358]. Катіонні ізомери біс-N,N-

диметилфулеропіролідиніуму виявилися неконкурентними інгібіторами

ацетилхолінестерази [359]. Амфіфільні похідні фулеренів є ефективними

інгібіторами карбоангідрази зі значенням ІС50 в діапазоні від субмікромолярної

до низької мікромолярної концентрації [360], а поліглікозильовані фулерени

виявляли активність стосовно ліпосахаридної гептозилтрансферази WaaC [361].

79

Полікарбоксильована похідна C60 показала інгібувальний вплив на

моноамінооксидазу В, активність якої відіграє важливу роль у розвитку

хвороби Альцгеймера [362]. Разом з тим, вплив похідних фулеренів на

активність терапевтично важливих протеїнтирзинфосфатаз до цього часу не був

досліджений.

Співрозмірність області каталітичної кишені, що формується на окремих

етапах каталізу РТРазами, та фулеренових наночастинок дозволяє розглядати їх

як молекули, що могли б впливати на активність цих ензимів. Очевидно,

структури інгібіторів РТРаз на платформі фулеренів мають включати

аніоногенні групи. Водорозчинними фулеренами, які вивчалися нами, були

пірролідино[60]фулерен-трис-карбонова кислота (4.1), [60]фулерен-пентакіс-

фенілацетат натрію (4.2) та [70]фулерен-октакіс-фенілпропіонат калію (4.3), що

відрізняються залишками карбонових кислот і природою фулеренового

каркасу. При аналізі інгібувальної активності сполук 4.1-4.3 використовували

флуорогенний субстрат 4-MUP.

80

*Діаграма Шлегеля подана для похідної фулерену С70.

Як видно з табл. 4.1 та рис. 4.1, ці сполуки виявились сильними

інгібіторами РТРаз зі значенням IC50 в низькомікромолярному діапазоні.

Таблиця 4.1.

Значення IC50 (мкМ) похідних фулерену 4.1-4.3 як інгібіторів

протеїнтирозинфосфатаз*

Інгібітор CD45 PTP1B TC-PTP SHP2 PTPβ

4.1 0,081 ± 0,021 0,20 ± 0,05 0,96 ± 0,12 0,23 ± 0,02 0,36 ± 0,04

4.2 0,064 ± 0,015 0,20 ± 0,03 1,40 ± 0,40 0,20 ± 0,03 0,63 ± 0,06

4.3 0,014 ± 0,004 0,31 ± 0,04 0,18 ± 0,04 0,11 ± 0,02 0,56 ± 0,06

*Концентрація 4-MUP була 0,3 мМ (PTP1B, TC-PTP), 0,2 мМ (PTPβ), 0,8 мМ

(CD45) і 0,7 мМ (SHP2).

Як видно з табл. 4.1, інгібувальний профіль для сполук 4.1-4.3 є

переважно подібним, що дає можливість розглядати функціоналізовані

фулерени як інгібітори CD45 зі зниженим впливом на PTP1B, SHP2, PTPβ та

TC-PTP. Селективність інгібування CD45 складає 10-20 разів відносно TC-PTP

81

та 5-40 разів у порівнянні з впливом на PTPβ. При цьому у порівнянні з PTP1B

та SHP2 похідні 4.1 та 4.2 продемонстрували малу селективність. Однак,

інгібування CD45 похідною [70]фулерену 4.3 виявилось в 8 і 20 разів

ефективнішим, ніж інгібування SHP2 та PTP1B, відповідно.

Рис. 4.1. Селективність сполук 4.1 (А), 4.2 (Б) та 4.3 (В) як інгібіторів

протеїнтирозинфосфатаз.

Коефіцієнти Хіла, розраховані з дозозалежних кривих інгібування

активності TC-PTP, CD45 та PTP1B похідною фулерену 4.1 (рис. 4.2)

становлять 1,34 ± 0,24, 1,34 ± 0,28 та 1,10 ± 0,23, відповідно. Це вказує на те, що

у випадку PTP1B тільки один центр зв’язування може бути залучений до

механізму інгібування, тоді як у випадку CD45 та TC-PTP їх ймовірно два.

Графік інгібування активності PTP1B похідною фулерену 4.1 в

координатах Лайнуівера-Берка (рис. 4.3) описується закономірностями

конкурентного механізму зі значенням Ki 0,19 ± 0,03 мкМ. Цей механізм

включає облаштування наночастинки в області активного центру

82

протеїнтирозинфосфатази, що відповідає інгібуванню ензиматичної реакції за

схемою 4.1.

Рис. 4.2. Дозозалежна крива інгібування CD45 (∆), PTP1B (○) і TC-PTP

(□) сполукою 4.1. 4-MUP було використано як субстрат.

Рис. 4.3. Інгібування PTP1B сполукою 4.1 при концентрації 0 (▲),

0,1 мкM (∆), 0,2 мкM (●), 0,3 мкM (○). Значення r2 знаходиться в межах 0,98-

0,99.

83

Схема 4.1.

Комп’ютерне моделювання ензим-інгібіторних комплексів показало, що

відкрита конформація PTP1B (PDB код 1NL9) є сприятливішою для зв’язування

фулеренової молекули, ніж закрита (PDB код 2CM8). У разі кристалу 1NL9 з

відкритою WPD-петлею піролідино[60]фулерен-трис-карбонова кислота 4.1

займає широку впадину області активного центру ензиму. Розрахована енергія

докінгу (∆Gdoc) становить -8,78 ккал/моль та -10,65 ккал/моль для моделей А та

Б, зображених на рис. 4.4 та 4.5, відповідно. Характеристику найважливіших

зв’язків, що реалізуються в цих моделях, наведено в табл. 4.2.

Рис. 4.4. Модель (А) зв’язування похідної фулерену 4.1, що орієнтується

карбоксилатними замісниками до каталітично важливих амінокислотних

залишків в області активного центру PTP1B з відкритою WPD-петлею (PDB код

ензиму, що його було використано для докінгу, 1NL9). Подвійні зв’язки

фулеренового каркасу відображено як одинарні.

84

Згідно моделі А, карбоксилатні групи інгібітора спрямовані до Cys215 та

формують водневі зв’язки з Ser216, Ala217, Gly220 та Arg221. Фулеренове ядро

наближено до Tyr46 та Lys120.

Рис. 4.5. Модель (Б) зв’язування похідної фулерену 4.1, що орієнтується

фулереновим ядром до каталітично важливих амінокислотних залишків в

області активного центру PTP1B з відкритою WPD-петлею (PDB код ензиму,

що його було використано для докінгу, 1NL9). Подвійні зв’язки фулеренового

каркасу відображено як одинарні.

В енергетично вигіднішій моделі Б взаємодія фулеренового каркасу з

Tyr46, Lys116, Ala217 та Gln262 забезпечує більшу стабільність ензим-

інгібіторного комплексу, тоді як карбоксильні групи сполуки 4.1 формують

водневі зв’язки з Arg221, Gln183 та Gln266.

Невідповідність поміж ∆Gdoc та кількістю представлених зв’язків в табл.

4.2 для моделей А та Б (енергія докінгу вища, а кількість зв’язків менша),

ймовірно, обумовлено тим, що фулеренове ядро має суттєвий вплив на

зв’язування інгібітора в області активного центру РТР1В. Так, в моделі А

положення структурного фрагмену С60 сполуки 4.1 є вимушеним через

85

орієнтацію замісниками до каталітично важливого Cys215. Це, очевидно,

зумовлює певні стеричні та електростатичні утруднення, що, відповідно, веде

до зростання енергії ензим-інгібіторного комлексу. У випадку моделі Б, докінг

відбувся в звичайному режимі, що дозволило фулереновому ядру зайняти

енергетично вигідніше положення.

Таблиця 4.2.

Характеристика найважливіших водневих зв’язків в модельних ензим-

інгібіторних комплексах PTP1B зі сполукою 4.1

Донор (D)

зв’язку

Акцептор (A)

зв’язку Дистанція, Å

Кут DHA,

град

Кут HAY,

град

Модель А

Ser216 Ліганд 1,98 142,5 143,9

Ala217 Ліганд 1,68 167,5 135,7

Gly218 Ліганд 2,66 148,7 114,0

Ile219 Ліганд 2,65 152,3 109,4

Gly220 Ліганд 1,92 146,9 113,6

Arg221 Ліганд 2,02 164,1 96,0

Arg221 Ліганд 1,96 155,7 96,2

Модель Б

Lys116 Ліганд 1,93 145,1 56,6

Gly183 Ліганд 1,91 157,2 100,9

Arg221 Ліганд 1,81 143,3 117,3

Також необхідно зазначити, що положення фулеренового ядра інгібітора

4.1 в області активного центру РТР1В в моделях А та Б практично однакове, з

відхиленням, що становить приблизно 3 Å (рис. 4.6). Вірогідно, це зумовлено

наявністю гідрофобної області поміж залишками амінокислот Tyr46 та Gln262.

У такому положенні фулеренове ядро, що характеризується значною

86

гідрофобністю, не зазнає значного відштовхування з боку заряджених

амінокислотних залишків, що формують активний центр ензиму.

Рис. 4.6. Порівняння положення похідної 4.1 в області активного центру

РТР1В в залежності від способу орієнтації.

Типовий кінетичний графік, що відображає вплив сполуки 4.1 на

активність CD45, представлено на рис. 4.7. Механізм інгібування ензиму

описується закономірностями змішаного типу (рис. 4.8). При цьому значення

константи інгібування Ki є більшим від значення Ki´, що свідчить про

переважання неконкурентної складової інгібування над конкурентною.

87

Рис. 4.7. Кінетика гідролізу pNPP, що її каталізує CD45 за наявності

сполуки 4.1. Концентрація інгібітора 0 (1), 0,08 мкМ (2).

Рис. 4.8. Інгібування активності CD45 фулереном 4.1 при концентрації

0 (♦) та 0,08 мкМ (○). Значення r2 знаходиться в межах 0,98-0,99.

88

Для знаходження можливих сайтів зв’язування піролідино[60]фулерен-

трис-карбонової кислоти 4.1 на молекулярній поверхні CD45 нами було

проведено докінг-дослідження, що передбачало докування молекули інгібітора

по всій поверхні ензиму. Таким чином було отримано по 3415 ензим-

інгібіторних комплексів для відкритої та закритої конформації CD45, що були

ієрархічно кластеризовані в 30 найбільш відмінних груп за областю локалізації

та орієнтацією на молекулярній поверхні ензиму. Кожен кластер було оцінено

за рівнем об’єднання, середньоквадратичним відхиленням атомних позицій

(RMSD) та кількістю ензим-інгібіторних комплексів в ньому. Результати

проведеного молекулярного докінгу представлено в табл. 4.3 та 4.4.

Таблиця 4.3.

Аналіз результатів докування сполуки 4.1 в модельну структуру CD45-D1

№ п/п

кластеру

Рівень

об’єднання

(RMSD), Å*

Середнє

значення

RMSD, Å**

Кількість ензим-

інгібіторних комплексів

в кластері

∆Gdoc***

1 7,324 4,061 1177 -10,06

2 6,539 3,151 945 -9,28

3 6,144 3,521 150 -8,9

4 7,239 2,181 139 -8,74

5 7,436 4,967 173 -8,74

6 6,067 3,078 270 -8,68

7 5,644 3,303 36 -7,59

8 6,632 3,818 13 -7,29

9 5,448 3,788 3 -6,93

10 5,957 2,153 35 -6,7

11 6,451 4,239 26 -6,67

12 7,314 4,299 155 -6,67

89

Продовження табл. 4.3.

№ п/п

кластеру

Рівень

об’єднання

(RMSD), Å*

Середнє

значення

RMSD, Å**

Кількість ензим-

інгібіторних комплексів

в кластері

∆Gdoc***

13 5,557 3,288 12 -6,62

14 5,822 3,034 12 -6,51

15 6,129 3,831 6 -6,48

16 7,121 3,749 22 -6,44

17 7,441 2,502 17 -6,44

18 6,773 3,596 137 -6,37

19 6,442 3,813 22 -6,27

20 7,573 4,755 9 -6,2

21 0,441 0,34 3 -6,11

22 6,443 3,929 40 -6,06

23 2,548 2,548 2 -6,03

24 1,889 1,889 2 -6

25 6,74 6,74 2 -5,99

26 0 0 1 -5,97

27 0 0 1 -5,78

28 7,26 5,416 4 -5,5

29 0 0 1 -5,41

30 0 0 1 -5,35

*Відстань між двома кластерами, що утворюють наступний кластер, 0 якщо це

початковий кластер з одним докінгом. **

Відстань від центроїду до всіх інших

конформацій ліганду в кластері. ***

Найнижча енергія докінгу в кластері.

Результати докінг-дослідження, проведеного з модельною структурою

домену 1 CD45 (табл. 4.3), свідчать, що є дві найвірогідніші моделі зв’язування

90

піролідино[60]фулерен-трис-карбонової кислоти 4.1 на молекулярній поверхні

ензиму (кластери за порядковим номером 1 та 2). Проте більш імовірним є

перший кластер, що вміщує 1177 ензим-інгібіторних комплексів та має

найнижчу енергію докінгу. В такому разі інгібітор займає область впадини

активного центру ензиму та блокує утворення ензим-субстратного комплексу за

конкурентним механізмом згідно схеми 4.1.

Таблиця 4.4.

Аналіз результатів докування сполуки 4.1 в каталітично активний домен 1

CD45, що має закриту WPD-петлю (PDB код кристалу 1YGR)

№ п/п

кластеру

Рівень

об’єднання

(RMSD), Å*

Середнє

значення

RMSD, Å**

Кількість ензим-

інгібіторних комплексів

в кластері

∆Gdoc***

1 5,66 3,43 2438 -10,44

2 5,803 3,358 67 -8,73

3 5,493 2,752 23 -8,49

4 5,503 2,516 12 -8,05

5 5,554 3,473 238 -7,94

6 5,491 3,177 13 -7,71

7 1,88 1,177 11 -7,6

8 5,607 3,159 55 -7,58

9 5,99 3,462 16 -7,44

10 5,778 2,935 107 -7,41

11 6,401 3,231 109 -7,37

12 4,239 1,04 64 -7,35

13 5,628 3,223 66 -7,09

14 3,66 1,167 21 -7,07

15 6,471 3,313 36 -6,94

91

Продовження табл. 4.4.

№ п/п

кластеру

Рівень

об’єднання

(RMSD), Å*

Середнє

значення

RMSD, Å**

Кількість ензим-

інгібіторних комплексів

в кластері

∆Gdoc***

16 5,674 2,82 12 -6,84

17 1,64 0,719 9 -6,82

18 5,474 3,164 4 -6,81

19 6,497 3,801 15 -6,81

20 5,635 4,252 4 -6,79

21 5,55 2,703 17 -6,7

22 6,179 4,268 8 -6,69

23 6,107 1,919 8 -6,59

24 4,767 1,979 34 -6,58

25 4,984 2,08 13 -6,48

26 5,669 2,579 5 -6,47

27 0,631 0,631 2 -6,39

28 4,995 3,208 5 -6,18

29 5,242 5,242 2 -5,42

30 0 0 1 -5,2

*Відстань між двома кластерами, що утворюють наступний кластер, 0 якщо це

початковий кластер з одним докінгом. **

Відстань від центроїда до всіх інших

конформацій ліганду в кластері. ***

Найнижча енергія докінгу в кластері.

В свою чергу, результати докінг-дослідження, проведеного з доменом 1

кристалу 1YGR (табл. 4.4) свідчать, що інгібітор 4.1 на молекулярній поверхні

закритої конформації ензиму має один центр зв’язування, що розташований в

області R-петлі (Thr727-Arg734). Зв’язування інгібітора в цій області може

суттєво вплинути на рух WPD-петлі та знизити каталітичну активність ензиму

за неконкурентною скаладовою механізму інгібування (схема 4.2).

92

Схема 4.2.

Отже, результати розрахунків методом молекулярного докінгу,

представлені в табл. 4.3 та 4.4, свідчать, що інгібітор може зв'язуватись в

активному центрі каталітичного домену CD45 з відкритою WPD-петлею та в

додатковому центрі в області R-петлі (Thr727-Arg734) з енергіями

зв’язування -10,06 ккал/моль та -10,44 ккал/моль, відповідно. Характеристика

найважливіших зв’язків, що відповідають за стабілізацію наведених ензим-

інгібіторних комплексів, подано в табл. 4.5.

Рис. 4.9. Модель (А) зв’язування сполуки 4.1 в області активного центру

протеїнтирозинфосфатази CD45 (змодельована автором структура ензиму була

використана для докування; нумерація амінокислотних залишків наведена у

відповідності до їх номера в кристалі 1YGR). Подвійні зв’язки фулеренового

каркасу відображено як одинарні.

93

Облаштовуючись в область активного центру, карбоксилатні групи

піролідино[60]фулерен-трис-карбонової кислоти 4.1 (рис. 4.9) формують

водневі зв’язки з Trp794, Gly798 та Gln876, а фулеренове ядро утримується

силами Ван-дер-Вальса і електростатичними взаємодіями в області Tyr658,

Glu731, Asp796, Ser829, Arg834, Gln872 та інших амінокислотних залишків. У

випадку моделі Б (рис. 4.8) замісники сполуки 4.1 формують водневі зв’язки з

Trp741, Met744 та Arg763, а фулеренова наночастинка розміщується біля

Arg728, Cys729, Glu730, Glu739, Trp741, Ile768 та Thr792.

Рис. 4.7. Модель (Б) зв’язування сполуки 4.1 в області R-петлі

протеїнтирозинфосфатази CD45 (PDB код ензиму, що був використаний для

докування, 1YGR). Подвійні зв’язки фулеренового каркасу відображено як

одинарні.

94

Таблиця 4.5.

Характеристика найважливіших зв’язків в модельному ензим-інгібіторному

комплексі CD45 зі сполукою 4.1

Донор (D)

зв’язку

Акцептор (A)

зв’язку Дистанція, Å

Кут DHA,

град

Кут HAY,

град

Модель А

Trp724 Ліганд 2,01 137,0 131,4

Trp724 Ліганд 2,80 138,3 143,4

Gly798 Ліганд 1,90 167,5 166,5

Gln876 Ліганд 2,15 157,1 90,0

Модель Б

Trp741 Ліганд 1,96 146,5 106,2

Met744 Ліганд 2,00 158,5 90,5

Arg763 Ліганд 1,71 139,6 145,2

Arg763 Ліганд 1,66 138,6 105,7

Дослідження ряду інших полікарбоксильованих похідних фулерену C60

4.4-4.11 з використанням pNPP як штучного субстрату продемонструвало

інгібувальні ефекти, подібні до впливу сполук 4.1-4.3.

95

Таблиця 4.6.

Значення IC50 (мкМ) полікарбоксильованих фулеренів 4.4-4.11 як

інгібіторів протеїнтирозинфосфатаз*

Інгібітор CD45 PTP1B SHP2

4.4 0,12 ± 0,03 0,27 ± 0,06 0,42 ± 0,1

4.5 0,68 ± 0,16 0,89 ± 0,22 1,92 ± 0,19

4.6 0,17 ± 0,05 0,24 ± 0,04 1,83 ± 0,33

4.7 0,05 ± 0,01 0,32 ± 0,06 0,38 ± 0,09

4.8 0,20 ± 0,02 1,06 ± 0,20 7,54 ± 0,89

4.9 0,79 ± 0,19 0,94 ± 0,25 1,24 ± 0,18

4.10 1,26 ± 0,08 2,20 ± 0,42 2,18 ± 0,62

4.11 0,12 ± 0,02 0,97 ± 0,13 2,67 ± 0,27

*Концентрація pNPP складала 5 мМ (CD45), 2 мМ (PTP1B) та 7 мМ (SHP2).

Згідно результатів табл. 4.6, похідні фулеренів 4.4-4.11 селективно

інгібують CD45 та проявляють порівняно знижену активність стосовно PTP1B

та SHP2. Похідна 4.7 показала найкращий інгібувальний вплив на CD45, проте

дія сполуки 4.11, що в молекулярній структурі вміщує п’ять фрагментів

96

феноксимасляної кислоти, була селективнішою. Похідні фулерену 4.4, 4.5, 4.9

та 4.10 показали співмірну активність проти CD45, PTP1B та SHP2. В той же

час сполуки 4.7, 4.8, та 4.11 виявились в 5-8 разів селективнішими стосовно

PTP1B та в 7-35 разів селективнішими у порівнянні з впливом на SHP2. Крім

того, похідні 4.4-4.11 були в 10-70 разів селективніші відносно TC-PTP та PTPβ.

Рис. 4.8. Селективність дії інгібіторів 4.4 (А), 4.7 (Б) та 4.8 (В) в

залежності від зміни ароматичної частини заміника.

Аналіз рядів сполук 4.4-4.6 та 4.9-4.11 свідчить, що похідні фулерену 4.5

та 4.10, які містять в молекулярній структурі фрагменти пропіонової кислоти,

виявляють дещо знижену інгібувальну здатність стосовно CD45 та PTP1B.

Інгібувальна дія інгібіторів CD45 з фрагментами фенілоцтової кислоти (4.4),

нафтилоцтової кислоти (4.7) та біфенілоцтової кислоти (4.8), виявилась спів-

мірною (рис. 4.8). Однак, заміна фенільної частини в структурі похідної 4.4 на

біфенільну (сполука 4.8) значно понизила спорідненість інгібітора до SHP2.

97

Таблиця 4.7.

Значення IC50 (мкМ) похідних фулерену 4.12-4.15 як інгібіторів

протеїнтирозинфосфатаз*

Інгібітор CD45 PTP1B SHP2 TC-PTP PTPβ

4.12 1,1±0,20 0,42±0,07 0,57±0,06 3,0±0,56 2,9±0,87

4.13 0,62±0,14 0,28±0,01 0,57±0,09 2,5±0,59 5,8±0,75

4.14 0,07±0,01 0,12±0,01 0,08±0,01 0,23±0,05 0,72±0,02

4.15 0,05±0,01 0,07±0,01 0,25±0,02 0,46±0,06 0,55±0,15

*Концентрації pNPP були 5 мМ (CD45), 2 мМ (PTP1B, TC-PTP), 7 мМ (SHP2) та

1 мМ (PTPβ).

Подібність профілей інгібування для ряду фулеренів 4.4-4.11, а також 4.1-

4.3 вказує на те, що фулеренове ядро може відігравати важливу роль у взаємодії

з тим чи іншим ензимом, тоді як замісники різної хімічної природи у більшості

98

випадків забезпечують лише незначний вплив на селективність. Це

підтверджується тим, що похідні 4.12-4.15, які на фулереновому каркасі містять

замісники іншої хімічної природи, ніж у сполук 4.1-4.11, характеризуються

схожим інгібуючим потенціалом (табл. 4.7). Серед них похідні фосфонових

кислот вміщують фосфонатні групи, що моделюють моноалкілфосфатні

фрагменти фосфатаз. Однак фосфонатна похідна 4.12 та аміноетилфосфонатна

похідна 4.13 виявилися тільки вдвічі кращими інгібіторами PTP1B ніж CD45,

що свідчить про незначний вплив таких замісників на селективність дії

аніоногенних похідних фулеренів.

Порівнявши структури РТР1В та CD45, ми встановили, що області їх

активних центрів значно відрізняються за характером молекулярної поверхні.

Аліфатичні і неполярні залишки оточують впадину активного центру CD45,

створюючи таким чином середовище, значно відмінне від аналогічної області в

структурі РТР1В, що оточена зарядженими залишками аргініну і лізину [363].

Загалом, область активного центру CD45 не так позитивно заряджена, як у

РТР1В [117] і тому є більш сприятливою для зв’язування гідрофобного

фулеренового фрагменту молекули інгібітора. Встановлено, що зниження

гідрофобної характеристики областей активних центрів РТРаз відбувається в

ряду (згідно даних табл. 3.1): CD45 > SHP2 > PTPβ > PTP1B > TC-PTP. Ця

послідовність певною мірою узгоджується зі зниженнями інгібувального

впливу похідної фулерену 4.1 на ензиматичну активність протеїнтирозин-

фосфатаз (табл. 4.1). Як припускалося в розділі 3, відхилення від такої

залежності може бути пов’язано з різним типом інгібування ензимів. Таким

чином, поверхневі особливості протеїнтирозинфосфатаз можуть бути суттєвим

фактором у механізмах, що забезпечують селективність інгібування CD45

похідними фулерену.

99

4.2. ПОРІВНЯННЯ IN SILICO ІНГІБУВАЛЬНОЇ ЗДАТНОСТІ

РЯДУ ПОХІДНИХ ФУЛЕРЕНУ С60

Вище було продемонстровано, що похідні фулеренів здатні ефективно

інгібувати протеїнтирозинфосфатази, зокрема CD45 [321, 322]. Замісники

фулеренового каркасу і фулеренове ядро можуть певною мірою впливати на

інгібувальну спроможність функціоналізованих наночастинок до тієї чи іншої

РТРази. Можливо, що дослідження широкого спектру відомих на даний час

фулеренових похідних дозволить знайти нові, більш ефективні і селективні

інгібітори цих ензимів. Однак, арсенал відомих синтезованих похідних С60 є

досить великий, і на даний час організувати такий затратний скринінг in vitro

неможливо. Тому практичний інтерес набувають результати теоретичних

досліджень, в тому числі прогнозування біоактивності за допомогою методу

молекулярного докінгу.

Наш поступ у цьому напрямі був сфокусований на вивченні in silico

(AutoDock 4.2) комерційно доступних фулеренів С60 4.16-4.21 (каталог “Sigma-

Aldrich”).

100

Результат докінгу (рис. 4.9) свідчать, що всі протестовані in silico сполуки

з більшою або меншою ефективністю можуть облаштовуватись в область

активного центру CD45, окрім похідної 4.18. Очевидно це пов’язано з тим, що

основний вклад в інгібування похідними С60 належить фулереновому ядру, а

наявність двох протилежно розташованих замісників, безсумнівно,

перешкоджає облаштуванню ліганда в область каталітичної впадини.

Рис. 4.9. Залежність вільної енергії зв’язування (∆Gdoc) від природи

замісника, що розміщений на фулереновому каркасі.

Високе значення ∆Gdoc сполуки 4.19, в порівнянні зі значенням сполук

4.16, 4.17, 4.20 та 4.21, пояснюється наявністю довгого неіоногеного

аліфатичного ланцюга, що виходить далеко за межі каталітичної впадини (рис.

101

4.10). Положення фулеренових ядер досліджених структур в ензим-інгібіторних

комплексах майже однакове. Тому, очевидно, специфіка інгібування може

визначатися саме хімічною природою замісника на фулереновому каркасі.

Рис. 4.10. Модель розташування сполуки 4.19 в області каталітичної

впадини модельної структури CD45 з відкритою WPD-петлею (номерація

амінокислотних залишків наведена у відповідності до їх порядкового номеру в

кристалі 1YGR). Подвійні зв’язки фулеренового каркасу відображені як

одинарні.

Ці дані вказують на те, що серед естерних похідних фулеренів є сполуки,

які можуть інгібувати CD45, як, наприклад, похідна 4.21. Варто зауважити, що

функціоналізовані похідні С60, які мають громіздкий неіоногенний замісник,

або два замісники на протилежних полюсах фулеренового ядра, очевидно, не

матимуть значного впливу на активність протеїнтирозинфосфатаз.

На закінчення цього розділу можна зробити короткі висновки. Очевидно,

похідні фулеренів можуть розглядатися як новий клас інгібіторів

протеїнтирозинфосфатаз. Розглянуті сполуки мають високу спорідненість до

102

CD45 зі значеннями IC50 у низькомікромолярному діапазоні та можуть також

добре інгібувати PTP1B та деякі інші фосфатази. Аналіз отриманих даних

свідчить, що фулеренове ядро відіграє важливу роль у зв’язуванні цих

інгібіторів з молекулярною поверхнею ензимів як в області активного центру,

так і поза його межами. При цьому замісники можуть тільки дещо змінювати

селективність дії похідних фулеренів. Використовуючи кристалічні структури

РТР1В та CD45 з відкритою та закритою WPD-петлею, нами запропоновано

можливі молекулярні механізми інгібування цих ензимів. Очевидно, отримані

результати можуть забезпечити добре підґрунтя для подальшого вивчення і

дизайну нових похідних фулеренів як перспективних нанорозмірних інгібіторів

терапевтично важливих протеїнтирозинфосфатаз.

103

РОЗДІЛ 5

ОСОБЛИВОСТІ ВПЛИВУ ПОЛІГІДРОКСИЛЬОВАНИХ ФУЛЕРЕНІВ

НА АКТИВНІСТЬ ПРОТЕЇНТИРОЗИНФОСФАТАЗИ 1B

Оскільки фулеренова частинка інгібітора може відігрівати ключову роль

в інгібуванні протеїнтирозинфосфатаз (розділ 4), ми припустили, що

перспективними для пошуку нових інгібіторів цих ензимів могли б бути

полігідроксильовані фулерени. Ці сполуки з певною кількістю гідроксильних

груп (понад сім) варто розглядати як похідні фулерену з дещо іншими фізико-

хімічними властивостями, ніж у полікарбоксильованих інгібіторів 4.1-4.11, а

також похідних 4.12-4.15. В першу чергу це обумовлено більшою

гідрофільністю наночастинки C60(OH)7+x, тоді як попередньо розглянуті похідні

є гідрофобнішими. Значний інтерес в науковій літературі до

полігідроксильованих фулеренів як потенційних терапевтичних агентів

обумовлений з одного боку їх розчинністю у воді, а з іншого – їх низькою

токсичністю [278, 279].

Експериментально встановлено, що фулереноли здатні інгібувати ВІЛ-

протеазу (зі значенням IC50 8,3 мкМ) [240], Р450-залежну монооксигеназу,

Mg2+

-АТФазу [364], taq ДНК-полімеразу [357], M-MuLV-зворотню

транскриптазу [358], моноамінооксидазу В [362] та аспартат-специфічні

цистеїнові протеази (відомі як каспази, активність яких необхідна для

механізмів апоптозу) [280]. Ці похідні фулерену здатні також зменшувати

інгібуючий вплив фосфорорганічних сполук на активність ацетилхолінестерази,

імовірно через зв’язування цих інгібіторів [365]. Однак, вплив фулеренолів на

ензиматичну активність терапевтично значимих протеїнтирозинфосфатаз до

цього часу не був описаний.

В представленому досліджені використано препарат полігідрокси-

льованого фулерену фірми “Sigma-Aldrich” без додаткової очистки. Реагент був

104

сумішшю фулеренолів і вміщував приблизно тридцять окси-фрагментів на

кожне фулеренове ядро. Структури, заявлені постачальником (small gap

fullerenes), за абсорбційними та флуоресцентними спектрами є фулеренолами

(рис. 5.1 та 5.2).

Рис. 5.1. Абсорбіційний спектр препарату фулеренолів (концентрація

становила 90 мкг/мл).

Комерційний препарт був чорно-коричневим кристалічним порошком.

При розчиненні його у воді утворюється однорідний темно-коричневий розчин,

що вказує на можливість існування структури з кількістю OH-груп понад 26-28.

Спектр поглинання (рис. 5.1) характеризується наявністю довгого згасаючого

хвоста у видимій області [366]. Записаний емісійний спектр (рис. 5.2) має смугу

поглинання в області 475-600 нм з піком при 503 та 531 нм. Наявність цієї

смуги, хоча для наявного препарату і дещо зміщеної вправо, є характерним для

полігідроксильованого фулерену, а два піки відображають перехід електронів

між його збудженим та основним станом [366, 367].

Дослідження кінетики впливу полігідроксильованих фулеренів на

активність PTP1B продемонструвало зниження швидкості ензиматичної реакції

105

з часом, що обумовлено повільним облаштуванням інгібітора (рис. 5.3). Тому

для аналізу кінетичних результатів було використано стаціонарні швидкості,

що відповідають п’яти останнім хвилинам вимірювання гідролітичної

активності ензиму.

Рис. 5.2. Флуоресцентний емісійний спектр препарату.

Рис. 5.3. Крива гідролізу pNPP, що його каталізує PTP1B, за відсутності

(1) і за наявності в реакційному середовищі полігідроксифулеренів в

концентрації 0,0722 мкг/мл (2) та 0,271 мкг/мл (3).

106

Досліджені полігідроксильовані фулерени інгібують активність

протеїнтирозинфосфатаз в діапазоні від низької мікромолярної до високої

наномолярної концентрації (табл. 5.1). Незважаючи на зміну фізико-хімічних

характеристик поверхні фулеренового ядра, фулереноли також виявилися

сильними інгібіторами CD45, проте з дуже низькою селективністю стосовно

PTP1B та SHP2. Як інгібітор CD45 препарат виявився вдвічі селективніший у

порівнянні з РТР1В та в 4 рази порівняно з SHP2. Дещо кращу селективність, в

5-12 разів, фулероли продемонстрували щодо TC-PTP, PTPβ, Meg1 та Meg2

(рис. 5.4).

Таблиця 5.1.

Значення IC50 (мкМ) полігідроксильованих фулеренів як інгібіторів

протеїнтирозинфосфатаз*

Ензим 4-MUP pNPP

CD45 0,034 ± 0,009 0,047 ± 0,002

PTP1B 0,08 ± 0,03 0,061 ± 0,004

SHP2 0,16 ± 0,048 -

Meg2 - 0,29 ± 0,03

Meg1 - 0,32 ± 0,01

TC-PTP 0,36 ± 0,08 -

PTPβ 0,39 ± 0,08 -

*У перерахунку на молекулярну структуру C60(OH)30. 4-MUP було взято в

концентрації 0,8 мМ (CD45), 0,3 мМ (PTP1B та TC-PTP), 0,7 мМ (SHP2) та

0,2 мМ (PTPβ). pNPP було взято в концентрації 5 мМ (CD45), 2 мМ (PTP1B) та

6 мМ (Meg1 та Meg2).

107

Рис. 5.4. Селективність дії полігідроксильованих фулеренів на

ензиматичну активність протеїнтирозинфосфатаз. Як субстрат використано

pNPP (А) та 4-MUP (Б).

Рис. 5.5. Дозозалежна крива інгібування активності PTP1B

полігідроксильованими фулеренами. pNPP використано як субстрат.

Коефіцієнт Хіла, обрахований з дозозалежної кривої (рис. 5.5), становить

2,20 ± 0,51, що свідчить про уявний позитивний кооперативний вплив з

108

залученням щонайменше двох центрів на поверхні PTP1B до зв’язування

молекул полігідроксильованих фулеренів.

Побудований графік залежності оберненої уявної стаціонарної швидкості

від оберненої концентрації субстрату (рис. 5.6) не дозволив однозначно

ідентифікувати тип інгібування. Подібний графік було отримано і у випадку

використання pNPP (рис. 5.7). Значне зростання впливу полігідроксильованих

фулеренів при концентрації 0,1 мкг/мл може бути віднесено до

супрамолекулярних взаємодій наночастинок у водній фазі [351, 368]. Разом з

тим, аналіз вторинної залежності значень нахилу прямих ліній та значень

перетину осі 1/V, отриманих з рис. 5.6, від концентрації інгібітора (рис. 5.8)

узгоджується з взаємодією молекул фулеролів з двома центрами зв’язування на

поверхні PTP1B.

Рис. 5.6. Інгібування активності PTP1B полігідроксильованими

фулереномами. Концентрації інгібітора 0 (♦), 0,036 мкг/мл (○), 0,072 мкг/мл (◊),

та 0,144 мкг/мл (∆). Значення r2 знаходиться в межах 0,99.

109

Рис. 5.7. Інгібування активності PTP1B полігідроксильованими

фулеренами. Концентрації інгібітора 0 (♦), 0,054 мкг/мл (●) та 0,108 мкг/мл (■).

Значення r2 знаходиться в межах 0,98-0,99.

Рис. 11. Залежність нахилу ліній тренду та значень 1/Vmax (дані рис. 10)

від концентрації інгібітора.

Відповідно до можливого S-лінійного I-параболітичного механізму

інгібування [369, 370], полігідроксильовані фулерени, взаємодіючи з ензимом,

можуть формувати комплекси EI, IEI та неактивний комплекс IES (схема 5.1).

110

Схема 5.1.

Рис. 5.9. Можливі моделі зв’язування полігідроксильованого фулерену

C60(OH)30 в активному (A) та алостеричному (Б) центрах зв’язування PTP1B з

відкритою WPD-петлею (PDB код рентгеноструктурного кристалу, що був

використаний під час докінгу, 1NL9).

Результати комп’ютерного моделювання ензим-інгібіторних комплексів

показали, що полігідроксильований фулерен C60(OH)30 може займати область

активного та алостеричного центрів PTP1B (PDB код 1NL9) майже з

111

однаковими енергіями докінгу (рис. 5.9). Знайдені ∆Gdoc становлять -8,2

ккал/моль та -7,7 ккал/моль, відповідно. Характеристика найважливіших

зв’язків, що відповідають за стабілізацію представлених ензим-інгібіторних

комплексів, подано в табл. 5.2 та 5.3.

Розташування фулеролу в області активного центру ензиму

характеризується наявністю водневих зв’язків з Asp48, Glu115, Lys116, Lys120,

Asp181, Ala217, Ser216, Gly220, Arg221 та Gln266, а відстань до каталітично

важливого Cys215 становить 3,72 Å. Ензим-інгібіторний комплекс додатково

стабілізують стекінг π-π та катіон-π взаємодії фулеренового каркасу з Tyr46 та

Lys120, відповідно. Однак, при закритому положенні WPD-петлі в кристалі

PTP1B (PDB код 2CM8) молекула C60(OH)30 не може закріпитися в області

активного центру. У цьому випадку, як і у випадку з відкритою WPD-петлею,

інгібітор може розміститися в області алостеричного центру на відстані

приблизно 20 Å від каталітично важливого Cys215 [371]. Молекула C60(OH)30

займає область впадини, що утворена альфа-спіралями 3, 4, 6, 7 та S-петлею, які

беруть участь у комформаційних змінах ензиму [371-373]. При цьому інгібітор

формує водневі зв’язки з Arg79, Arg199, Glu200, Gly202, Ser205, Glu207,

Asp236 та Gln288.

Таблиця 5.2.

Характеристика найважливіших зв’язків модельного ензим-інгібіторного

комплексу при облаштуванні C60(OH)30 в область активного центру РТР1В

Донор (D) протону Акцептор (A) протону Дистанція, Å

Lys116 Ліганд 2,62

Lys116 Ліганд 2,82

Lys116 Ліганд 2,60

Lys120 Ліганд 2,88

Ala217 Ліганд 3,97

112

Продовження табл. 5.2.

Донор (D) протону Акцептор (A) протону Дистанція, Å

Gly220 Ліганд 3,40

Arg221 Ліганд 3,93

Arg221 Ліганд 4,21

Arg221 Ліганд 3,06

Arg221 Ліганд 3,92

Arg221 Ліганд 3,04

Arg221 Ліганд 3,27

Gln266 Ліганд 4,14

Gln266 Ліганд 3,19

Gln266 Ліганд 2,82

Ліганд Asp181 3,64

Ліганд Glu115 3,84

Ліганд Cys215 3,72

Ліганд Asp48 3,95

Ліганд Asp48 3,06

Ліганд Asp48 3,57

Ліганд Asp48 2,77

Відповідно до результатів табл. 5.2, фулерол (завдяки значній

гідроксильованості) може формувати по декілька зв’язків з кожним

амінокислотним залишком області активного центру PTP1B. Таку значну

кількість взаємодій також знайдено при облаштуванні інгібітора в область

алостеричного центру ензиму (табл. 5.3). Таким чином, в обох випадках

формуються достатньо стійкі ензим-інгібіторні комплекси, що узгоджується з

результатами експериментальних досліджень (табл. 5.1).

113

Таблиця 5.3.

Характеристика найважливіших зв’язків модельного ензим-інгібіторного

комплексу при облаштуванні C60(OH)30 в область алостеричного центру РТР1В

Донор (D) протону Акцептор (A) протону Дистанція, Å

Arg79 Ліганд 4,19

Arg79 Ліганд 2,45

Arg79 Ліганд 4,09

Arg79 Ліганд 2,92

Arg199 Ліганд 2,95

Arg199 Ліганд 3,38

Arg199 Ліганд 3,28

Ліганд Asp236 2,77

Ліганд Asp236 2,86

Ліганд Asp236 3,27

Ліганд Asp236 3,12

Ліганд Asp236 3,12

Ліганд Asp236 2,82

Ліганд Ser205 2,93

Ліганд Ser205 3,14

Ліганд Ser205 2,92

Ліганд Arg199 4,20

Ліганд Ser205 3,11

Ліганд Arg199 4,03

Ліганд Glu200 2,86

Результати молекулярного докінгу вказують на те, що вуглецеві

фрагменти поверхні гідроксильованого фулерену С60 вносять значний вклад у

зв’язування з PTP1B. При цьому слід зазначити, що використаний в

дослідженні продукт полігідроксильованого фулерену є гетерогенним та

114

містить сполуки з структурою, більшою за C60. Отже, їх комплекси з ензимом

можуть також бути запропоновані, наприклад, як результат взаємодії з

димеризованою формою похідної фулерену.

Рис. 5.10. Енергія молекулярного докінгу полігідроксильованих похідних

фулерену, зв’язаних в активному та алостеричному центр PTP1B.

Результати докінг-симуляції фулеренів C60(OH)6, C60(OH)12, C60(OH)18,

C60(OH)24, C60(OH)30, C60(OH)36 як інгібіторів PTP1B (рис. 5.10) свідчать про те,

що інгібувальний потенціал цих сполук залежить від ступеня

гідроксильованості фулеренового ядра. Ефективність інгібіторів понижується з

підвищенням числа гідроксильних груп та залишається практично стабільною у

випадку фулеролів, що мають більше ніж 18 ОН-груп. Гідрофільніші

наночастинки взаємодіють з амінокислотними залишками області активного та

алостеричного центрів приблизно з однаковою енергією зв’язування. На

115

відміну від цього, похідні фулерену з низьким ступенем гідроксильованості

формують стабільніші ензим-інгібіторні комплекси, якщо взаємодіють з

гідрофобними залишками активного центру PTP1B. Це узгоджується з тим

фактом, що піролідино[60]фулерен-трис-карбонова кислота інгібує активність

PTP1B за конкурентним типом [321], тоді як полігідроксильовані фулерени

демонструють інший механізм інгібування.

Отже, цей розділ вміщує результати in vitro та іn silico досліджень

інгібування активності PTP1B полігідроксильованими фулеренами. Нами

встановлено, що ці сполуки інгібують активність протеїнтирозинфосфатаз в

діапазоні від низької мікромолярної до високої наномолярної концентрації.

Результати кінетичних досліджень ензиматичних реакцій за наявності

полігідроксильованих фулеренів демонстрували нелінійне зростання

оберненого значення уявної максимальної швидкості реакції з підвищенням

концентрації інгібітора. Аналіз дозо-залежної кривої припускає позитивну

кооперативність з залученням щонайменше двох центрів зв’язування для

полігідроксильованих фулеренових фрагментів. Комп’ютерні розрахунки

показали, що полігідроксильовані фулерени C60(OH)24-36 характеризуються

приблизно однаковими значеннями енергії докінгу при взаємодії як з активним,

так і з алостеричним центрами зв’язування. Аналіз результатів молекулярного

докінгу ряду фулеренолів з 6, 12, 18, 24, 30 і 36 OH-групами свідчить, що їх

інгібуючий вплив залежить від ступеня гідроксилювання поверхні

наночастинок. Ці дані є важливими для з’ясування механізмів інгібування

активності протеїнтирозинфосфатаз фулеренолами та цілеспрямованого

дизайну подібних сполук.

116

ВИСНОВКИ

В дисертаційній роботі представлено експериментальні і теоретичні

узагальнення нових підходів щодо створення інгібіторів протеїнтирозин-

фосфатаз на основі тетраазамакроциклів і фулеренів.

1. Вперше встановлено, що тетраазамакроцикли можуть бути

перспективними молекулярними платформами для конструювання інгібіторів

протеїнтирозин-фосфатаз. Показано, що інгібувальний потенціал та

селективність дії досліджених сполук залежить як від хімічної природи

замісників, що розміщені на макроциклічному ободі, так і від розмірів

макроциклу.

2. Похідні цикламу та його структурні аналоги з бензил-α,α-дифтор-β-

кетофосфонатними замісниками є потенційними інгібіторами TC-PTP з

константами інгібування в низькомікромолярному діапазоні та значно меншим

впливом на інші протеїнтирозинфосфатази. Коефіцієнт Хіла для тетракіс-

заміщеної бензил-α,α-дифтор-β-кетофосфонатної похідної 1,4,8,11-тетра-

азациклотетрадекану свідчить про наявність одного центру зв’язування

інгібітора на молекулярній поверхні ензиму. Механізм дії сполуки описується

закономірностями конкурентного інгібування. Згідно розрахунків методом

молекулярного докінгу, інгібітор закріплюється в області активного центру TC-

PTP, блокуючи доступ субстрату до каталітично важливих амінокислотних

залишків.

3. Встановлено, що полікарбоксильовані похідні фулеренів є сильними

інгібіторами CD45. Ці сполуки меншою мірою інгібують PTP1B, SHP2, а також

TC-PTP і PTPβ. Найкращу селективність стосовно CD45 виявляє

полікарбоксильована похідна фулерену С70. Результати кінетичних досліджень і

комп'ютерних розрахунків свідчать, що основний вклад у взаємодію

нанорозмірних інгібіторів з різними РТРазами забезпечується фулереновим

117

ядром, а замісники різної хімічної природи мало змінюють селективність

інгібування.

4. Вплив піролідино[60]фулерен-трис-карбонової кислоти на активність

CD45 узгоджується зі змішаним механізмом інгібування. Результати

молекулярного докінгу демонструють, що інгібітор облаштовується як в

активний центр ензиму, так і в область R-петлі. Кінетика інгібування активності

PTP1B піролідино[60]-фулерен-трис-карбоновою кислотою описується

конкурентним механізмом. Порівняння молекулярної поверхні PTP1B і CD45

вказує на те, що гідрофобність CD45 може бути причиною зростання

спорідненості фулеренових інгібіторів до цього ензиму.

5. Дослідження інгібувального впливу полігідроксильованих фулеренів на

активність PTP1B свідчать про те, що щонайменше два центри зв’язування на

поверхні ензиму можуть бути залучені до механізму інгібування. Згідно даних

молекулярного докінгу, полігідроксильовані фулерени займають область

активного та алостеричного центрів РТР1В приблизно з однаковим значенням

енергії зв’язування. При цьому ефективність та механізм інгібування PTP1B

може залежати від ступеня гідроксилювання фулеренової наночастинки.

118

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ

1. Inhibition of Yersinia protein tyrosine phosphatase by phosphonate derivatives

of calixarenes / Andriy I. Vovk, Lyudmyla A. Kononets, Vsevolod Yu.

Tanchuk [et al.] // Bioorg. Med. Chem. Lett. – 2010. – Vol. 20, № 2. – P. 483-

487.

2. Calix[4]arene methylenebisphosphonic acids as inhibitors of protein tyrosine

phosphatase 1B / Viacheslav V. Trush, Sergiy O. Cherenok, Vsevolod Yu.

Tanchuk [et al.] // Bioorg. Med. Chem. Lett. – 2013. – Vol. 23, № 20. – P.

5619-5623.

3. Medical applications of macrocyclic polyamines / Feng Liang, Shuhui Wan,

Zheng Li [et al.] // Curr. Med. Chem. – 2006. – Vol. 13, № 6. – P. 711-727.

4. Mewis R. E. Biomedical applications of macrocyclic ligand complexes / Ryan

E. Mevis, Stephen J. Archubald // Coord. Chem. Rev. – 2010. – Vol. 254, №

15-16. – P. 1686-1712.

5. Fullerenes for applications in biology and medicine / P. Anilkumar, F. Lu, L.

Cao [et al.] // Curr. Med. Chem. – 2011, – Vol. 18, № 14. – P. 2045-2059.

6. Small molecule tools for functional interrogation of protein tyrosine

phosphatases / Rongjun He, Li-Fan Zeng, Yantao He [et al.] // FEBS J. – 2013.

– Vol. 280, № 2. – P. 731-750.

7. Protein tyrosine phosphatases in the human genome / Andres Alonso, Joanna

Sasin, Nunzio Bottini [et al.] // Cell. – 2004. – Vol. 117, № 6. – P. 699-711.

8. Protein tyrosine phosphatases in health and disease / Wiljan J. A. J. Hendriks,

Ari Elson, Sheila Harroch [et al.] // FEBS J. – 2013. – Vol.280, № 2. – P.708-

730.

9. Van Huijsduijnen R. H. Selecting protein tyrosine phosphatases as drug targets /

Rob Hooft van Huijsduijnen, Agnes Bombrun, Dominique Swinnen // Drug

Discov. Today. – 2002. – Vol. 7, № 19. – P. 1013-1019.

10. A genomic perspective on protein tyrosine phosphatases: gene structure,

pseudogenes, and genetic disease linkage / Jannik N. Andersen, Peter G.

119

Jansen, Soren M. Echwald [et al.] // FASEB J. – 2004. – Vol. 18, № 1. – P. 8-

30.

11. Stoker A. W. Protein tyrosine phosphatases and signaling / Andrew W. Stoker

// J. Endocrinol. – 2005. – Vol. 185. № 1. – P.19-33.

12. Barford D. The structure and mechanism of protein phosphatases: insights into

catalysis and regulation / David Barford, Amit K. Das, Marie-Pierre Egloff //

Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. – 1998. – Vol. 27, № 1. – P. 133-164.

13. Pannifer A. D. Visualization of the cysteinyl-phosphate intermediate of a

protein-tyrosine phosphatase by X-ray crystallography / Andrew D. B.

Pannifer, Andrew J. Flint, Nicholas K. Tonks, David Barford // J. Biol. Chem.

– 1998. – Vol. 273, № 17. – P. 10454-10462.

14. Zhang, Z.-Y. Dissecting the catalytic mechanism of protein-tyrosine

phosphatases / Zhong-Yin Zhang, Yuan Wang, Jack E. Dixon // Proc. Natl.

Acad. Sci. USA – 1994. – Vol. 91, № 5. – P. 1624-1627.

15. Visualization of intermediate and transition-state structures in protein-tyrosine

phosphatase catalysis / John M. Denu, Daniel L. Lohse, J. Vijayalakshmi [et

al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA – 1996. – Vol. 93, № 6. – P. 2493-2498.

16. Structural and evolutionary relationships among protein tyrosine phosphatase

domains / Jannik N. Andersen, Ole H. Mortensen, Gunther H. Peters [et al.] //

Mol. Cell. Biol. – 2001. – Vol 21, № 21. – P. 7117-7136.

17. The nontransmembrane tyrosine phosphatase PTP-1B localizes to the

endoplasmic reticulum via its 35 amino acid C-terminal sequence / John V.

Frangioni, Pamela H. Beahm, Victor Shifrin [et al.] // Cell. – 1992. – Vol. 68,

№ 3. – P. 545-560.

18. Picha K. M. The role of the C-terminal domain of protein tyrosine

phosphatase-1B in phosphatase activity and substrate binding / Kristen M.

Picha, Smita S. Sreekala Mandiyan, James Koehn, Lawrence P. Wennogle // J.

Biol. Chem. – 2007. – Vol. 282, № 5. – P. 2911-2917.

120

19. Barford D. Crystal structure of human protein tyrosine phosphatase 1B / David

Barford, Andrew J. Flint, Nicholas K. Tonks // Science. – 1994. – Vol. 263, №

5152. – P. 1397-1404.

20. Kenner K. A. Protein-tyrosine phosphatase 1B is a negative regulator of

insulin-and insulin-like growth factor-I-stimulated signaling / Kathleen A.

Kenner, Ezenta Anyanwu, Jerrold M. Olefsky, Jyotirmoy Kusari // J. Biol.

Chem. – 1996. – Vol. 271, № 33. – P. 19810-19816.

21. Goldstein B. J. Tyrosine dephosphorylation and deactivation of insulin receptor

substrate-1 by protein-tyrosine phosphatase 1B. Possible facilitation by the

formation of a ternary complex with the Grb2 adaptor protein / Barry J.

Goldstein, Anna Bittner-Kowalczyk, Morris F. White, Mark Harbeck // J. Biol.

Chem. – 2000. – Vol. 275, № 6. – P. 4283-4289.

22. Tonks N. K. PTP1B: From the sidelines to the front lines! / Nicholas K. Tonks

// FEBS Lett. – 2003. – Vol. 546, № 1. – P.140-148.

23. Increased insulin sensitivity and obesity resistance in mice lacking the protein

tyrosine phosphatase-1B gene / Mounib Elchebly, Paul Payette, Eva

Michaliszy [et al.] // Science. – 1999. – Vol. 283, № 5407. – P.1544-1548.

24. Attenuation of leptin action and regulation of obesity by protein tyrosine

phosphatase 1B / Alan Cheng, Noriko Uetani, Paul D. Simoncic [et al.] // Dev.

Cell. – 2002. – Vol. 2, № 4. – P. 497-503.

25. PTP1B regulates leptin signal transduction in vivo / Janice M. Zabolotny,

Kendra K. Bence-Hanulec [et al.] // Dev. Cell. – 2002. – Vol. 2, № 4. – P. 489-

495.

26. Mechanism of protein tyrosine phosphatase 1B-mediated inhibition of leptin

signalling / I. K. Lund, J. A. Hansen, H. S. Andersen [et al.] // J. Mol.

Endocrinol. – 2005. – Vol. 34, № 2. – P. 339-351.

27. TYK2 and JAK2 are substrates of protein-tyrosine phosphatase 1B / Michael P.

Myers, Jannik N. Andersen, Alan Chen [et al.] // J. Biol. Chem. – 2001. – Vol.

276, № 51. – P. 47771-47774.

121

28. Regulation of receptor tyrosine kinase signaling by protein tyrosine

phosphatase-1B / Fawaz G. Haj, Boyka Markova, Lori D. Klaman // J. Biol.

Chem. – 2003. – Vol. 278, № 2. – P. 739-744.

29. Harris D. L. Protein tyrosine phosphatase, PTP1B, expression and activity in

rat corneal endothelial cells / Deshea L. Harris, Nancy C. Joyce // Mol. Vis. –

2007. – Vol. 13. – P. 785-796.

30. Lessard L. The two faces of PTP1B in cancer / Laurent Lessard, Matthew

Stuible, Michel L. Tremblay // Biochim. Biophys. Acta. – 2010. – Vol. 1804,

№ 3. – P. 613-619.

31. Brown-Shimer S. Effect of protein tyrosine phosphatase 1B expression on

transformation by the human neu oncogene / Sheryl Brown-Shimer, Karen A.

Johnson, David E. Hill, Arthur M. Bruskin // Cancer Res. – 1992. – Vol. 52, №

2. – P. 478-482.

32. PTP1B is a negative regulator of interleukin 4–induced STAT6 signaling /

Xiaoqing Lu, Raquel Malumbres, Benjamin Shields [et al.] // Blood. – 2008. –

Vol. 112, № 10. – P. 4098-4108.

33. Overexpression of the protein tyrosine phosphatase PTP1B in human breast

cancer: association with p185c-erbB-2 protein expression / J. R Wiener, B. M.

Kerns, E. L. Harvey [et al.] // Cancer Inst. – 1994. – Vol.86, № 5. – P.372-378.

34. Overexpression of the tyrosine phosphatase PTP1B is associated with human

ovarian carcinomas / Jon R. Wiener, Jean A. Hurteau, Billie-jo M. Kerns [et

al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. – 1994. – Vol. 170, № 4. – P.1177-1183.

35. Tamrakar A. K. PTP1B inhibitors for type 2 diabetes treatment: a patent review

(2011-2014) / Akhilesh Kumar Tamrakar, Chandan K. Maurya, Amit K. Rai //

Expert Opin. Ther. Pat. – 2014. – Vol. 24, № 10. – P. 1101-1115.

36. Johnson T. O. Protein tyrosine phosphatase 1B inhibitors for diabetes /

Theodore O. Johnson, Jacques Ermolieff, Michael R. Jirousek // Nat. Rev.

Drug. Discovery. – 2002. – Vol. 1, № 9. – P. 696-709.

122

37. Yip S.-C. PTP1B: a double agent in metabolism and oncogenesis / Shu-Chin

Yip, Sayanti Saha, Jonathan Chernoff // Trends Biochem. Sci. – 2010. – Vol.

35, № 8. – 442-449.

38. Lorenzen J. A. COOH-terminal sequence motifs target the T cell protein

tyrosine phosphatase to the ER and nucleus / James A. Lorenzen, Carolyn Y.

Dadabay, Edmond H. Fischer // J. Cell Biol. – 1995. – Vol. 131, № 3. – P. 631-

643.

39. Cellular stress regulates the nucleocytoplasmic distribution of the protein-

tyrosine phosphatase TCPTP / Mark H. C. Lam, Belinda J. Michell, Michelle

T. Fodero-Tavoletti [et al.] // J. Biol. Chem. – 2001. – Vol. 276, № 40. – P.

37700-37707.

40. Epidermal growth factor receptor and the adaptor protein p52Shc

are specific

substrates of T-cell protein tyrosine phosphatase /Tony Tiganis, Anton M.

Bennett, Kodimangalam S. Ravichandran, Nicholas K. Tonks // Moll. Cell.

Biol. – 1998. – Vol. 18, № 3. – P. 1622-1634.

41. Domain enhanced lookup time accelerated BLAST / Grzegorz M. Boratyn,

Alejandro A. Schaffer, Richa Agarwala [et al.] // Biol. Direct. – 2012. – Vol. 7,

№ 1. – P. 12-25.

42. Structure determination of T cell protein-tyrosine phosphatase / Lars Fogh

Iversen, Karin Bach Moller, Anja K. Pedersen [et al.] // J. Biol. Chem. – 2002.

– Vol. 277, № 22. – P. 19982-19990.

43. Tanchuk V. Y. Analysis of conformational flexibility of loop 110-120 of

protein tyrosine phosphatase 1B / V. Yu. Tanchuk, V. O. Tanin, A. I. Vovk //

Ukr. Biochem. J. – 2013. – Vol. 85, № 5. – 73-80.

44. Impaired bone marrow microenvironment and immune function in T cell

protein tyrosine phosphatase-deficient mice / Kong E. You-Ten, Eric S. Muise,

Annick Itie [et al.] // J. exp. Med. – 1997. – Vol. 186, № 5. – P. 683-693.

45. Doody K. M. T-cell protein tyrosine phosphatase is a key regulator in immune

cell signaling: lessons from the knockout mouse model and implications in

123

human disease / Karen M. Dooby, Annie Bourdeau, Michel L. Tremblay //

Immunol. Rev. – 2009. – Vol. 228, № 1. – P. 325-341.

46. TC-PTP-deficient bone marrow stromal cells fail to support normal B

lymphopoiesis due to abnormal secretion of interferon-γ / Annie Bourdeau,

Nadia Dube, Krista M. Heinonen [et al.] // Blood. – 2007. – Vol. 109, № 10. –

P. 4220-4228.

47. T-cell protein tyrosine phosphatase (Tcptp) is a negative regulator of colony-

stimulating factor 1 signaling and macrophage differentiation / Paul D.

Simoncic, Annie Bourdeau, Ailsa Lee-Loy [et al.] // Mol. Cell. Biol. –2006. –

Vol 26. № 11. – P. 4149-4160.

48. Identification of a nuclear Stat1 protein tyrosine phosphatase / Johanna ten

Hoeve, Maria de Jesus Ibarra-Sanchez, Yubin Fu [et al.] // Mol. Cell. Biol. –

2002. – Vol. 22, № 6. – P. 5662-5668.

49. The nuclear isoform of protein-tyrosine phosphatase TC-PTP regulates

interleukin-6-mediated signaling pathway through STAT3 dephosphorylation /

Tetsuya Yamamoto, Yuichi Sekine, Keiichi Kashima [et al.] // Biochem.

Biophys. Res. Commun. – 2002. – Vol. 297, № 4. – P. 811-817.

50. Aoki N. A nuclear protein tyrosine phosphatase TC-PTP is a potential negative

regulator of the PRL-mediated signaling pathway: dephosphorylation and

deactivation of signal transducer and activator of transcription 5a and 5b by

TC-PTP in nucleusand / Naohito Aoki, Tsukasa Matsuda // Mol. Endocrinol. –

2002. –Vol. 16, № 1. – P. 58-69.

51. Coordinated regulation of insulin signaling by the protein tyrosine

phosphatases PTP1B and TCPTP / Sandra Galic, Christine Hauser, Barbara B.

Kahn [et al.] // Mol. Cell. Biol. – 2005. – Vol. 25, № 2. – P. 819-829.

52. Regulation of insulin receptor signaling by the protein tyrosine phosphatase

TCPTP / Sandra Galic, Manuela Klingler-Hoffmann, Michelle T. Fodero-

Tavoletto [et al.] // Mol. Cell. Biol. – 2003. – Vol. 23, № 6. – P. 2096-2108.

124

53. The T cell protein tyrosine phosphatase is a negative regulator of janus family

kinases 1 and 3 / Paul D. Simoncic, Ailsa Lee-Loy, Dwayne L. Barber [et al.] //

Curr. Biol. – 2002. – Vol. 12, № 6. – P. 446-453.

54. Site-selective regulation of platelet-derived growth factor β receptor tyrosine

phosphorylation by T-cell protein tyrosine phosphatase / Camilla Persson,

Catrine Savenhed, Annie [et al.] // Mol. Cell. Biol. – 2004. – Vol. 24, №5. – P.

2190-2201.

55. T-cell protein tyrosine phosphatase deletion results in progressive systemic

inflammatory disease / Krista M. Heinonen, Frederick P. Nestel, Evan W.

Newell [et al.] // Blood. – 2004. – Vol. 103, № 9. – P. 3457-3464.

56. Elevated hypothalamic TCPTP in obesity contributes to cellular leptin

resistance / Kim Loh, Atsushi Fukushima, Xinmei Zhang [et al.] // Cell Metab.

– 2011. – Vol. 14, № 5. – P. 684-699.

57. Young R. M. TC-PTP is required for the maintenance of MYC-driven B-cell

lymphomas / Ryan M. Young, Avital Polsky, Yosef Refaeli // Blood. – 2009. –

Vol. 114, № 24. – P. 5016-5023.

58. Deletion of the protein tyrosine phosphatase gene PTPN2 in T-cell acute

lymphoblastic leukemia / Maria Kleppe, Idoya Lahortiga, Tiama El Chaar [et

al.] // Nat. Genet. – 2010. – Vol. 42, № 6. – P. 530-535.

59. TCPTP regulates SFK and STAT3 signaling and is lost in triple-negative breast

cancers / Benjamin J. Shields, Florian wiede, Esteban N. Gurzov [et al.] // Mol.

Cel. Biol. – 2013. – Vol. 33, № 3. – P. 557-570.

60. Genome-wide association study of 14,000 cases of seven common diseases and

3,000 shared controls / The wellcom trust case control consortium // Nature. –

2007. – Vol. 447, № 7145. – P. 661-678.

61. Robust associations of four new chromosome regions from genome-wide

analyses of type 1 diabetes / John A. Todd, Neil M. Walker, Jason D. Cooper

[et al.] // Nat. Genet. – 2007. – Vol. 39, № 7. – P. 857-864.

62. Chughtai N. Prolactin induces SHP-2 association with Stat5, nuclear

translocation, and binding to the β-casein gene promoter in mammary cells /

125

Naila Chughtai, Sarah Schimchowitsch, Jean-Jacques Lebrun, Suhan Ali // J.

Biol. Chem. –2002. – Vol. 277, № 34. – P. 31107-31114.

63. Crystal structure of the tyrosine phosphatase SHP-2 / Peter Hof, Scott Pluskey,

Sirano Dhe-Paganon [et al.] // Cell. – 1998. – Vol. 92, № 4. – P. 441-450.

64. Jakob S. "Shping 2" different cellular localizations-a potential new player in

aging processes / Sascha Jakob, Joachim Altschmied, Judith Haendeler //

Aging (Albany NY). – 2009. – Vol. 1, № 7. – P. 664-668.

65. PTP1D is a positive regulator of the prolactin signal leading to β-casein

promoter activation / Suhad Ali, Zhengjun Chen, Jean-Jacques Lebrun [et al.] //

EMBO J. – 1996. –Vol. 15, № 1. – P. 135-142.

66. Ali S. Recruitment of the protein-tyrosine phosphatase SHP-2 to the C-terminal

tyrosine of the prolactin receptor and to the adaptor protein Gab2 / Samir Ali,

Suhad Alia // J. Biol. Chem. – 2000. – Vol. 275, № 50. – P. 39073-39080.

67. Yin T. Molecular characterization of specific interactions between SHP-2

phosphatase and JAK tyrosine kinases / Tinggui Yin, Randy Shen, Gen-Sheng

Feng, Yu-Chung Yang // J. Biol. Chem. – 1997. – Vol. 272, № 2. – P. 1032-

1037.

68. Araki T. Tyrosyl phosphorylation of Shp2 is required for normal ERK

activation in response to some, but not all, growth factors / Toshiyuki Araki,

Hiroyuki Nawa, Benjamin G. Neel // J. Biol. Chem. – 2003. – Vol. 278, № 45.

– P. 41677-41684.

69. Dominant negative variants of the SHP-2 tyrosine phosphatase inhibit prolactin

activation of Jak2 (janus kinase 2) and induction of Stat5 (signal transducer and

activator of transcription 5)-dependent transcription / Susanne Berchtold,

Sinisa Volarevic, Richard Moriggl [et al.] // Mol. Endocrinol. – 1998. – Vol.

12, № 4. – P. 556-567.

70. Yu C.-L. Cytosolic tyrosine dephosphorylation of STAT5. Potential role of

SHP-2 in Stat5 regulation / Chao-Lan Yu, Yong-Jiu Jin, Steven J. Burakoff // J.

Biol. Chem. – 2000. – Vol. 275, № 1. – P. 599-604.

126

71. Kim H. Protein tyrosine phosphatase 2 (SHP-2) moderates signaling by gp130

but is not required for the induction of acute-phase plasma protein genes in

hepatic cells / Hongkyun Kim, Teresa S. Hawley, Robert G. Hawley, Heinz

Baumann // Mol. Cell. Biol. – 1998. – Vol. 18, № 3. – P. 1525-1533.

72. Walter A. O. The Shp-2 tyrosine phosphatase activates the Src tyrosine kinase

by a non-enzymatic mechanism / Annette O. Walter, Zao-Yuan Peng, Christine

A. Cartwright // Oncogene. – 1999. – Vol. 18, № 11. – P. 1911-1920.

73. Activating mutations of the Noonan syndrome-associated SHP2/PTPN11 gene

in human solid tumors and adult acute myelogenous leukemia / Mohamed

Bentires-Alj, J. Guillermo Paez, Franj S. David [et al.] // Cancer Res. – 2004. –

Vol. 64, № 24. – P. 8816-8820.

74. Overexpression of Shp2 tyrosine phosphatase is implicated in leukemogenesis

in adult human leukemia / Rongzhen Xu, Yingzi Yu, Shu Zheng [et al.] //

Blood. – 2005. – Vol. 106, № 9. – P. 3142-3149.

75. Zhou X. SHP2 is up-regulated in breast cancer cells and in infiltrating ductal

carcinoma of the breast, implying its involvement in breast oncogenesis / X.

Zhou, J. Coad, B. Ducatman, Y. M. Agazie // Histopathol. – 2008. – Vol. 53,

№ 4. – P. 389-402.

76. Tyrosine phosphatase SHP2 promotes breast cancer progression and maintains

tumor-initiating cells via activation of key transcription factors and a positive

feedback signaling loop / Nicola Aceto, Nina Sausgruber, Heike Brinkhaus [et

al.] // Nat. Med. – 2012. – Vol. 18, № 4. – P. 529-537.

77. Mutations in PTPN11, encoding the protein tyrosine phosphatase SHP-2, cause

Noonan syndrome / Marco Tartaglia, Ernest L. Mehler, Rosalie Goldberg [et

al.] // Nat. Genet. – 2001. – Vol. 29, № 4. – P. 465-468.

78. Tidow N. SH2-containing protein tyrosine phosphatases SHP-1 and SHP-2 are

dramatically increased at the protein level in neutrophils from patients with

severe congenital neutropenia (Kostmann’s syndrome) / Nicola Tidow, Brigitte

Kasper, Karl Welte // Exp. Hematol. – 1999. – Vol. 27, № 4. – P. 1038-1045.

127

79. Ptpn11/Shp2 acts as a tumor suppressor in hepatocellular carcinogenesis /

Emilie A. Bard-Chapeau, Shuangwei Li, Jin Ding [et al.] // Cancer Cell. –

2011. – Vol. 19, № 5. – P. 629-639.

80. Protein-tyrosine phosphatase Shp-2 regulates cell spreading, migration, and

focal adhesion / De-Hua Yu, Cheng-Kui Qu, Octavian Henegariu [et al.] // J.

Biol. Chem. – 1998. – Vol. 273, № 33. – P. 21125-21131.

81. Molecular mechanism for the Shp-2 tyrosine phosphatase function in

promoting growth factor stimulation of Erk activity / Zhong-Qing Shi, De-Hua

Yu, Morag Park [et al.] // Mol. Cell. Biol. – 2000. – Vol. 20, № 5. – P. 1526-

1536.

82. SHP-2 tyrosine phosphatase as an intracellular target of Helicobacter pylori

CagA protein / Hideaki Higashi, Ryouhei Tsutsumi, Syuichi Muto [et al.] //

Science. – 2002. – Vol. 295, № 5555. – P. 683-686.

83. Hatakeyama M. Helicobacter pylori CagA: a new paradigm for bacterial

carcinogenesis / Masanori Hatakeyama, Hideaki Higashi // Cancer Sci. – 2005.

– Vol. 96, № 12. – P. 835-843.

84. SHP2 tyrosine phosphatase converts parafibromin/Cdc73 from a tumor

suppressor to an oncogenic driver / Atsushi Takahashi, Ryouhei Tsutsumi,

Ippei Kikuchi [et al.] // Mol. Cell. – 2011. – Vol. 43, № 1. – P. 45-56.

85. Ralph R. J. Structural variants of human T200 glycoprotein (leukocyte-

common antigen) / Stephen J. Ralph, Matthew L. Thomas, Cynthia C. Morton,

Ian S. Trowbridge // EMBO J. – 1987, – Vol.6. – P.1251-1257.

86. Thomas M. L. The leukocyte common antigen family / Matthew L. Thomas //

Ann. Rev. Immunol. – 1989. – Vol. 7, № 1. – P. 339-369.

87. Hermiston M. L. CD45: a critical regulator of signaling thresholds in immune

cells / Michelle L. Hermiston, Zheng Xu, Arthur Weiss // Ann. Rev. Immunol.

– 2003. – Vol. 21. – P. 107-137.

88. Streuli M. A family of receptor-linked protein tyrosine phosphatases in humans

and Drosophila / Michel Streuli, Neil X. Krueger, Alex Y. M. Tsai, Haruo

128

Saito // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 1989. – Vol. 86, № 22. – P. 8698-

8702.

89. Nam H.-J. Structural basis for the function and regulation of the receptor

protein tyrosine phosphatase CD45 / Hyun-Joo Nam, Florence Poy, Haruo

Saito, Christin A. Frederick // J. Exp. Med. – 2005. – Vol. 201, № 3. – P. 441-

452.

90. Weaver C. T. CD8+ T-cell clones deficient in the expression of the CD45

protein tyrosine phosphatase have impaired responses to T-cell receptor stimuli

/ Casey T. Weaver, Jeanette T. Pingel, Joanne O. Nelson, Matthew L. Thomas

// Mol. Cell. Biol. – 1991. – Vol. 11, № 9. – P. 4415-4422.

91. Trowbridge I. S. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase

required for lymphocyte activation and development / Ian S. Trowbridge,

Matthew L. Thomas // Annu. Rev. Immunol. – 1994. – Vol.12. – P. 85-116.

92. Justerment L. B. Regulation of B-cell activation by CD45: a question of

mechanism / Louis B. Justement, Vergil K. Brown, Jiejian Lin // Immunol.

Today. – 1994. – Vol. 15, № 9. – P. 399-406.

93. Justement L. B. Regulation of B cell antigen receptor signal transduction and

phosphorylation by CD45 / Louis B. Justement, Kerry S. Campbell, Nadine C.

Chien, John C. Cambier // Science. – 1991. – Vol. 252, № 5014. – P. 1839-

1842.

94. The catalytic activity of the CD45 membrane-proximal phosphatase domain is

required for TCR signaling and regulation / Dev M. Desai, Jan Sap, Olli

Silvennoinen [et al.] // EMBO J. – 1994. – Vol. 13, № 17. – P. 4002-4010.

95. Aberrant TCR-mediated signaling in CD45-null thymocytes involves

dysfunctional regulation of Lck, Fyn, TCR-δ, and ZAP-70 / John D. Stone,

Louise A. Conroy, Kate F. Rosemarie A. Hederer [et al.] // J. Immunol. – 1997.

– Vol. 158, № 12. – P.5773-5782.

96. CD45 modulates phosphorylation of both autophosphorylation and negative

regulatory tyrosines of Lyn in B cells / Shigeru Yanagi, Hitoshi Sugawara,

129

Mari Kurosaki [et al.] // J. Biol. Chem. – 1996. – Vol. 271, № 48. – P. 30487-

30492.

97. Rodgers W. Exclusion of CD45 inhibits activity of p56lck associated with

glycolipid-enriched membrane domains / William Rodgers, John K. Rose // J.

Cell Biol. – 1996. – Vol. 135, № 6 Pt. 1. – P. 1515-1523.

98. CD45 tyrosine phosphatase-activated p59fyn

couples the T cell antigen receptor

to pathways of diacylglycerol production, protein kinase C activation and

calcium influx / Masahiro Shiroo, Lindsey Goff, Mark Biffen [et al.] // EMBO

J. – 1992. – Vol. 11, № 13. – P. 4887-4897.

99. Development of T‐leukaemias in CD45 tyrosine phosphatase‐deficient mutant

lck mice / Matthew Baker, John Gamble, Reuben Tooze [et al.] // EMBO J. –

2000. – Vol. 19, № 17. – P. 4644-4654.

100. CD45 is a JAK phosphatase and negatively regulates cytokine receptor

signaling / Junko Irie-Sasaki, Takehiko Sasaki, Wataru Matsumoto [et al.] //

Nature. – 2001. – Vol. 409, № 6818. – P.349-354.

101. Wu L. SKAP55 coupled with CD45 positively regulates T-cell receptor-

mediated gene transcription / Liangtang Wu, Jun Fu, Shi-Hsiang Shen // Mol.

Cell. Biol. – 2002. – Vol. 22, № 8. – P. 2673-2686.

102. Phosphorylation-dependent regulation of T-cell activation by PAG/Cbp, a

lipid raft-associated transmembrane adaptor // Dominique Davidson, Marcin

Bakinowski, Matthew L. Thomas [et al.] // Mol. Cell. Biol. – 2003. – Vol. 23,

№ 6. – P. 2017-2028.

103. Yamada T. CD45 controls interleukin-4-mediated IgE class switch

recombination in human B cell through its function as a janus kinase

phosphatase / Takechiyo Yamada, Daocheng Zhu, Andrew Saxon, Ke Zhang //

J. Biol. Chem. – 2002. – Vol. 277, № 32. – P. 28830-28835.

104. Yakura H. Alleviation of autoimmunity in BXSB mice by monoclonal

alloantibody to Ly-5 (CD45) / Hidetaka Yakura, Tomofumi Ashida, Isao

Kawabata, Makoto Katagiri // Eur. J. Immunol. – 1989. – Vol.19, № 8. – P.

1505-1508.

130

105. An inactivating point mutation in the inhibitory wedge of CD45 causes

lymphoproliferation and autoimmunity / Ravindra Majeti, Zheng Xu, Tristram

G. Parslow [et al.] // Cell. – 200. – Vol.103, № 7. – P. 1059-1070.

106. Penninger J. M. CD45: new jobs for an old acquaintance / Josef M.

Penninger, Junko Iris-Sasaki, Takehiko Sasaki, Antonio J. Oliveira-dos-Santos

// Nat. Imunol. – 2001. – Vol. 2, № 5. – P. 389-396.

107. Prevention and reversal of renal allograft rejection by antibody against

CD45RB / Andrew I. Lazarovits, Sibrand Poppema, Zheng Zhang [et al.] //

Natur. – 1996. – Vol. 380, № 6576 – P. 717-720.

108. Пат. 6106834 США, МКИ A61K 39/395. Use of anti-CD45 leukocyte

antigen antibodies for immunomodulation: Пат. 6106834 США, МКИ A61K

39/395 Andrew I. Lazarovits, Sibarand Poppema; Research Corporation

Technologies Inc. – 08/715342; заяв. 18.09.1996; опубл. 22.08.2000; НКИ

424/172.1.

109. Antibody-mediated targeting of CD45 isoforms: a novel immunotherapeutic

strategy / G. P. Basadonna, L. Auersvald, C. Q. Khuong [et al.] // Proc. Natl.

Acad. Sci. U. S. A. – 1998. – Vol. 95, № 7. – P. 3821-3826.

110. Woodford-Thomas T. A. Expression of a protein tyrosine phosphatase in

normal and v-src-transformed mouse 3T3 fibroblasts / Terry A. Woodford-

Thomas, Janette D. Rhodes, Jack E. Dixon // J. Cell Biol. – 1992. – Vol. 117,

№ 2. – P. 401-414.

111. Denu J. M. Specific and reversible inactivation of protein tyrosine

phosphatases by hydrogen peroxide: evidence for a sulfenic acid intermediate

and implications for redox regulation / John M. Denu, Kirk G. Tanner //

Biochemistry. – 1998. – Vol. 37, № 16. – P. 5633-5642.

112. Redox regulation of protein tyrosine phosphatase 1B involves a sulphenyl-

amide intermediate / Annette Salmeen, Jannik N. Andersen, Michael P. Myers

[et al.] // Nature. – 2003. – Vol. 423, № 6941. – P. 769-773.

113. Mahadev K. Insulin-stimulated hydrogen peroxide reversibly inhibits protein-

tyrosine phosphatase 1B in vivo and enhances the early insulin action cascade /

131

Kalyankar Mahadev, Assaf Zilbering, Li Zhu, Barry J. Goldstein // J. Biol.

Chem. – 2001. – Vol. 276, № 24. – P. 21938-21942.

114. Regulation of insulin signaling through reversible oxidation of the protein-

tyrosine phosphatases TC45 and PTP1B / Tzu-Ching Meng, Deirdre A.

Buckley, Sandra Galic [et al.] // J. Biol. Chem. – 2004. – Vol. 279, № 36. – P.

37716-37725.

115. Lee S.-R. Reversible inactivation of protein-tyrosine phosphatase 1B in A431

cells stimulated with epidermal growth factor / Seung-Rock Lee, Ki-Sun

Kwon, Seung-Ryul Kim, Sue Goo Rhee // J. Biol. Chem. – 1998. – Vol. 273,

№ 25. – P. 15366-15372.

116. Jiang G. Receptor-like protein tyrosine phosphatase α homodimerizes on the

cell surface / Guoqiang Jiang, Jeroen den Hertog, Tony Hunter // Mol. Cell

Biol. – 2000. – Vol. 20, № 16. – P. 5917-5929.

117. Large-scale structural analysis of the classical human protein tyrosine

phosphatome / Alastair J. Barr, Emilio Ugochukwu, Wen Hwa Lee [et al.] //

Cell. – 2009. – Vol. 136, № 2. – P. 352-363.

118. An antibody-based method for monitoring in vivo oxidation of protein

tyrosine phosphatases / Camilla Persson, Kai Kappert, Ulla Engstrom [et al.] //

Methods. – 2005. – Vol. 35, № 1. – P. 37-43.

119. Structure based design of a series of potent and selective non peptidic PTP-1B

inhibitors / Cheuk K. Lau, Christopher I. Bayly, Jacques Yves Gauthier [et al.]

// Bioorg. Med. Chem. Lett. – 2004. – Vol. 14, № 4. – P. 1043-1048.

120. Li X. α,α-Difluoro-β-ketophosphonates as potent inhibitors of protein tyrosine

phosphatase 1B / Xianfeng Li, Ashok Bhandari, Christopher P. Holmes, Anna

K. Szardenings // Bioorg. Med. Chem. Lett. – 2004. – Vol. 14, № 16. – P.

4301-4306.

121. PTP1B inhibitors: synthesis and evaluation of difluoro-methylenephosphonate

bioisosteres on a sulfonamide scaffold / Christopher P. Holmes, Xianfeng Li,

Yijun Pan [et al.] // Bioorg. Med. Chem. Lett. – 2008. – Vol. 18, № 8. – P.

2719-2724.

132

122. Chen Y. T. Divalent and trivalent α-ketocarboxylic acids as inhibitors of

protein tyrosine phosphatases / Yen Ting Chen, Christopher T. Seto // J. Med.

Chem. – 2002. – Vol. 45, № 18. – P. 3946-3952.

123. 2-Aryl-3,3,3-trifluoro-2-hydroxypropionic acids: a new class of protein

tyrosine phosphatase 1B inhibitors / David R. Adams, Achamma Abraham, Jun

Asano [et al.] // Bioorg. Med. Chem. Lett. – 2007. – Vol. 17, № 23. – P. 6579-

6583.

124. Shrestha S. Mono- and disalicylic acid derivatives: PTP1B inhibitors as

potential anti-obesity drugs / Suja Shrestha, Bharat Raj Bhattarai, Keun-

Hyeung Lee, Hyeongjin Cho // Bioorg. Med. Chem. – 2007. – Vol. 15, № 20. –

P. 6535-6548.

125. Synthesis and biological evaluation of novel N-(alkoxyphenyl)-

aminocarbonylbenzoic acid derivatives as PTP1B inhibitors / Yuan Feng Tong,

Pei Zhang, Feng Chen [et al.] // Chin. Chem. Lett. – 2010. – Vol. 21, № 12. –

P. 1415-1418.

126. The difluoromethylenesulfonic acid group as a monoanionic phosphate

surrogate for obtaining PTP1B inhibitors / Carmen Leung, Justyna Grzyb,

Jason Lee [et al.] // Bioorg. Med. Chem. – 2002. – Vol. 10, № 7. – P. 2309-

2323.

127. Novel 2-aryl-naphtho[1,2-d]oxazole derivatives as potential PTP-1B

inhibitors showing antihyperglycemic activities / Atul Kumar, Pervez Ahmad,

Ram Awatar [et al.] // Eur. J. Med. Chem. – 2009. – Vol. 44, № 1. – P.109-

116.

128. 5-Arylidene-2,4-thiazolidinediones as inhibitors of protein tyrosine

phosphatases / Rosanna Maccari, Paoli Rosaria Ottana, Michela Jacomelli [et

al.] // Bioorg. Med. Chem. – 2007. – Vol. 15, № 15. – 5137-5149.

129. Isothiazolidinone inhibitors of PTP1B containing imidazoles and imidazolines

/ Brent Douty, Brian Wayland, Paul J. Ala [et al.] // Bioorg. Med. Chem. Lett.

– 2008. – Vol. 18, № 1. – P. 66-71.

133

130. Synthesis, in vitro and computational studies of protein tyrosine phosphatase

1B inhibition of a small library of 2-arylsulfonylaminobenzothiazoles with

antihyperglycemic activity / Gabriel Navarrete-Vazquez, Paolo Paoli, Ismael

Leon-Rivera [et al.] // Bioorg. Med. Chem. – 2009. – Vol. 17, № 9. – P. 3332-

3341.

131. Isoxazol‐5 (4H) one derivatives as PTP1B inhibitors showing an anti‐obesity

effect / Bhooshan Kafle, Nikanth G. Aher, Deegendra Khadka [et al.] // Chem.

Asian. J. – 2011. – Vol. 6, № 8. – P. 2073-2079.

132. Synthesis and biological evaluation of 4, 4-dimethyl lithocholic acid

derivatives as novel inhibitors of protein tyrosine phosphatase 1B / Hai-Bing

He, Li-Xin Gao, Qi-Feng Deng [et al.] // Bioorg. Med. Chem. Lett. – 2012. –

Vol. 22, № 23. – P. 7237-7242.

133. Acquisition of a potent and selective TC-PTP inhibitor via a stepwise

fluorophore-tagged combinatorial synthesis and screening strategy / Sheng

Zhang, Lan Chen, Yong Luo [et al.] // J. Am. Chem. Soc. – 2009. – Vol. 131,

№ 36. – P. 13072-13079.

134. Potent and selective inhibition of T-cell protein tyrosine phosphatase

(TCPTP) by a dinuclear copper (II) complex / Caixia Yuan, Miaoli Zhu,

Qingming Wang [et al.] // Chem. Commun. – 2012. – Vol. 48, № 8. – P. 1153-

1155.

135. Manzamenones inhibit T-cell protein tyrosine phosphatase / Yusuke Wakuda,

Takaaki Kubota, Hiroshi Shima [et al.] // Mar. Drugs. – 2006. – Vol. 4, № 1. –

P. 9-14.

136. Potent reversible inhibitors of the protein tyrosine phosphatase CD45 /

Rebecca A. Urbanek, Suzanne J. Suchard, Gary B. Steelman [et al.] // J. Med.

Chem. – 2001. – Vol. 44, № 11. – P.1777-1793.

137. Reduced expression of CD45 protein-tyrosine phosphatase provides

protection against anthrax pathogenesis / Rekha G. Panchal, Ricky L. Ulrich,

Steven B. Bradfute [et al.] // J. Biol. Chem. – 2009. – Vol. 284, № 19. –

P.12874-12885.

134

138. Synthesis and characterization of a potent and selective protein tyrosine

phosphatase inhibitor, 2-[(4-methylthiopyridin-2-

yl)methylsulfinyl]benzimidazole / Takuya Hamaguchi, Akiko Takahashi,

Terumi Kagamizono [et al.] // Bioorg. Med. Chem. Lett. – 2000. – Vol. 10, №

23. – P.2657-2660.

139. Small molecule inhibitors of SHP2 tyrosine phosphatase discovered by virtual

screening / Zhi-Hong Yu, Lan Chen, Li Wu [et al.] // Bioorg. Med. Chem. Lett.

– 2011. – Vol. 21, № 14. – P.4238-4242.

140. Discovery of a novel Shp2 protein tyrosine phosphatase inhibitor / Liwei

Chen, Shen-Shu Sung, M. L. Richard Yip [et al.] // Mol. Pharmacol. – 2006. –

Vol. 70, № 2. – P.562-570.

141. Inhibitors of Src homology-2 domain containing protein tyrosine

phosphatase-2 (Shp2) based on oxindole scaffolds / Harshani R. Lawrence,

Roberta Pireddu, Liwei Chen [et al.] // J. Med. Chem. – 2008. – Vol. 51, № 16.

– P.4948-4956.

142. Salicylic acid based small molecule inhibitor for the oncogenic Src

homology-2 domain containing protein tyrosine phosphatase-2 (SHP2) / Xian

Zhang, Yantao He, Sijiu Liu [et al.] // J. Med. Chem. – 2010. – Vol. 53, № 6. –

P.2482-2493.

143. SHP2 is a target of the immunosuppressant tautomycetin / Sijiu Liu, Zhihong

Yu, Xiao Yu [et al.] // Chem. Boil. – 2011. – Vol. 18, № 1. – P.101-110.

144. Pathak M. K. Sodium stibogluconate is a potent inhibitor of protein tyrosine

phosphatases and augments cytokine responses in hemopoietic cell lines /

Manas K. Pathak, Taolin Yi // J. Immunol. – 2001. – Vol. 167, № 6. – P.3391-

3397.

145. Inhibition of PTP1B by trodusquemine (MSI-1436) causes fat-specific weight

loss in diet-induced obese mice / Kristen A. Lantz, Susan G. Emeigh Hart,

Sonia L. Planey [et al.] // Obesity (Silver Spring). – 2010. – Vol. 18, № 8. – P.

1516-1523.

135

146. Evidence for inhibition of HIF-1α prolyl hydroxylase 3 activity by four

biologically active tetraazamacrocycles / Jing Cao, Zhirong Geng, Xiaoyan [et

al.] // Org. Biomol Chem. – 2012. – Vol. 10, № 19. – P. 3913-3923.

147. Novel mechanism of blocking axonal Na+ channels by three macrocyclic

polyamine analogues and two spider toxins / Masuhide Yakehiro, Yasuo

Furukawa, Tohru Koike [et al.] // Br. J. Pharmacol. – 2001. – Vol. 132, № 1. –

P. 63-72.

148. Sibert J. W. Lipophilic derivatives of cyclam as new inhibitors of tumor cell

growth / John W. Sibert, Ann H. Cory, Joseph G. Cory // Chem. Commun. –

2002. – P. 154-155.

149. Simple and dendritic cyclam derivatives. Photophysical properties, effect of

protonation and Zn2+ coordination, preliminary screening as inhibitors of

tumour cell growth / Christophe Saudan, Paola Ceroni, Veronica Vicinelli [et

al.] // Supramol. Chem. – 2004. – Vol. 16, № 8. – P. 541-548.

150. Macrocyclic polyamines deplete cellular ATP levels and inhibit cell growth in

human prostate cancer cells / Benjamin Frydman, Subhra Bhattacharya,

Aparajita Sarkar [et al.] // J. Med. Chem. – 2004. – Vol. 47, № 4. – P. 1051-

1059.

151. Incorporation of bulky and cationic cyclam‐triazole moieties into marimastat

can generate potent MMP inhibitory activity without inducing cytotoxicity /

Mingfeng Yu, Ngee H. Lim, Samantha Ellis [et al.] // Chemistry Open. – 2013.

– Vol. 2, № 3. – P. 99-105.

152. Syntheses of ruthenium(II) quinonediimine complexes of cyclam and

characterization of their DNA-binding activities and cytotoxicity / Hing-Leung

Chan, Heng-Qian Liu, Biing-Chiau Tzeng [et al.] // Inorg. Chem. – 2002. –

Vol. 41, № 12. – P. 3161-3171.

153. Demirbilek M. Effects of copper-cyclam and copper-cyclam/polymer

complexes on HeLa cells / Murat Demirbilek, Erhan Piskin // Hacettepe J.

Biol. Chem. – 2008. – Vol. 36, № 4. – P. 263-271.

136

154. Synthesis, electrochemical, magnetic, catalytic and antimicrobial studies of N-

functionalized cyclam based trinuclear copper(II) and nickel(II) complexes / S.

Sreedaran, K. Shanmuga Bharathi, A. Kalilur Rahiman [et al.] // J. Incl.

Phenom. Macrocycl. Chem. – 2010. – Vol. 66, № 3-4. – P. 297-306.

155. Novel nickel cyclam complexes with potent antimicrobial and cytotoxic

properties / M. Abdul Alim Al-Bari, M. K. Basar Chowdhury, M. Faruk [et al.]

// J. Appl. Sci. Res. – 2007. – Vol. 3, № 11. – P. 1251-1261.

156. Two new halocuprates complexes [CuII (1,4,8,11-

tetraazacyclotetradecane)][CuICl3] and [H4(1,4,8,11-

tetrazacyclotetradecane)][Cu2ICl6]: synthesis, characterizations and biological

studies / Mohammed Lachkar, Ilham Halim, Abdoulillah Bezgour [et al.] //

Med. Chem. Res. – 2012. – Vol. 21, № 12. – P. 4290-4300.

157. DNA-binding property and antitumor activity of a cyclam bridged dinuclear

platinum(II) complex / Zihua Xu, Yangmiao Zhang, Zuqin [et al.] // Inorg.

Chim. Acta. – 2009. – Vol. 362, № 7. – P. 2347-2352.

158. Franz J. The production of 99mTc-labeled conjugated antibodies using a

cyclam-based bifunctional chelating agent / J. Franz, W. A. Volkert, E. K.

Barefield, R. A. Holmes // Int. J. Rad. Appl. Instrum. B. – 1987. – Vol. 14, №

6. – P. 569-572.

159. Stahl W. 99m

Technetium labelling of antibodies using methylphosphonylated,

bifunctional cyclams as chelators / Wilhelm Stahl, Ludwig Kuhlmann,

Matthias Wiesner, Axel Walch // Bioorg. Med. Chem. Lett. – 1994. – Vol. 4,

№ 6. – P. 2597-2600.

160. Preparation, characterization and biological evaluation of 99m

Tc(CO)3‐labelled

cyclic polyamines / H. P. Vanbilloen, K. Eraets, N. Evens [et al.] // J. Label.

Compd. Radiopharm. – 2005. – Vol. 48, № 14. – P. 1003-1011.

161. 99m

Tc-N4amG: synthesis biodistribution and imaging in breast tumor-bearing

rodents / Ning Tsao, Mithu Chanda, Dong-Fang Yu [et al.] // Appl. Radiat.

Isot. – 2013. – Vol. 72. – P. 105-113.

137

162. A technetium-99m-labelled cyclam acid porphyrin (CAP) for tumour imaging

/ S. Murugesan, S. J. Shetty, T. S. Srivastava [et al.] // Appl. Radiat. Isot. –

2001. – Vol. 55, № 5. – P. 641-646.

163. Development of 99m

Tc-N4-NIM for molecular imaging of tumor hypoxia /

Mohammad S. Ali, Fan-Lin Kong, Alex Rollo [et al.] // J. Biomed. Biotechnol.

– 2012. – Vol. 2012, Article ID 828139. – P. 1-9.

164. CD4/T4 receptor peptide ligand labeled with technetium-99m: synthesis and

biological activity / Alessandra Boschi, Licia Uccelli, Cristina Bolzati [et al.] //

Nucl. Med. Biol. – 2000. – Vol. 27, № 8. – P. 791-795.

165. Synthesis and evaluation of amino acid-based radiotracer 99m

Tc-N4-AMT for

breast cancer imaging / Fan-Lin Kong, Mohammad S. Ali, Yinhan Zhang [et

al.] // J. Biomed. Biotechnol. – 2011. – Vol. 2011, Article ID 276907. – P. 1-7.

166. Stability and structure of activated macrocycles. Ligands with biological

applications / Ramunas J. Motekaitis, Buck E. Rogers, David E. Reichert [et

al.] // Inorg. Chem. – 1996. – Vol. 35, № 13. – P. 3821-3827.

167. Comparative in vivo stability of copper-64-labeled cross-bridged and

conventional tetraazamacrocyclic complexes / C. Andrew Boswell, Xiankai

Sun, Weijun Niu [et al.] // J. Med. Chem. – 2004. – Vol. 47, № 6. – P. 1465-

1474.

168. Antibody labeling with copper-67 using the bifunctional macrocycle 4-

[(1,4,8,11-tetraazacyclotetradec-1-yl)methyl]benzoic acid / Peter M. Smith-

Jones, Raimund Fridrich, Thomas A. [et al.] // Bioconjug. Chem. – 1991. –

Vol. 2, № 6. – 415-421.

169. Synthesis of a cross-bridged cyclam derivative for peptide conjugation and

64Cu radiolabeling / C. Andrew Boswell, Celeste A. S. Regino, Kwamena E.

Baidoo [et al.] // Bioconjug. Chem. – 2008. – Vol. 19, № 7. – P. 1476-1484.

170. A novel side-bridged hybrid phosphonate/acetate pendant cyclam: synthesis,

characterization, and 64

Cu small animal PET imaging / C. Andrew Boswell,

Celeste A. S. Regio, Kwamen E. Baidoo [et al.] // Bioorg. Med. Chem. – 2009.

– Vol. 17, № 2. – P. 548-552.

138

171. A novel technology for the imaging of acidic prostate tumors by positron

emission tomography / Amy L. Vavere, Garainne B. Biddlecombe, William M.

Spees [et al.] // Cancer Res. – 2009. – Val. 69, № 10. – P. 4510-4516.

172. In vitro and in vivo evaluation of 64

Cu-radiolabeled KCCYSL peptides for

targeting epidermal growth factor receptor-2 in breast carcinomas / Senthi R.

Kumar, Fabio A. Gallazzi, Riccardo Ferdani [et al.] // Cancer Biother.

Radiopharm. – 2010. – Vol. 25, № 6. – P. 693-703.

173. A novel tetrabranched neurotensin (8–13) cyclam derivative: synthesis, 64

Cu-

labeling and biological evaluation / Anika Rohrich, Ralf Bergmann, Anne

Ketzschmann [et al.] // J. Inorg. Biochem. – 2011. – Vol. 105, № 6. – P. 821-

832.

174. 64

Cu-Labeled CB-TE2A and diamsar-conjugated RGD peptide analogs for

targeting angiogenesis: comparison of their biological activity / Lihui Wei,

Yunpeng Ye, Thaddeus J. Wadas [et al.] // Nucl. Med. Biol. – 2009. – Vol. 36,

№ 3. – P. 277-285.

175. Noninvasive visualization and quantification of tumor αvβ3 integrin

expression using a novel positron emission tomography probe, 64

Cu-cyclam-

RAFT-c(-RGDfK-)4 / Zhao-Hui Jin, Takako Furukawa, Mathieu Galibert [et

al.] // Nucl. Med. Biol. – 2011. – Vol. 38, № 4. – P. 529-540.

176. Positron emission tomography imaging of tumor angiogenesis and monitoring

of antiangiogenic efficacy using the novel tetrameric peptide probe 64

Cu-

cyclam-RAFT-c(-RGDfK-)4 / Zhao-Hui Jin, Takako Furukawa, Michael

Claron [et al.] // Angiogenesis. – 2012. – Vol. 15, № 4. – P. 569-580.

177. Micro–positron emission tomography/contrast-enhanced computed

tomography imaging of orthotopic pancreatic tumor–bearing mice using the

αvβ3 integrin tracer 64

Cu-labeled cyclam-RAFT-c(-RGDfK-)4 / Winn Aung,

Zhao-Hui Jin, Takako Furukawa [et al.] // Mol. Imaging. – 2013. – Vol. 12, №.

– P. 376-387.

178. Jiang M. Comparison of two cross-bridged macrocyclic chelators for the

evaluation of 64

Cu-labeled-LLP2A, a peptidomimetic ligand targeting VLA-4-

139

positive tumors / Majiong Jiang, Riccardo Ferdani, Monica Shokeen, Carolyn

J. Anderson // Nucl. Med. Biol. – 2013. – Vol. 40, № 2. – P. 245-251.

179. Evaluation of 64

Cu labeled GX1: a phage display peptide probe for PET

imaging of tumor vasculature / Kai Chen, Xilin Sun, Gang Niu [et al.] // Mol.

Imaging Biol. – 2012. – Vol. 14, № 1. – P. 96-105.

180. Radioimmunotherapy with a 64

Cu-labeled monoclonal antibody: a comparison

with 67

Cu / Judith M. Connett, Carolyn J. Anderson, Li-Wu Guo [et al.] // Proc.

Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 1996. – Vol. 93, № 13. – P. 6814-6818.

181. Synthesis and radiolabeling of a somatostatin analog for multimodal imaging /

W. Barry Edwards, Kexian Liang, Baogang Xu [et al.] // Proc. SPIE – 2006. –

Vol. 6097. – P. 609701-609708.

182. Guo Y. Preparation and biological evaluation of 64

Cu labeled Tyr3-octreotate

using a phosphonic acid-based cross-bridged macrocyclic chelator / Yunjun

Guo, Riccardo Ferdani, Carolyn J. Anderson // Bioconjugate Chem. – 2012. –

Vol. 23, № 7. – P. 1470-1477.

183. Improved PET imaging of uPAR expression using new 64

Cu-labeled cross-

bridged peptide ligands: comparative in vitro and in vivo studies / Morten

Persson, Masood Hosseini, Jacob Madsen [et al.] // Theranostics. – 2013. –

Vol. 3, № 9. – P. 618-632.

184. Evolution of bombesin conjugates for targeted PET imaging of tumors /

Hanwen Zhang, Keelara Abiraj, Daniel L. Thorek [et al.] // Plos One. – 2012. –

Vol. 7, № 9. – P. e44046.

185. 64

Cu-AMD3100 – a novel imaging agent for targeting chemokine receptor

CXCR4 / Orit Jacobson, Ido D. Weiss, Lawrence Szajek [et al.] // Bioorg.

Med. Chem. – 2009. – Vol. 17, № 4. – P. 1486-1493.

186. Molecular imaging of CXCR4 receptor expression in human cancer

xenografts with [64

Cu] AMD3100 positron emission tomography / Sridhar

Nimmagadda, Mrudula Pullambhatla, Kristie Stone [et al.] // Cancer Res. –

2010. – Vol. 70, № 10. – P. 3935-3944.

140

187. Imaging CXCR4 expression in human cancer xenografts: evaluation of

monocyclam 64

Cu-AMD3465 / Ravindra A. De Silva, Kevin Peyre, Mrudula

Pullambhatla [et al.] // J. Nucl. Med. – 2011. – Vol. 52, № 6. – P. 986-993.

188. Molecular Imaging and Contrast Agent Database (MICAD) [Електронний

ресурс] // Bethesda (MD): National Center for Biotechnology Information

(US). – 2004-2013. Режим доступу до книги:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK5330/.

189. β-gal gene expression MRI reporter in melanoma tumor cells. Design,

synthesis, and in vitro and in vivo testing of a Gd(III) containing probe forming

a high relaxivity, melanin-like structure upon β-gal enzymatic activation /

Francesca Arena, Jebasingh Bhagavath Singh, Eliana Gianolio [et al.] //

Bioconjugate Chem. – 2011. – Vol. 22, № 12. – P. 2625-2635.

190. Cyclam (1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane) with one methylphosphonate

pendant arm: a new ligand for selective copper(II) binding / Silvia Fuzerova,

Jan Kotek, Ivana Cisarova [et al.] // Dalton Trans. – 2005. – P. 2908-2915.

191. Cyclam based Hg(II)-and Cu(II)-selective fluoroionophore having appended

pyrene function / Na Jin Youn, Jun Soo Kim, Ki Cheol Song [et al.] // Bull.

Korean Chem. Soc. – 2005. – Vol. 26, № 5. – P. 849-851.

192. Kim S. H. Hg2+

-selective OFF-ON and Cu2+

-selective ON-OFF type

fluoroionophore based upon cyclam / So Hee Kim, Jun Soo Kim, Sang Mi

Park, Suk-Kyu Chang // Org. Lett. – 2006. – Vol. 8, № 3. – P. 371-374.

193. A cyclam-type “turn on” fluorescent sensor selective for mercury ions in

aqueous media / Styliani Voutsadaki, George K. Tsikalas, Emmanuel Klontzas

[et al.] // RSC Advances. – 2012. – Vol. 2, № 33. – P. 12679-12682.

194. A synthetically simple, click-generated cyclam-based zinc(II) sensor /

Emiliano tamanini, Arna Katewa, Lisa M. Sedger [et al.] // Inorg. Chem. –

2009. – Vol. 48, № 1. – P. 319-324.

195. Cyclam-based “clickates”: homogeneous and heterogeneous fluorescent

sensors for Zn(II) / Emiliano tamanini, Kevin Flavin, Majid Motevalli [et al.] //

Inorg. Chem. – 2010. – Vol. 49, № 8. – P. 3789-3800.

141

196. Cyclam-methylbenzimidazole: a selective OFF-ON fluorescent sensor for

zinc / Abir El Majzoub, Cyril Cadiou, Isabelle Dechamps-Olivier [et al.] //

Inorg. Chem. – 2011. – Vol. 50, № 9. – P. 4029-4038.

197. Moore J. P. Coreceptors: implications for HIV pathogenesis and therapy /

John P. Moore // Science. – 1997. – Vol. 276, № 5309. – P. 51-52.

198. Rapid mobilization of murine and human hematopoietic stem and progenitor

cells with AMD3100, a CXCR4 antagonist / Hal E. Broxmeyer, Christie M.

Orschell, D. Wade Clapp [et al.] // J. Exp. Med. – 2005. – Vol. 201, № 8. – P.

1307-1318.

199. Ramsey D. M. Halting metastasis through CXCR4 inhibition / Deborah M.

Ramsey, Shelli R. McAlpine // Bioorg. Med. Chem. – 2005. – Vol. 23, № 1. –

P. 20-25.

200. CXCR4 regulates growth of both primary and metastatic breast cancer /

Matthew C. P. Smith, Kathryn E. Leuker, Joel R. Garbow [et al.] // Cancer Res.

– 2004. – Vol. 64, № 23. – P. 8604-8612.

201. Inhibition of human immunodeficiency virus proliferation by macrocyclic

polyamines and their metal complexes / Yoshio Inouye, Tatsuyuki Kanamori,

Tetsuya Yoshida [et al.] // Biol. Pharm. Bull. – 1994. – Vol. 17, № 2. – P. 243-

250.

202. Potent and selective inhibition of human immunodeficiency virus (HIV)-1 and

HIV-2 replication by a class of bicyclams interacting with a viral uncoating

event / Erik De Clercq, Naohiko Yamamoto, Rudi Pauwels [et al.] // Proc. Natl.

Acad. Sci. U. A. S. – 1992. – Vol. 89, № 12. – P. 5286-5290.

203. Highly potent and selective inhibition of human immunodeficiency virus by

the bicyclam derivative JM3100 / Erik De Clercq, Naohoko Yamamoto, Rudi

Pauwels [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 1994. – Vol. 38, № 4. – P.

668-674.

204. De Clercq E. Antiviral therapy for human immunodeficiency virus infections /

Erik De Clercq // Clin. Microbiol. Rev. – 1995. – Vol. 8, № 2. – P. 200-239.

142

205. Bicyclams, selective antagonists of the human chemokine receptor CXCR4,

potently inhibit feline immunodeficiency virus replication / Herman F.

Egberink, Erik De Clercq, Arno L. W. Van Vliet [et al.] // J. Virol. – 1999. –

Vol. 73, № 8. – P. 6346-6352.

206. Efficacy and adverse effects of the antiviral compound plerixafor in feline

immunodeficiency virus‐infected cats / K. Hartmann, C. Stengel, D. Klein [et

al.] // J. Vet. Intern. Med. – 2012. – Vol. 26, № 3. – P. 483-490.

207. De Clercq E. Antiviral metal complexes / Erik De Clercq // Met. Based

Drugs. – 1997. – Vol. 4, № 3. – P. 173-192.

208. Oxovanadium(IV) cyclam and bicyclam complexes: potential CXCR4

receptor antagonists / Allison Ross, Dinesh C. Soares, Danielle Covelli [et al.]

// Inorg. Chem. – 2009. – Vol. 49, № 3. – P. 1122-1132.

209. Configurationally restricted bismacrocyclic CXCR4 receptor antagonists /

Gina C. Valks, Graeme McRobbie, Elizabeth A. Lewis [et al.] // J. Med. Chem.

– 2006. – Vol. 49, № 21. – P. 6162-6165.

210. Synthesis and structure − activity relationships of azamacrocyclic CXC

chemokine receptor 4 antagonists: analogues containing a single

azamacrocyclic ring are potent inhibitors of T-cell tropic (X4) HIV-1

replication / Gary J. Bridger, Renato T. Skerlj, Pedro E. Hernandez-Abad [et

al.] // J. Med. Chem. – 2010. – Vol. 53, № 3. – P. 1250-1260.

211. Inhibition of human immunodeficiency virus replication by a dual

CCR5/CXCR4 antagonist / Katrien Princen, Sigrid Hatse, Kurt Vermeire [et

al.] // J. Virol. – 2004. – Vol. 78, № 23. – P. 12996-13006.

212. The molecular target of bicyclams, potent inhibitors of human

immunodeficiency virus replication / Karen De Vreese, Vera Kofler-Mongold,

Claudia Leutgeb [et al.] // J. Virol. – 1996. – Vol. 70, № 2. – P. 689-696.

213. Sensitivity of human immunodeficiency virus to bicyclam derivatives is

influenced by the three-dimensional structure of gp120 / Karen De Vreese, Ilse

Van Nerum, Kurt Vermeire [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 1997. –

Vol. 41, № 12. – P. 2616-2620.

143

214. Development of resistance of human immunodeficiency virus type 1 to

dextran sulfate associated with the emergence of specific mutations in the

envelope gp120 glycoprotein / Jose A. Este, Dominique Shols, Karen De

Vreese [et al.] // Mol. Pharmacol. – 1997. – Vol. 52, № 1. – P. 98-104.

215. Hammond J. W. Mutations in retroviral genes associated with drug resistance

/ John W. Mellors, Raymond F. Schinazi, Brendan A. Larder // Human

retroviruses and AIDS. – 1998. – P. III-206-III-241.

216. Determinants for sensitivity of human immunodeficiency virus coreceptor

CXCR4 to the bicyclam AMD3100 / Beatrice Labrosse, Anne Brelot, Nikolaus

Heveker [et al.] // J. Virol. – 1998. – Vol. 72, № 8. – P. 6381-6388.

217. AMD3100, a small molecule inhibitor of HIV-1 entry via the CXCR4 co-

receptor / George A. Donzella, Dominique Schols, Steven W. Lin [et al.] //

Nat. Med. – 1998. – Vol. 4, № 1. – P. 72-77.

218. Gerlach L. O. Molecular interactions of cyclam and bicyclam non-peptide

antagonists with the CXCR4 chemokine receptor / Lars Ole Gerlach, Renato T.

Skerlj, Gary J. Bridger, True W. Schwartz // J. Biol. Chem. – 2001. – Vol. 276,

№ 16. – P. 14153-14160.

219. Lipid bilayer simulations of CXCR4 with inverse agonists and weak partial

agonists / John O. Trent, Zi-xuan Wang, James L. Murray [et al.] // J. Biol.

Chem. – 2003. – Vol. 278, № 47. – P. 47136-47144.

220. Molecular mechanism of AMD3100 antagonism in the CXCR4 receptor:

transfer of binding site to the CXCR3 receptor / Mette M. Rosenkilde, Lars-Ole

Gerlach, Janus S. Jakobsen [et al.] // J. Biol. Chem. – 2004. – Vol. 279, № 4. –

P. 3033-3041.

221. Metal ion enhanced binding of AMD3100 to Asp262 in the CXCR4 receptor /

Lars Ole Gerlach, Janus S. Jakobsen, Kasper P. Jansen [et al.] // Biochemistry.

– 2003. – Vol. 42, № 3. – P. 710-717.

222. AMD3465, a monomacrocyclic CXCR4 antagonist and potent HIV entry

inhibitor / Sigrid Hatse, Katrien Princen, Erik De Clercq [et al.] // Biochem.

Pharmacol. – 2005. – Vol. 70, № 5. – P. 752-761.

144

223. Molecular mechanism of action of monocyclam versus bicyclam non-peptide

antagonists in the CXCR4 chemokine receptor / Mette M. Rosenkilde, Lars-

Ole Gerlach, Sigrid Hatse [et al.] // J. Biol. Chem. – 2007. – Vol. 282, № 37. –

P. 27354-27365.

224. Pharmacokinetics and safety of AMD-3100, a novel antagonist of the CXCR-

4 chemokine receptor, in human volunteers / Craig W. Hendrix, Charles

Flexner, Ronald T. MacFarland [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. –

2000. – Vol. 44, № 6. – P. 1667-1673.

225. AMD3100 mobilizes hematopoietic stem cells with long-term repopulating

capacity in nonhuman primates / Andre Larochelle, Allen Krouse, Mark

Metzger [et al.] // Blood. – 2006. – Vol. 107, № 9. – P. 3772-3778.

226. Successful stem cell remobilization using plerixafor (mozobil) plus

granulocyte colony-stimulating factor in patients with non-hodgkin lymphoma:

results from the plerixafor NHL phase 3 study rescue protocolet / Ivana N.

Micallef, Patrick J. Stiff, John F. Dipersio [et al.] // Biol. Blood Marrow

Transplant. – 2009. – Vol. 15, № 12. – P. 1578-1586.

227. Avramova B. E. Successful mobilization of peripheral blood stem cells in

children with cancer using plerixafor (Mozobil™

) and granulocyte-colony

stimulating factor / Boryana E. Avramova, Maya N. Yordanova, Dobrin N.

Konstantinov, Dragan G. Bobev // Drug Des. Dev. Ther. – 2011. – Vol. 5. – P.

407-409.

228. Plerixafor (Mozobil) for stem cell mobilization in patients with multiple

myeloma previously treated with lenalidomide // I. N. M. Micallef, A. D. Ho,

L. M. Klein [et al.] // Bone Marrow Transplant. – 2011. – Vol. 46, № 3. – P.

350-355.

229. C60: buckminsterfullerene / H. W. Kroto, J. R. Heath, S. C. O`Brien [et al.] //

Nature. – Vol. 318, № 6042. – P. 162-163.

230. Смолли Р. Е. Открывая фуллерены / Р. Е. Смолли // УФН. – 1998. – Т.

168, № 3. – С. 323-330.

145

231. Елецкий А. В. Сорбционные свойства углеродных наноструктур / А. В.

Елецкий // УФН. – 2004. Т. 174, № 11. – С. 1191-1231.

232. Gorman J. Buckymedicine: сoming soon to a pharmacy near you? /J. Gorman

// Sci. News. – 2002. – Vol. 162, № 2. – P. 26-28.

233. Nakamura E. Functionalized fullerenes in water. The first 10 years of their

chemistry, biology, and nanoscience / Eiichi Nakamura, Hiroyuki Isobe // Acc.

Chem. Res. – 2003. – Vol. 36, № 11. – P. 807-815.

234. Grebowski J. Fullerenols as a new therapeutic approach in nanomedicine /

Jacek Grebowski, Paulina Kazmierska, Anita Krokosz // Biomed. Res. Int. –

2013. – Vol. 2013, Article ID 751913. – P. 751913-751922.

235. Zhou Z. Liposome formulation of fullerene-based molecular diagnostic and

therapeutic agents / Zhiguo Zhou // Pharmaceutics. – 2013. – Vol. 5, № 4. – P.

525-541.

236. Yang X. Fullerene – biomolecule conjugates and their biomedicinal

applications / Xinlin Yang, Ali Ebrahimi, Jie Li, Quanjun Cui // Int. J.

Nanomedicine. – 2014. – Vol. 9. – P. 77-92.

237. Inhibition of the HIV-1 protease by fullerene derivatives: model building

studies and experimental verification / Simon H. Friedman, Dianne L.

DeCamp, Rant P.Sijbesma [et al.] // J. Am. Chem. Soc. – 1993. – Vol. 115, №

15. – P. 6506-6509.

238. Debouck C. The HIV-1 protease as a therapeutic target for AIDS / C.

Debouck // AIDS Res. Hum. Retroviruses. – 1992. – Vol. 8, № 2. – P. 153-

164.

239. Synthesis and virucidal activity of a water-soluble, configurationally stable,

derivatized C60 fullerene / Raymond F. Schinazi, Rint Sijbesma, Gordana

Srdanov [et al.] // Antimicrob. Agents Chemother. – 1993. – Vol 37, № 8. – P.

1707-1710.

240. Biological activity of water-soluble fullerenes. Structural dependence of DNA

cleavage, cytotoxicity, and enzyme inhibitory activities including HIV-protease

146

inhibition / Eiichi Nakamura, Hidetoshi Tokuyama, Shigeru Yamago [et al.] //

Bull. Chem. Soc. Jpn. – 1996. – Vol. 69, № 8. – P. 2143-2151.

241. Friedman S. H. Optimizing the binding of fullerene inhibitors of the HIV-1

protease through predicted increases in hydrophobic desolvation / Simon H.

Friedman, Padma S. Ganapathi, Yves Rubin, George L. Kenyon // J. Med.

Chem. – 1998. – Vol. 41, № 13. – P. 2424-2429.

242. Structural analysis of lead fullerene-based inhibitor bound to human

immunodeficiency virus type 1 protease in solution from molecular dynamics

simulations / Vannajan S. Lee, Piyarat Nimmanpipug, Ornjira Aruksakunwong

[et al.] // J. Mol. Graph. Model. – 2007. – Vol. 26, № 2. – P. 558-570.

243. Design and synthesis of novel [60]fullerene derivatives as potential HIV

aspartic protease inhibitors / Gian Luca Marcorin, Tatiana Da Ros, Sabrina

Castellano [et al.] // Org. Lett. – 2000. – Vol. 2, № 25. – P. 3955-3958.

244. Durdagi S. Computational design of novel fullerene analogues as potential

HIV-1 PR inhibitors: analysis of the binding interactions between fullerene

inhibitors and HIV-1 PR residues using 3D QSAR, molecular docking and

molecular dynamics simulationset / Serdar Durdagi, Thomas Mavromoustakos,

Nikos Chronakis, Manthos G. Papadopoulos // Bioorg. Med. Chem. – 2008. –

Vol. 16, № 23. – P. 9957-9974.

245. Durdagi S. 3D QSAR CoMFA/CoMSIA, molecular docking and molecular

dynamics studies of fullerene-based HIV-1 PR inhibitors / Serdar Durdagi,

Thomas Mavromoustakos, Manthos G. Papadopoulos // Bioorg. Med. Chem. –

2008. – Vol. 18, № 23. – P. 6283-6289.

246. In silico drug screening approach for the design of magic bullets: a successful

example with anti-HIV fullerene derivatized amino acids / Serdar Durdagi,

Claudiu T. Supuran, T. Amanda Strom [et al.] // J. Chem. Inf. Modl. – 2009. –

Vol. 49, № 5. – P. 1139-1143.

247. Structural and electronic properties of new fullerene derivatives and their

possible application as HIV-1 protease inhibitors / Medhat Ibrahim, Noha A.

147

Saleh, Ali Jameel Hameed [et al.] // Spectrochim. Acta, Part A. – 2010. – Vol.

75, № 2. – P. 702-709.

248. Binding of novel fullerene inhibitors to HIV-1 protease: insight through

molecular dynamics and molecular mechanics Poisson-Boltzmann surface area

calculations / Haralambos Tzoupis, Georgios Leonis, Serdar Durdagi [et al.] //

J. Coput. Aided. Mol. Des. – 2011. – Vol. 25, № 10. – P. 959-976.

249. Receptor-and ligand-based study of fullerene analogues: comprehensive

computational approach including quantum-chemical, QSAR and molecular

docking simulations / Lucky Ahmed, Bakhtiyor Rasulev, Malakhat Turabekova

[et al.] // Org. Biomol. Chem. – 2013. – Vol. 11, № 35. – P. 5798-5808.

250. The reverse transcriptase of HIV-1: from enzymology to therapeutic

intervention / Laura Tarrago-Litvak, Marie-Line Andreola, Georgyi A.

Nevinsky [et al.] // FASEB J. – 1994. – Vol. 8, № 8. – P. 497-503.

251. Human immunodeficiency virus-reverse transcriptase inhibition and hepatitis

C virus RNA-dependent RNA polymerase inhibition activities of fullerene

derivatives / Tadahiko Mashino, Kumiko Shimotohno, Noriko Ikegami [et al.]

// Bioorg. Med. Chem. Lett. – 2005. – Vol. 15, № 4. – P. 1107-1109.

252. Synthesis and biological activity of a novel water-soluble

methano[60]fullerene tetracarboxylic derivative /Alexey B. Kornev, Alexander

S. Peregudov, Vyacheslav M. Martynenko [et al.] // Mendeleev Commun. –

2013. – Vol. 23, № 6. – P. 323-325.

253. Chlorofullerene C60Cl6: a precursor for straightforward preparation of highly

water-soluble polycarboxylic fullerene derivatives active against HIV / Olesya

A. Troshina, Pavel A. Troshin, Alexander S. Peregudov [et al.] // Org. Biomol.

Chem. – 2007. – Vol. 5, № 17. – P. 2783-2791.

254. Synthesis and antiviral activity of highly water-soluble polycarboxylic

derivatives of [70]fullerene / Alexey B. Kornev, Alexander S. Peregudov,

Vyacheslav M. Martynenko [et al.] // Chem. Commun. – 2011. – Vol. 47, №

29. – P. 8298-8300.

148

255. Anti-influenza activity of C60 fullerene derivatives / Masaki Shoji, Etsuhisa

Takahashi, Dai Hatakeyama [et al.] // Plos One. – 2013. – Vol. 8, № 6. – P.

e66337.

256. Carboxylic fullerene C60 derivatives: efficient microbicides against herpes

simplex virus and cytomegalovirus infections in vitro / Nataliya E. Fedorova,

Regina R. Klimova, Yurii A. Tulenev [et al.] // Mendeleev Commun. – 2012. –

Vol. 22, № 5. – P. 254-256.

257. Highly selective reactions of C60Cl6 with thiols for the synthesis of

functionalized [60]fullerene derivatives / Ekaterina A. Khakina, Anastasiya A.

Yurkova, Alexander S. Peregudov [et al.] // Chem. Commun. – 2012. – Vol.

48, № 57. – P. 7158-7160.

258. Antiviral activity of fullerene-(tris-aminocaproic acid) hydrate against

respiratory syncytial virus in HEp-2 cell culture / I. N. Falynskova, K. S.

Ionova, A. V. Dedova [et al.] // Pharm. Chem. J. – 2014. – Vol. 48, № 2. – P.

85-88.

259. Conjugation of cyclodextrin with fullerene as a new class of HCV entry

inhibitors / Su-Long Xiao, Qi Wang, Fei Yu [et al.] // Bioorg. Med. Chem. –

2012. – Vol. 20, № 18. – P. 5616-5622.

260. Respiratory chain inhibition by fullerene derivatives: hydrogen peroxide

production caused by fullerene derivatives and a respiratory chain system /

Tadahiko Mashino, Noriko Usui, Kensuke Okuda [et al.] // Bioorg. Med.

Chem. – 2003. – Vol. 11, № 7. – P. 1433-1438.

261. Lyon D. Y. Fullerene water suspension (nC) exerts antibacterial effects via

ROS-independent protein oxidation / Delina Y. Lyon, Pedro J. J. Alvarez //

Environ. Sci. Technol. – 2008. – Vol. 42, № 21. – P. 8127-8132.

262. The activity of [60]fullerene derivatives bearing amine and carboxylic

solubilizing groups against escherichia coli: a comparative study / Dmitry G.

Deryabin, Olga K. Davydova, Zulfiya Zh. Yankina [et al.] // J. Nanomaterials.

– 2014. – Vol. 2014. – P. 1-9.

149

263. Photophysical properties of C60 / James W. Arogast, Aleksander P.

Darmanyan, Christopher S. Foote [et al.] // J.Phys. Chem. – 1991. – Vol. 95, №

1. – P. 11-12.

264. Yamakoshi Y. •OH and O2

•- generation in aqueous C60 and C70 solutions by

photoirradiation: an EPR study / Yoko Yamakoshi, Shoko Sueyoshi, Kiyoshi

Fukuhara, Naoki Miyata // J. Am. Chem. Soc. – 1998. – Vol. 120, № 47. – P.

12363-12364.

265. Oxidative damage induced by the fullerene C60 on photosensitization in rat

liver microsomes / Jayashree P. Kamat, Thomas P. A. Devasagayam, K. I.

Priyadarsini [et al.] // Chem.-Biol. Interact. – 1998. – Vol. 114, № 3. – P. 145-

159.

266. Tokuyama H. Photoinduced biochemical activity of fullerene carboxylic acid

/ Hidetoshi Tokuyama, Shigeru Yamago, Eiichi Nakamura // J. Am. Chem.

Soc. – 1993. – Vol. 115, № 17. – P. 7918-7919.

267. Functionalized fullerenes mediate photodynamic killing of cancer cells: Type

I versus Type II photochemical mechanism / Pawel Mroz, Anna Pawlak,

Minahil Satti [et al.] // Free Radical Biol. Med. – 2007. – Vol. 43, № 5. – P.

711-719.

268. C60 and water-soluble fullerene derivatives as antioxidants against radical-

initiated lipid peroxidation / I. Chen Wang, Lin Ai Tai, Don Dar Lee [et al.] //

J. Med. Chem. – 1999. – Vol. 42, № 22. – P. 4614-4620.

269. Пат. 2007043074 ВОІВ, МКИ A61K 9/127. Liposome loaded with fullerene

and process for their preparation: Пат. 2007043074 ВОІВ, МКИ A61K 9/127

Marko Bojan Lens, Emanuele De Marni, Rosanna Gullo, Ugo Citernesi,

Rossella Crippa; Zelens Dermatological UK LTD (GB). – №

PCT/IT2006/000140; заяв. 09.03.2006; опубл. 19.04.2007.

270. Kato S. Fullerene-C60/liposome complex: defensive effects against UVA-

induced damages in skin structure, nucleus and collagen type I/IV fibrils, and

the permeability into human skin tissue / Shinya Kato, Hisae Aoshima,

150

Yasukazu Saitoh, Nobuhiko Miwa //J. Photochem. Photobiol., B. – 2010. –

Vol. 98, № 1. – P. 99-105.

271. Antioxidant effects of water-soluble fullerene derivatives against ultraviolet

ray or peroxylipid through their action of scavenging the reactive oxygen

species in human skin keratinocytes / Li Xiao, Hiroya Takada, Kentaro Maeda

[et al.] // Biomed. Pharmacother. – 2005. – Vol. 59, № 7. – P. 351-358.

272. Lee Y.-T. Water‐soluble hexasulfobutyl[60]fullerene inhibit low‐density

lipoprotein oxidation in aqueous and lipophilic phases / Yuan-The Lee, Long-

Yong Chiang, Wei-Jao Chen, Hsiu-Ching Hsu // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. –

2000. – Vol. 224, № 2. – P. 69-75.

273. A biologically effective fullerene (C60) derivative with superoxide dismutase

mimetic properties / Sameh S. Ali, Joshua I. Hardt, Kevin L. Quick [et al.] //

Free Radical Biol. Med. – 2004. – Vol. 37, № 8. – P. 1191-1202.

274. The scavenging of reactive oxygen species and the potential for cell

protection by functionalized fullerene materials / Jun-Jie Yin, Fang Lao, Peter

P. Fu [et al.] // Biomaterials. – 2009. – Vol. 30, № 4. – P. 611-621.

275. Fullerene-based antioxidants and neurodegenerative disorders / L. L. Dugan,

E. G. Lovett, K. L. Quick [et al.] // Parkinsonism Relat. Disord. – 2001. – Vol.

7, № 4. – P. 243-246.

276. Andrievsky G. V. Peculiarities of the antioxidant and radioprotective effects

of hydrated C60 fullerene nanostuctures in vitro and in vivo /Grigory V.

Andrievsky, Vadim I. Bruskov, Artem A. Tykhomyrov, Sergey V. Gudkov //

Free Radical Biol. Med. – 2009. – Vol. 47, № 6. – P. 786-793.

277. Fullerene nanomaterials inhibit phorbol myristate acetate‐induced

inflammation / Anthony Dellinger, Zhiguo Zhou, Robert Lenk [et al.] // Exp.

Dermatol. – 2009. – Vol. 18, № 12. – P. 1079-1081.

278. The differential cytotoxicity of water-soluble fullerenes / Christie M. Sayes,

John D. Forther, Wenh Guo [et al.] // Nano Lett. – 2004. – Vol. 4, № 10. – P.

1881-1887.

151

279. Nano-C60 cytotoxicity is due to lipid peroxidation / Christie M. Sayes, Andre

M. Gobin, Kevin D. Ausman [et al.] // Biomaterials. – 2005. – Vol. 26, № 36. –

P. 7587-7595.

280. Distinct cytotoxic mechanisms of pristine versus hydroxylated fullerene /

Aleksandra Isakovic, Zoran Markovic, Biljana Todorovic-Markovic [et al.] //

Toxicol. Sci. – 2006. – Vol. 91, № 1. – P. 173-183.

281. Pristine C60 fullerenes inhibit the rate of tumor growth and metastasis / S. V.

Prylutska, A. P. Burlaka, Yu. I. Prylutskyy [et al.] // Exp. Oncol. – 2011. – Vol.

33, № 3. – P. 162-164.

282. Autophagy-mediated chemosensitization in cancer cells by fullerene C60

nanocrystal / Qiang Zhang, Wenju Yang, Na Man [et al.] // Autophagy. – 2009.

– Vol. 5, № 8. – P. 1107-1117.

283. Opposite effects of nanocrystalline fullerene (C60) on tumour cell growth in

vitro and in vivo and a possible role of immunosupression in the cancer-

promoting activity of C60 / Nevena S. Zogovic, Nadezda S. Nikolic, Sanja D.

Vranjes-Djuric [et al.] // Biomaterials. – 2009. – Vol. 30, № 36. – P. 6940-

6946.

284. Effects of fullerenol C60(OH)24 on the frequency of micronuclei and

chromosome aberrations in CHO-K1 cells / Jasminka Mrdanovic, Slavica

Solajic, Visnja Bogdanovic [et al.] // Mutat. Res. – 2009. – Vol. 680, № 1. – P.

25-30.

285. Chen Y.-W. Fullerene derivatives protect against oxidative stress in RAW

264.7 cell and ischemia-reperfused lungs / Ya-Wen Chen, Kuo Chu Hwang,

Cheng-Chieh Yen, Yih-Loong Lai // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp.

Physiol. – 2004. – Vol. 287, № 1. – P. R21-R26.

286. Fullerenol cytotoxicity in kidney cells is associated with cytoskeleton

disruption, autophagic vacuole accumulation, and mitochondrial dysfunction /

Denise N. Johnson-Lyles, Kimberly Peifley, Stephen Lockett [et al.] // Toxicol.

Appl. Pharmacol. – 2010. – Vol. 248, № 1. – P. 249-258.

152

287. Cellular uptake and cytotoxic evaluation of fullerenol in different cell lines /

Yuanyuan Su, Jing-Ying Xu, Pingping Shen [et al.] // Toxicology. – 2010. –

Vol. 269, № 2. – P. 155-159.

288. In vitro toxicity assessment of three hydroxylated fullerenes in human skin

cells / J.G. Saathoff, A. O. Inman, X. R. Xia [et al.] // Toxicol. In Vitro. –

2011. – Vol. 25, № 8. – P. 2105-2112.

289. Chiang L.Y. Free radical scavenging activity of water-soluble fullerenols /

Long Y. Chiang, Fung-Jou Lu, Jaw-Town Lin // J. Chem. Soc., Chem.

Commun. – 1995. – Vol. 1995, № 12. – P. 1283-1284.

290. Nitric oxide-scavenging activity of polyhydroxylated fullerenol, C60(OH)24 /

Snezana M. Mirkov, Aleksandar N. Djordjevic, Nebojsa L. Andric [et al.] //

Nitric Oxide. – 2004. – Vol. 11, № 2. – P. 201-207.

291. Buckminsterfullerenol free radical scavengers reduce excitotoxic and

apoptotic death of cultured cortical neurons / Laura L. Dugan, Joseph K.

Gabrielsen, Shan P. Yu [et al.] // Neurobiol. Dis. – 1996. – Vol. 3, № 2. – P.

129-135.

292. Tissue-protective effects of fullerenol C60(OH)24 and amifostine in irradiated

rats / Sanja Trajkovic, Silva Dobric, Vesna Jacevic [et al.] // Colloids Surf., B.

– 2007. – Vol. 58, № 1. – P. 39-43.

293. The polyhydroxylated fullerene derivative C60(OH)24 protects mice from

ionizing-radiation-induced immune and mitochondrial dysfunction / Xiaoqing

Cai, Jiejie Hao, Xiaoyong Zhang [et al.] // Toxicol. Appl. Pharmacol. – 2010. –

Vol. 243, № 1. – P. 27-34.

294. Radioprotective efficiency of fullerenol in irradiated mice / S. Trajkovic, S.

Dobric, A. Djordjevic [et al.] // Mater. Sci. Forum. – 2005. – Vol. 494. – P.

549-554.

295. Super-highly hydroxylated fullerene derivative protects human keratinocytes

from UV-induced cell injuries together with the decreases in intracellular ROS

generation and DNA damages / Yasukazu Saitoh, Akifumi Miyanishi, Hiromi

153

Mizuno [et al.] // J. Photochem. Photobiol., B. – 2011. – Vol. 102, № 1. – P.

69-76.

296. Pickering K. D. Fullerol-sensitized production of reactive oxygen species in

aqueous solution / K. D. Pickering, M. R. Wiesner // Environ. Sci. Technol. –

2005. – Vol. 39, № 5. – P. 1359-1365.

297. Kamat J. P. Reactive oxygen species mediated membrane damage induced by

fullerene derivatives and its possible biological implications / J. P. Kamat, T. P.

A. Devasagayam, K. I. Priyadarsini, H. Mohan // Toxicology. – Vol. 155, № 1.

– P. 55-61.

298. Pinteala M. Binding fullerenol C60(OH)24 to dsDNA / Mariana Pinteala,

Andrei Dascalu, Cezar Ungurenasu // Int. J. Nanomedicine. – 2009. – Vol. 4. –

P. 193-199.

299. Phototoxicity and cytotoxicity of fullerol in human lens epithelial cells / Joan

E. Roberts, Albert R. Wielgus, William K. Boyes [et al.] // Toxicol. Appl.

Pharmacol. – 2008. – Vol. 228, № 1. – P. 49-58.

300.Puhaca B. Modulatory effect of fullerenol C60(OH)24 on cytotoxicity induced

by adriamycin, cisplatin, taxol and thiazofurine on selected human carcinoma

cell lines / B. Puhaca // McGill J. Med. – 2001. – Vol. 6. – P. 51.

301. Kojic V. Effects of fullerenol C60(OH)24 on cytotoxicity induced by antitumor

drugs on human breast carcinoma cell lines / V. Kojic, D. Jakimov, G.

Bogdanovic, A. Dordevic // Mater. Sci. Forum. – 2005. – Vol. 494. – P. 543-

548.

302. Modulating activity of fullerol C60(OH)22 on doxorubicin-induced cytotoxicity

/ Gordana Bogdanovic, Vesna Kojic, Aleksandar Dordevic [et al.] // Toxicol.

In Vitro. – 2004. – Vol. 18, № 5. – P. 629-637.

303. Protective effects of fullerenol on carbon tetrachloride-induced acute

hepatotoxicity and nephrotoxicity in rats / Jing-Ying Xu, Yuan-Yuan Su, Jin-

Sheng Cheng [et al.] // Carbon. – 2010. – Vol. 48, № 5. – P. 1388-1396.

154

304. Influence of fullerenol C60(OH)24 on doxorubicin induced cardiotoxicity in

rats / V. Djordjevic Milic, A. Djordjevic, S. Dobric [et al.] // Mater. Sci.

Forum. – 2006. – Vol. 518. – P. 525-530.

305. Acute doxorubicin nephrotoxicity in rats with malignant neoplasm can be

successfully treated with fullerenol C60(OH)24 via suppression of oxidative

stress / Rade Injac, Marija Boskovic, Martina Perse [et al.] // Pharmacol. Rep. –

2008. – Vol. 60, № 5. – P. 742-749.

306. Potential hepatoprotective effects of fullerenol C60(OH)24 in doxorubicin-

induced hepatotoxicity in rats with mammary carcinomas / Rade Injac, Martina

Perse, Natasa Obermajer [et al.] // Biomaterials. – 2008. – Vol. 29, № 1. – P.

3451-3460.

307. Activity of antioxidative enzymes in erythrocytes after a single dose

administration of doxorubicin in rats pretreated with fullerenol C60(OH)24 /

Vukosava Djordjevic Milic, Karmen Stankov, Rade Injac [et al.] // Toxicol.

Mech. Methods. – 2009. – Vol. 19, № 1. – P. 24-28.

308. Antioxidant properties of fullerenol C60(OH)24 in rat kidneys, testes, and lungs

treated with doxorubicin / Branislava Srdjenovic, Vukosava Milic-Torres,

Nevena Grujic [et al.] // Toxicol. Mech. Methods. – 2010. – Vol. 20, № 6. – P.

298-305.

309. Fullerenol C60(OH)24 prevents doxorubicin-induced acute cardiotoxicity in

rats / Vukosava Milic Torres, Branislava Srdjenovic, Vesna Jacevic [et al.] //

Pharmacol. Rep. – 2010. – Vol. 62, № 4. – P. 707-718.

310. Fullerenol − cytotoxic conjugates for cancer chemotherapy /Padmaparna

Chaudhuri, Abhimanyu Paraskar, Shivani Soni [et al.] // ACS Nano. – 2009. –

Vol. 3, № 9. – P. 2505-2514.

311. Tumor‐inhibitory effect and immunomodulatory activity of fullerol C60(OH)x

/ Jiadan Zhu, Zhiqiang Ji, Jing Wang [et al.] // Small. – 2008. – Vol. 4, № 8. –

P. 1168-1175.

155

312. Immunostimulatory properties and enhanced TNF-α mediated cellular

immunity for tumor therapy by C60(OH)20 nanoparticles / Ying Liu, Fang Jiao,

Yang Qiu [et al.] // Nanotechnology. – 2009. – Vol. 20, № 41. – P. 415102.

313. Studies on anti-tumor and antimetastatic activities of fullerenol in a mouse

breast cancer model / Fang Jiao, Ying Liu, Ying Qu [et al.] // Carbon. – 2010. –

Vol. 48, № 8. – P. 2231-2243.

314. Fullerenol C60(OH)24 effects on antioxidative enzymes activity in irradiated

human erythroleukemia cell line / Visnja Bogdanovic, Karmen Stankov, Ivana

Icevic [et al.] // J. Radiat. Res. – 2008. – Vol. 49, № 3. – P. 321-327.

315. Protective effects of fullerenol C60(OH)24 against doxorubicin-induced

cardiotoxicity and hepatotoxicity in rats with colorectal cancer / Rade Injac,

Martina Perse, Manica Cerne [et al.] // Biomaterials. – 2009. – Vol. 30, № 6. –

P. 1184-1196.

316. Yamawaki H. Cytotoxicity of water-soluble fullerene in vascular endothelial

cells / Hideyuki Yamawaki, Naoharu Iwai // Am. J. Physiol. Cell Physiol. –

2006. – Vol. 290, № 6. – P. C1495-C1502.

317. Grebowski J. Membrane fluidity and activity of membrane ATPases in human

erythrocytes under the influence of polyhydroxylated fullerene / Jacek

Grebowski, Anita Krokosz, Mieczyslaw Puchala // Biochim. Biophys. Acta. –

2013. – Vol. 1828, № 2. – P. 241-248.

318. Grebowski J. Fullerenol C60(OH)36 could associate to band 3 protein of human

erythrocyte membranes / Jacek Grebowski, Anita Krokosz, Mieczyslaw

Puchala // Biochim. Biophys. Acta. – 2013. – Vol. 1828, № 9. – P. 2007-2014.

319. Phosphonate derivatives of tetraazamacrocycles as new inhibitors of protein

tyrosine phosphatases / Oleksandr L. Kobzar, Michael V. Shevchuk, Alesya N.

Lyashenko [et al.] // Org. Biomol. Chem. – 2015. – Vol. 13, № 27. – P. 7437-

7444.

320. α,α-Difluoro-β-ketophosphonates on a tetraazamacrocyclic platform Synthesis

and inhibitory activity against protein tyrosine phosphatases / D. I. Khavrienko,

156

O. L. Kobzar, M. V. Shevchuk [et al.] // Доповіді Національної академії

наук України. – 2014. – № 9. – C. 109-115.

321. Fullerene derivatives as a new class of inhibitors of protein tyrosine

phosphatases / Oleksandr L. Kobzar, Viacheslav V. Trush, Vsevolod Yu.

Tanchuk [et al.] // Bioorg. Med. Chem. Lett. – 2014. – Vol. 24, № 14. – P.

3175-3179.

322. Polycarboxylic fullerene derivatives as protein tyrosine phosphatase inhibitors

/ Oleksandr L. Kobzar, Viacheslav V. Trush, Vsevolod Yu. Tanchuk [et al.] //

Mendeleev Commun. – 2015. – Vol. 25, № 3 – P. 199-201.

323. Кобзар О. Л., Труш В. В., Танчук В. Ю., Вовк А. І. Производные

каликсаренов и фуллеренов как ингибиторы протеинтирозинфосфатаз. В

книге: Наноразмерные системи и наноматериалы: исследования в Украине

/ Редкол.: А. Г. Наумовец (глав. ред.); НАН Украины. – К.:

Академпериодика. – 2014. – С. 474-480.

324. Kobzar O. L. Inhibitory potential of polyhydroxylated fullerenes against

protein tyrosine phosphatase 1B / O. L. Kobzar, V. V. Trush, V. Yu. Tanchuk,

A. I. Vovk // Ukr. Biochem. J. – 2015. – Vol. 87, № 4. – P. 24-31.

325. Yurkova A. A. Arbuzov chemistry with chlorofullerene C60Cl6: a powerful

method for selective synthesis of highly functionalized [60]fullerene

derivatives / Anastasiya A. Yurkova, Ekaterina A. Khakina, Sergey I.

Troyanov [et al.] // Chem. Commun. – 2012. – Vol. 48, № 71. – P. 8916-8918.

326. Enzyme kinetic characterization of protein tyrosine phosphatases / Gunther H.

Peters, Sven Branner, Karin B. Moller [et al.] // Biochimie. – 2003. – Vol. 85,

№ 5. – P. 527-534.

327. High level expression and purification of the enzymatically active

cytoplasmic region of human CD45 phosphatase from yeast / Anne Pacitti,

Panayiotis Stevis, Mark Evans [et al.] // Biochim. Biophys. Acta. – 1994. –

Vol. 1222, № 2. – P. 277-286.

157

328. Seiner D. R. Inactivation of protein tyrosine phosphatases by dietary and

endogenous agents. PhD dissertation. 2009. ProQuest Dissertations and Theses

database (UMI № 868726545).

329. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики / Э. Корниш-

Боуден. – Москва: Мир, 1979. – 280 с.

330. Березин И. В. Практический курс химической и ферментативной

кинетики / Илья Васильевич Березин, Анатолий Алексеевич Клесов // –

М.: Изд. Московского университета, 1976. – 320 с.

331. The RCSB Protein Data Bank: new resources for research and education /

Peter W. Rose, Chunxiao Bi, Wolfgang F. Bluhm [et al.] // Nucleic Acids Res.

– 2013. – Vol. 41. – P. D475-D482.

332. The structural basis for the selectivity of benzotriazole inhibitors of PTP1B /

Giovanna Scapin, Sangita B. Patel, Joseph W. Becker [et al.] // Biochemistry. –

2003. – Vol. 42, № 39. – P. 11451-11459.

333. Crystal structure of PTP1B complexed with a potent and selective bidentate

inhibitor / Jin-Peng Sun, Alexander A. Fedorov, Seung-Yub Lee [et al.] // J.

Biol. Chem. – 2003. – Vol. 278, № 14. – P. 12406-12414.

334. Targeting inactive enzyme conformation: aryl diketoacid derivatives as a new

class of PTP1B inhibitors / Sijiu Liu, Li-Fan Zeng, Li Wu [et al.] // J. Am.

Chem. Soc. – 2008. – Vol. 130, № 50. – P. 17075-17084.

335. Potent, selective inhibitors of protein tyrosine phosphatase 1B / Zhili Xin,

Thorsten K. Oost, Cele Abad-Zapatero [et al.] // Bioorg. Med. Chem. Lett. –

2003. – Vol. 13, № 11. – P. 1887-1890.

336. Tanchuk V. Yu. Classification of binding site conformations of protein

tyrosine phosphatase 1B / Vsevolod Yu. Tanchuk, Volodymyr O. Tanin,

Andriy I. Vovk // Chem. Biol. Drug Des. – 2012. – Vol. 80, № 1. – P. 121-128.

337. Discovery of a potent, selective protein tyrosine phosphatase 1B inhibitor

using a linked-fragment strategy / Bruce G. Szczepankiewicz, Gang Liu, Philip

J. Hajduk [et al.] // J. Am. Chem. Soc. – 2003. – Vol. 125, № 14. – P. 4087-

4096.

158

338. Structural basis for inhibition of protein-tyrosine phosphatase 1B by

isothiazolidinone heterocyclic phosphonate mimetics / Paul J. Ala, Lucie

Gonneville, Milton C. Hillman [et al.] // J. Biol. Chem. – 2006. – Vol. 281, №

43. – P. 32784-32795.

339. Zhang Z.-Y. Protein tyrosine phosphatases: structure and function, substrate

specificity, and inhibitor development / Zhong-Yin Zhang // Annu. Rev.

Pharmacol. Toxicol. – 2002. – Vol. 42, № 1. – P. 209-234.

340. Comparative protein structure modeling using Modeller / Narayanan Eswar,

Ben Webb, Marc A. Marti-Renom [et al.] // Curr. Protoc. Protein Sci. – 2007. –

Chap. 2, unit 2.9. – P. 2.9.1-2.9.31.

341. Bhattacharya D. 3Drefine: consistent protein structure refinement by

optimizing hydrogen bonding network and atomic‐level energy minimization /

Debswapna Bhattacharya, Jianlin Chen // Proteins. – 2013. – Vol. 81, № 1. – P.

119-131.

342. Colovos C. Verification of protein structures: patterns of nonbonded atomic

interactions / Chris Colovos, Todd O. Yeates // Protein Sci. – 1993. – Vol. 2,

№ 9. – P. 1511-1519.

343. Laskowski R. A. PROCHECK: a program to check the stereochemical quality

of protein structures / Roman A. Laskowski // J. Appl. Cryst. – 1993. – Vol. 26,

№ 2. – P. 283-291.

344. Eisenberg D. VERIFY3D: assessment of protein models with three-

dimensional profiles / David Eisenberg, Roland Luthy, James U. Bowie //

Methods Enzymol. – 1997. – Vol. 277. – P. 396-404.

345. Residue 259 in protein-tyrosine phosphatase PTP1B and PTPα determines the

flexibility of glutamine 262 / Gunther H. Peters, Lars F. Iversen, Henrik S.

Andersen [et al.] // Biochemistry. – 2004. – Vol. 43, № 26. – P. 8418-8428.

346. Avogadro: an advanced semantic chemical editor, visualization, and analysis

platform / Marcus D. Hanwell, Donald E. Curtis, David C. Lonie [et al.] // J.

Cheminf. – 2012. – Vol. 4, № 1. – P. 1-17.

159

347. Trott O. AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a

new scoring function, efficient optimization, and multithreading / Oleg Trott,

Arthur J. Olson // J. Comput. Chem. – 2010, – Vol. 31, № 2. – P. 455-461.

348. Tanchuk V. Yu. Multithreaded version of AutoDock 4.2 suitable for massive

virtual screening of potential biologically active compounds (enzyme

inhibitors) / Vsevolod Tanchuk, Volodymyr Tanin, Andriy Vovk // Third

International Conference "High Performance Computing" HPC-UA 2013. –

Kyiv. – 2013. – P. 399-401.

349. Rodriguez-Zavala J. G. Structure and energetics of polyhydroxylated carbon

fullerenes / J. G. Rodriguez-Zavala, R. A. Guirado-Lopez // Phys. Rev. B. –

2004. – Vol. 69, № 7. – P. 075411.

350. Rodriguez-Zavala J. G. Stability of highly OH-covered C60 fullerenes: role of

coadsorbed O impurities and of the charge state of the cage in the formation of

carbon-opened structures / J. G. Rodriguez-Zavala, R. A. Guirado-Lopez // J.

Phys. Chem. A. – 2006. – Vol. 110, № 30. – P. 9459-9468.

351. Brant J. A. Fullerol cluster formation in aqueous solutions: implications for

environmental release / Jonathan A. Brant, Jerome Labille, Christine Ogilvie

Robichaud, Mark Wiesner // J. Colloid Interface Sci. – 2007. – Vol. 314, №1. –

P. 281-288.

352. A highly selective and potent PTP-MEG2 inhibitor with therapeutic potential

for type 2 diabetes / Sheng Zhang, Sijiu Liu, Rongya Tao [et al.] // J. Am.

Chem. Soc. – 2012. – Vol. 134, № 43. – P. 18116-18124.

353. The YRD motif is a major determinant of substrate and inhibitor specificity in

T-cell protein-tyrosine phosphatase / Ernest Asante-Appiah, Kristen Ball,

Kevin Bateman [et al.] // J. Biol. Chem. – 2001. – Vol. 276, № 28. – P. 26036-

26043.

354. Effects of C60, a fullerene, on the activities of glutathione S-transferase and

glutathione-related enzymes in rodent and human livers / Nobuhisa Iwata,

Toshiji Mukai, Yoko Nakajima Yamakoshi [et al.] // Fullerene science and

technology. – 1998. – Vol. 6, № 2. – P. 213-226.

160

355. Inhibition of nitric oxide synthase isoforms by tris-malonyl-C60-fullerene

adducts / Donald J. Wolff, Alexandru D. P. Papoiu, Krystian Mialkowski [et

al.] // Arch. Biochem. Biophys. – 2000. – Vol. 378, № 2. – P. 216-223.

356. Inhibitory effect of fullerene derivatives on glutathione reductase / Tadahiko

Mashino, Kensuke Okuda, Takashi Hirota [et al.] // Fullerene Science and

Technology. – 2001. – Vol. 9, № 2. – P. 191-196.

357. Nedumpully Govindan P. Mechanism of taq DNA polymerase inhibition by

fullerene derivatives: insight from computer simulations / Praveen Nedumpully

Govindan, Luca Monticelli, Emppu Salonen // J. Phys. Chem. B. – 2012. –

Vol. 116, № 35. – P. 10676-10683.

358. Inhibition of M-MuLV reverse transcriptase activity by fullerene derivatives /

Meng Xianmei, Chen Zhe, Li Bo [et al.] // Chin. Sci. Bull. – 2006. – Vol. 51,

№ 20. – P. 2550-2552.

359. Design and activity of cationic fullerene derivatives as inhibitors of

acetylcholinesterase / Giorgia Pastorin, Silvia Marchesan, Johan [et al.] // Org.

Biomol. Chem. – 2006. – Vol. 4, № 13. – P. 2556-2562.

360. Nanoscale enzyme inhibitors: fullerenes inhibit carbonic anhydrase by

occluding the active site entrance / Alessio Innocenti, Serdar Durdagi,

Nadjmeh Doostdar [et al.] // Bioorg. Med. Chem. – 2010. – Vol. 18, № 8. – P.

2822-2828.

361. The inhibition of liposaccharide heptosyltransferase WaaC with multivalent

glycosylated fullerenes: a new mode of glycosyltransferase inhibition /

Maxime Durka, Kevin Buffet, Julien Iehl [et al.] // Chem. Eur. J. – 2012. –

Vol. 18, № 2. – P. 641-651.

362. Influence of water-soluble derivatives of [60]fullerene on therapeutically

important targets related to neurodegenerative diseases / R. A. Kotelnikova, A.

V. Smolina, V. V. Smolina [et al.] // Med. Che. Commun. – 2014. – Vol. 5, №

11. – P. 1664-1668.

161

363. Glover N. R. The phosphatase domain of LAR, CD45, and PTP1B: structural

correlations with peptide-based inhibitors / Nicholas R. Glover, Alan S. Tracey

// Biochem. Cell Biol. – 2000. – Vol. 78, № 1. – P. 39-50.

364. Suppression of microsomal cytochrome P450-dependent monooxygenases

and mitochondrial oxidative phosphorylation by fullerenol, a polyhydroxylated

fullerene C60 / Tzuu-Huei Ueng, Jaw-Jou Kang, Hui-Wu Wang [et al.] //

Toxicol. Lett. – 1997. – Vol. 93, № 1. – P. 29-37.

365. Fullerene antioxidants decrease organophosphate-induced

acetylcholinesterase inhibition in vitro / Marion Ehrich, Roger Van Tassell,

Yunbo Li [et al.] // Toxicol. in Vitro. – 2011. – Vol. 25, № 1. – P. 301-307.

366. Kramer C. N. Fullerene Research Advances / Carl N. Kramer (editor) // Nova

Publishers, 2007. –115 p.

367. Excited states and electron transfer reactions of C60(OH)18 in aqueous

solution / Hari Mohan, D. K. Palit, Jai P. Mittal [et al.] // J. Chem. Soc.

Faraday Trans. – 1998. – Vol. 94, № 3. – P. 359-363.

368. Ordering of hydroxylated fullerenes in aqueous solutions / I. V. Nikolaev, V.

T. Lebedev, Yu. S. Grushko [et al.] // Fullerenes, Nanotubes and Carbon

Nanostructures. – 2012. – Vol. 20, №. 4-7. – P. 345-350.

369. Cleland W. W. The kinetics of enzyme-catalyzed reactions with two or more

substrates or products: II. Inhibition: nomenclature and theory / W. W. Cleland

// Biochim. Biophys. Acta. –1963. – Vol. 67. – P. 173-187.

370. Fromm H. J. Use of competitive inhibitors to study substrate binding order /

Herbert J. Fromm // Methods Enzymol. – 1979. – Vol. 63. – P. 467-486.

371. Allosteric inhibition of protein tyrosine phosphatase 1B / Christian

Wiesmann, Kenneth J. Barr, Jenny Kung [et al.] // Nat. Struct. Mol. Biol. –

2004. – Vol 11, № 8. – P. 730-737.

372. Olmez E. O. Alpha7 helix plays an important role in the conformational

stability of PTP1B / Elif Ozkirimli Olmez, Burak Alakent // J. Biomol. Struct.

Dyn. – 2011. – Vol. 28, № 5. – P. 675-693.

162

373. Kamerlin S. C. L. A targeted molecular dynamics study of WPD loop

movement in PTP1B / Shina Caroline Lynn Kamerlin, Robert Rucker, Stefan

Boresch // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2006. – Vol. 345, № 3. – P.

1161-1166.