助成番号 1424

内向き整流性カリウムチャネルを基盤にした

食塩感受性高血圧の病態解明と新規降圧治療法の開発

沖 健司１，河野 修興２，Celso E, Gomez-Sanchez３

１広島大学病院，２広島大学大学院医歯薬保健学研究院，３ミシシッピ大学メディカルセンター

概 要 【目 的】 副腎皮質球状帯やアルドステロン産生腺腫で合成されるアルドステロンは、腎臓の遠位尿細管でナト

リウム （Na）の再吸収を促進し、食塩感受性高血圧の成因に深く関与している。アルドステロンを自律過剰分泌する原発

性アルドステロン症はアルドステロン産生腺腫（APA）と特発性アルドステロン症に大別される。APA の成因として内向き

整流性カリウムチャネル（KCNJ5）の体細胞変異が報告され、KCNJ5 は G 蛋白共役受容体（GPCR）により調節されている。

そこで、本研究では KCNJ5 の遺伝子異常をもつ APA（APA-KCNJ5）と遺伝子変異をもたない APA （APA-NM） を対象

に KCNJ5 と関連したアルドステロン合成機構を解明することを目的とした。

【方 法】 APA-NM（8 標本）と APA-KCNJ5（6 標本）を用いて、GPCR を対象に網羅的遺伝子発現解析を行った。

APA-NM において、GNRNR が高発現していたため、GnRH 負荷試験を実施した。KCNJ5 遺伝子異常が GNRHR に与

える影響を検討するため、ヒト副腎皮質癌細胞株（HAC15）に KCNJ5-T158A をレンチウイルスで導入した。

【結 果】 APA-NM と APA-KCNJ5 で 2 倍以上発現量が異なる遺伝子群を抽出したところ、APA-KCNJ5 で上昇している

遺伝子を 2 個と APA-NM で上昇している遺伝子を 12 個同定した。GNRHR は APA-NM で 2 番目に高発現しており、過

去にも APA で高値を示すことが報告されていることから、GNRHR を介したアルドステロン合成を検討することとした。そし

て、GnRH 刺激によるアルドステロン上昇率と GNRHR 発現量に強い正の相関がみられた（r = 0.726, P < 0.001）。両群に

おける GNRHR 発現を qPCR で確認したところ、APA-NM で有意に高値であった（P < 0.05）。また、APA-NM において、

GnRH によるアルドステロン上昇率は有意に高かった（P < 0.05）。APA-NM の 55.6%、APA-KCNJ5 の 0%が positive

response であり、APA-NM の 22.2%と APA-KCNJ5 の 23.1%が partial response であった。次に、HAC15 にレンチウイルス

を用いて KCNJ5 T158A を導入し、in vitro において KCNJ5 の遺伝子異常が GNRHR に与える影響を検討したところ、

GNRHR 発現量はコントロールに比較し 0.64 倍と有意に低下していた（P < 0.05）。

【結 語】 本研究において、GNRHR がアルドステロン合成に関与する新規機序を同定した。特に、遺伝子変異を認めな

いアルドステロン産生腺腫における新たな分子機序であり、異所性受容体発現を標的にした新たな分子機序の解明や創

薬につながる可能性がある。

１．緒 言

副腎皮質球状帯やアルドステロン産生腺腫で合成され

るアルドステロンは、腎臓の遠位尿細管でナトリウム（Na）

の再吸収を促進し、食塩感受性高血圧の成因に深く関与

している。高血圧症は、40 歳以上の人口の約 40%が罹患

し、さらに、高血圧症の 5-10%程度は原発性アルドステロ

ン症が原因とされ、全世界で非常に高い有病率を呈する

[1-4]。また、原発性アルドステロン症の患者は、高率に心血

管疾患を合併し、本態性高血圧患者に比較し、極めて予

後が不良であることが報告されている[1-4]。したがって、原

発性アルドステロン症の病態解明と新規治療法の確立は

極めて重要である。

原発性アルドステロン症は、アルドステロン産生腺腫と

特発性アルドステロン症に大別され[1]、本疾患の病因は、

- 27 -

近年まで全く明らかにされていなかった。近年、内向き整

流性カリウムチャネル（Kir3.4）をコードする KCNJ5 の体細

胞変異がアルドステロン産生腺腫の原因になっている可

能性が報告され[5]、アルドステロン産生腺腫の 30-60%に

KCNJ5 の遺伝子異常を認めることがわかった[5-8]。我々は、

KCNJ5 の遺伝子異常が、アルドステロン産生腺腫におい

て CYP11B2 発現とアルドステロン合成を促進する詳細な

機序を明らかにし[9]、Kir3.4 を介したアンギオテンシン II

がアルドステロンを合成する機序も解明した[10]。さらに、

2013 年に ATP 感受性 Na/K チャネル（ATP1A1, ATP2B3）

や電位依存性カルシウムチャネル（CACNA1D）の体細胞

変異がアルドステロン合成に関与していることが報告され

た[11-13]。つまり、これらの報告をまとめると、約半数のアル

ドステロン産生腺腫の原因およびアルドステロン合成機序

は、全く解明されていない。

アルドステロン合成は、レニン・アンギオテンシン系によ

り制御され、複数のステロイド合成酵素発現が必要不可欠

である。CYP11B2 はアルドステロン合成酵素と呼ばれ、コ

レステロールからアルドステロンが合成される際の最終酵

素であり、アルドステロン合成における律速酵素である[14]。

CYP11B2 の評価がアルドステロン合成を標的にした基礎

研究で極めて重要であるが、CYP11B2 はコルチゾール合

成に関わる CYP11B1 とアミノ酸配列で 93%のホモロジー

を有するため、CYP11B2 抗体の作製は極めて困難であっ

た。よって、CYP11B2 を標的にした基礎研究に限界があ

り、今日までアルドステロン合成機構の明確な解明に至る

ことができなかった。しかし、近年、我々の共同研究者で

ある Dr. Gomez-Sanchez が世界で初めてヒト CYP11B2 の

モノクローナル抗体の作製に成功した[15]。アルドステロン

産生腺腫におけるCYP11B2モノクローナル抗体を用いた

免疫組織化学評価では、遺伝子異常を認めないアルドス

テロン産生腺腫における CYP11B2 発現は腫瘍内で一様

ではないことを同定しており[15]、CYP11B2 を介したアルド

ステロン合成に関わる因子を探索する際、適切な標本の

選択が重要であることがわかった。

Kir3.4 は内向き整流性カリウムチャネルを構成するサブ

タイプのひとつであり、Kir3.1～Kir3.4 の４つのサブタイプ

からホモまたはヘテロ 4 量体で構成される[16, 17]。また、

Kir3 は G 蛋白共役受容体（GPCR）による調節を受けてお

り、Kir3 を調節する GPCR については全く明らかにされて

いない。異所性 GPCR 発現がアルドステロン合成に関わ

ることが過去に報告されており、luteinizing hormone 受容

体、serotonin4 受容体、gonadotropin releasing hormone 受

容体（ GNRHR ） 、 glutamate receptor metabotropic 3 、

endothelin receptor type B-like protein、ACTH 受容体など

がアルドステロン産生腺腫で同定されている[18-21]。しかし、

異所性 GPCR 発現と Kir3 チャネルの関連を報告した研究

は全くない。

本研究では、KCNJ5 の遺伝子異常をもつアルドステロ

ン産生腺腫と他の遺伝子異常を認めないアルドステロン

産生腺腫を対象に、CYP11B2 発現の有無に焦点をあて

たアルドステロン合成因子の探索研究を行い、新規アルド

ステロン合成因子の同定および機序の解明を行う。さらに、

アルドステロン産生腺腫における新規分子標的アルドステ

ロン合成阻害薬やアルドステロン合成をターゲットにした

降圧薬の開発につなげることを目的とする。

２．方 法

２．１ 患者および腫瘍標本

原発性アルドステロン症の診断は、日本内分泌学会か

ら報告された診断基準に基づき診断した[22]。また、手術を

施行した全例で副腎静脈サンプリングを施行し、同診断

基準に基づき局在診断を行った。さらに、腫瘍における

CYP11B2 発現を免疫組織化学により確認した。

広島大学病院でアルドステロン産生腺腫を手術した腫

瘍標本 11 例（遺伝子異常を認めない腫瘍 6 例と KCNJ5

遺伝子異常を認める腫瘍 5 例）を対象に網羅的遺伝子発

現解析（マイクロアレイ解析）を行った。いずれのアルドス

テ ロ ン 産生腺 腫に お い て も 、 免 疫組 織化 学に よ る

CYP11B2 が強く染色されることを確認した。

２．２ RNA 抽出と mRNA 発現解析

総 RNA を RNeasy Mini Kit（Qiagen 社）を用いて行い、

逆転写 PCR は総 RNA300 ng を用い、Takara PrimeScript

RT Master Mix により行った。CYP11B2 発現解析は

Taqman 法（Applied Biosystems 社）で実施し、GNRHR の

発現解析は SYBR green 法により行った。

２．３ マイクロアレイ解析

マイクロアレイ解析は、SurePrint G3 Human Gene

Expression 8×60K v2（Agilent 社）により実施した。データ

解析のための GPCR 遺伝子群の抽出は、Gene Set

- 28 -

Enrichment Analysis の Web サイトより行い、R ソフトウェア

を用いて解析した。

２．４ 内分泌検査

GNRHR の影響を検討する際、ACTH による刺激を避

けるため、検査前日の 23 時に 1mg デキサメサゾンを内服

し、GnRH 刺激試験を行った。GnRH 刺激試験は、7 時 30

分前に静脈確保し、8 時に GnRH 投与を行った。GnRH 投

与の前、15 分後、30 分後、60 分後、90 分後、120 分後に

点滴ルートより採血を実施し、アルドステロン濃度測定を

行った。アルドステロン値 50%以上の上昇で、positive

response と判定し、25-50%の上昇で partial response と判

断した。

２．５ 副腎皮質癌細胞株（HAC15）培養

HAC15 は Dr. Rainey（Michigan University）から提供を

受け、DMEM/F12 と 10% Calf serum（Cosmic 社）を用いて

培養した。アンギオテンシン II (A-II) の反応を検討する

場合、細胞内シグナル伝達を抑制するため、A-II 投与 24

時間前に 0.1% serum により serum starvation によるシグナ

ル抑制をはかった。また、A-II 投与時も、0.1% serum によ

る培養を行った。

２．６ レンチウイルスによる遺伝子導入

クローニングした Kir3.4（KCNJ5）をもとに、KCNJ5 遺伝

子変異をもつ cDNA（KCNJ5 T158A）を作製した [9]。

KCNJ5 T158A を pLX303 ベクター（addgene 社）に LR

reaction method（Invitrogen 社）にて導入した。

また、レンチウイルスの作製に、293TN 細胞株（System

Biosciences 社 ） を 用 い 、 上 記 の ベ ク タ ー 、 psPAX 、

cCMV-VSV-G を 12 : 14 : 8 の比率で PEI25 によりトランス

フェクションを行った。トランスフェクション 12 時間後に培

地交換を行い、48 時間培養後に上清を回収した。

レンチウイルスを用いて、HAC15 に KCNJ5 T158A を導

入し、アルドステロン合成や GNRHR 発現に与える影響を

検討した。

２．７ アルドステロン測定における ELISA 法

我々はアルドステロンの一次抗体を作成しており、以前

に報告した方法を用いて上清中のアルドステロン濃度を

測定した[23]。

３．結 果

３.１ マイクロアレイ解析

GPCR および GPCR 関連遺伝子を含んだ遺伝子群を

対象に、マイクロアレイ解析を行った（Figure 1A）。

KCNJ5 の遺伝子異常を認める腺腫（APA-KCNJ5）と

KCNJ5の遺伝子異常を認めない腺腫（APA-NM）で、2倍

以 上 発 現 量 が 異 な る 遺 伝 子 群 を 抽 出 し た と こ ろ 、

APA-KCNJ5 で上昇している遺伝子を 2 個と APA-NM で

上昇している遺伝子を 12 個同定した（Figure 1B）。

Fig.1. マイクロアレイ解析結果。A. マイクロアレイ解析によるヒートマップ。B. APA-NM とAPA-KCNJ5 の両群で 2 倍以上

発現量が異なる遺伝子。

- 29 -

３ ． ２ GnRH 刺激に よる ア ル ド ス テ ロン上昇率と

GNRHR 発現の関連

Figure 1B をもとに、過去の報告を検索すると、アルドス

テロン産生腺腫に GNRHR が発現していることがわかった

[18, 20, 24]。したがって、GnRH 刺激によるアルドステロン上

昇率とGNRHR発現量の関連を検討しところ、両者に強い

正の相関がみられた（Figure 2）。さらに、両者の関連は、

性、年齢、血清 K 値、腫瘍径、生理周期で調整後も有意

であった（β=0.242，P < 0.01）。

３．３ 遺伝子タイプ別の患者背景と GNRHR 発現

APA-NM と APA-KCNJ5 の患者背景を Table 1 に示

す。APA-KCNJ5 において、女性の頻度が有意に高かっ

た（P＜0.05）。

両群での GNRHR 発現を qPCR で確認したところ、

APA-NM で有意に高値であった（Figure 3A）。また、

APA-NM において、GnRH によるアルドステロン上昇率は

有意に高く（Figure 3B）、この結果は GNRHR と GnRH 刺

激によるアルドステロン上昇率に相関がみられた Figure 2

の結果に合致していた。APA-NM の 55.6%、APA-KCNJ5

の 0%が positive response であり、APA-NM の 22.2%と

APA-KCNJ5 の 23.1%が partial response であった。

Fig. 2. GNRHR 発現とGnRH 刺激によるアルドステ

ロン上昇率の関連

Fig. 3. 遺伝子タイプ別にみた GNRHR 発現（A）と GnRH 刺激によ

るアルドステロン上昇率（B）。

Table 1. 患者背景

- 30 -

３．４ KCNJ5 遺伝子異常が GNRHR に与える影響

重回帰分析を用いて、GNRHR 発現に与える臨床的な

影響を検討した。Figure 4 に示すように、KCNJ5 の遺伝

子異常のみ有意な説明因子であり、KCNJ5 の遺伝子異

常が GNRHR 発現に影響することがわかった。さらに、

HAC15にレンチウイルスを用いてKCNJ5 T158Aを導入し、

in vitro において KCNJ5 の遺伝子異常が GNRHR に与え

る影響を検討した。まず、KCNJ5 T158A を導入した

HAC15では、CYP11B2 mRNA発現量は17.7倍に上昇し

ていた。さらに、GNRHR 発現量はコントロールに比較し

0.64 倍と有意に低下していた（Figure 5）。

４．考 察

本研究において、遺伝子変異を認めないアルドステロ

ン産生腺腫では、GPCR の中で GNRHR は最も高発現し

ている遺伝子のひとつであり、GNRHR 発現が高値である

症例ほど GnRH によるアルドステロン上昇率が高いことが

わかった。また、遺伝子変異を認めないアルドステロン産

生腺腫において、特にアルドステロン上昇率が高かった。

さらに、KCNJ5 の遺伝子異常が GNRHR に与える影響を

臨床的に基礎的に検討したところ、KCNJ5 の遺伝子異常

は GNRHR の発現を負に調節することがわかった。

過去の報告からはいくらかのアルドステロン産生腺腫で

GNRHR が発現していることが報告されていたが[18, 20, 24]、

本研究において、APA-NM において、GNRHR 発現を認

め、アルドステロン合成を調節している可能性が示唆され

た。過去の報告では、GNRHR が発現している率は全ア

ルドステロン産生腺腫のうち 26.7～39.3%であり[18, 20, 24]、

本研究でも同程度の GNRHR 発現率であった。遺伝子変

異別に比較検討は過去に報告がなく、我々の結果が初め

ての結果と考える。

次に重要な点として、GNRHR 発現量と GnRH 刺激によ

るアルドステロンの上昇率に強い正相関がみられたことで

ある。Nakamura らは、H295R（ヒト副腎皮質癌細胞株）に

GnRH を投与すると、CYP11B2 発現が増え、アルドステロ

ン合成が増加することを報告している[25]。GNRHR の下流

シグナルは cAMP であることがわかっている[26, 27]。cAMP

Fig. 5. KCNJ5 遺伝子異常が GNRHR 発現に与える影響

Fig. 4. GNRHR 発現に影響する因子の相対危険度

- 31 -

はアルドステロン合成における 2nd メッセンジャーとしても

重要であり[14]、GNRHR が cAMP を介しアルドステロン合

成を促進していると考える。

本研究において、GNRHR がアルドステロン合成に関

与する新規機序を同定した。特に、遺伝子変異を認めな

いアルドステロン産生腺腫における新たな分子機序であり、

異所性受容体発現を標的にした新たな分子機序の解明

や創薬につながる可能性がある。

５．今後の課題

本研究において、GNRHR とアルドステロン合成の関連

について示すことができた。しかし、GNRHR を介した Kir

チャネルとの関連を示すことができておらず、今後 Kir チ

ャネルとの関連について検討を行っていく必要がある。

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- 33 -

No. 1424

The Pathophysiological Clarification Based on Inwardly Rectifying K Channel

and the Development of Newly Antihypertensive Treatment in Salt Sensitive

Hypertension

Kenji Oki1, Nobuoki Kouno2, Celso E, Gomez-Sanchez3

1 Hiroshima University Hospital, 2Hiroshima University, 3University of Mississippi Medical Center

Summary

Objectives: Some aldosterone-producing adenoma (APA) has somatic mutation in KCNJ5 coding for

inwardly rectifying K channel (Kir3) which is mediated by G protein-coupled receptors (GPCRs). We aimed to

detect novel genes associated with GPCRs in APA, and elucidate the mechanisms underlying aldosterone

production.

Methods: Microarray analysis targeting GPCR-associated genes was conducted using APA without known

mutations (APA-NM) samples (n = 8) and APA samples with the KCNJ5 mutation (APA-KCNJ5; n = 6). Since

gonadotropin-releasing hormone receptor (GNRHR) was one of the highest expression in APA-NM by microarray

analysis, we investigated the effects of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) stimulation on aldosterone

production.

Results: Expression levels of mRNAs encoding GNRHR were highest in APA-NM samples according to our

microarray analysis. The quantitative polymerase chain reaction (qPCR) assay results revealed higher GNRHR

expression levels in APA-NM samples that in APA-KCNJ5 samples (P < 0.05). There was a significant and

positive correlation between GNRHR expression and aldosterone increase via GnRH stimulation according to

univariate and multivariate analyses. Consistent with the correlation, patients with APA-NM (n = 9), which

showed GNRHR mRNA levels, had significantly higher GnRH-stimulated aldosterone response than those with

APA-KCNJ5 (n = 13) (P < 0.05). We observed an aldosterone response in 55.6% (5/9) of patients with

APA-NM, while none of the APA-KCNJ5 patients exhibited an aldosterone response. A partial aldosterone

response was seen in 22.2% (2/9) and 23.1% (3/13) of APA-NM and APA-KCNJ5 patients, respectively. Multiple

regression analysis revealed that the presence of the KCNJ5 mutation was linked to GNRHR mRNA expression (β

= 0.94 and P < 0.01). HAC15 cells with KCNJ5 gene carrying T158A mutation exhibited a 0.64-fold increase in

GNRHR expression than that in control cells (P < 0.05).

Conclusions: We clarified increased expression of GNRHR in APA-NM, and the expression positively

correlated with aldosterone production mediated by GnRH stimulation. Aberrant GNRHR expression in APA-NM

could be one of the mechanisms by which aldosterone production is modulated.

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