第六章 一般毒性作用

（ common toxicity of chemical poison ）

第六章 一般毒性作用

（ common toxicity of chemical poison ）

毒性评价或安全性评价的基本目的

受试物毒作用的表现和性质受试物毒作用的表现和性质 剂量－反应（效应）研究剂量－反应（效应）研究 确定毒作用的靶器官确定毒作用的靶器官 确定损伤的可逆性确定损伤的可逆性 其它：敏感检测指标和生物学标志、毒作用机其它：敏感检测指标和生物学标志、毒作用机

制、毒物动力学、中毒的解救措施…制、毒物动力学、中毒的解救措施…

毒理学研究方法

体内试验体内试验 体外试验体外试验

• 人体观察• 流行病学研究

动物实验

人群调查

体内实验：以实验动物为模型，最终目的是通过体内实验：以实验动物为模型，最终目的是通过外源化学物对实验动物的毒性反应，向人外源化学物对实验动物的毒性反应，向人 (( 原原型型 )) 外推，以期评估外源化学物对人的危害及危外推，以期评估外源化学物对人的危害及危险性。险性。

体外实验：筛选和预测急性毒性和机制研究；体外实验：筛选和预测急性毒性和机制研究； 人体实验和流行病学调查：进一步深化和证实在人体实验和流行病学调查：进一步深化和证实在

动物实验中所得到的资料。 动物实验中所得到的资料。

以动物实验为中心，动物实验的设计、实施、结果观察和评价是毒理学研究 的基本功。

动物实验整体动物实验（ in vivo ）

体外试验（ in vitro ）

一般毒性试 验

特殊毒性试 验

微 生 物试 验

哺乳动物试 验

急性毒性亚急性毒性亚慢性毒性慢性毒性

致突变致癌致畸…

致突变 器官水平组织水平细胞水平亚细胞水平分子水平

实验设计的统计原则

随机：代表性 对照：鉴别处理因素与非处理因素的差异

及处理因素效应大小，消除和减少随机化原则所不能控制的抽样误差及实验者操作熟练程度等造成的差异

空白 / 阴 / 阳性对照，自身对照，历史性对照

重复：样本量、重复次数

毒理学实验的基本原则

动物选择 首先考虑代谢与毒性效应上与人一致 注重对受试物毒性敏感的动物物种 种属、品系、个体差异 自然寿命不太长、易于饲养和实验操

作、经济易获得 动物年龄、性别

毒理学实验基本原则

根据对动物微生物控制的净化水平，实验动物分为：无菌动物、悉生动物、无特定病原体动物（ SPF 动物）、清洁动物和普通动物。

实验中小动物至少应为清洁动物及以上级别，国际上 SPF 动物已成为毒理学实验的标准实验动物。

剂量分组 实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对人潜在

危害的必需和可靠的办法。

除对照组外，一般设 3 个或 3 个以上剂量组，以

观察剂量一反应 ( 效应 ) 关系，确定受试化学物

引起的毒效应及其毒性参数。

质量控制 优良实验室规范（ GLP ）

实验操作规程

试剂选择

仪器使用

实验环境

目的要求

补充参考书 王心如主编王心如主编 .. 毒理学实验方法与技术毒理学实验方法与技术 .. 人卫人卫 卡萨瑞特 道尔著卡萨瑞特 道尔著 .. 《毒理学基础》《毒理学基础》

第一节 急性毒性作用

acute toxicity

第一节 急性毒性作用

acute toxicity

机体一次或 24h 内多次接触外源化学物后在短期内（最长 14 天）所产生的毒性效应，包括一般行为和外观改变、大体形态变化以及死亡效应

一、急性毒性的概念

急性毒性（ acute toxicity ）

急性毒性的概念

In 1984, 5,000 people died and 30,000 were p

ermanently disabled due to exposure to methyl

isocyanate （异氰酸甲酯， MIC ） from an ind

ustrial accident in India

Many people die each year from inhaling carb

on monoxide from faulty heaters

急性毒性的概念

需要注意

急性接触的次数 一次 : 经口、注射； 呼吸道、皮肤 ( 一段时

间 )

24h 多次 中毒效应出现的时间 不能仅以接触毒物后毒性症状出现的时间，

主要以接触毒物的时间，观察时间： 7~14

天 强度 一次性大剂量，中毒症状明显，常发生死亡

二、急性毒性试验的目的

求出致死剂量及其他急性毒性参数

观察中毒表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物的毒效应特征

为其他毒理试验提供接触剂量和选择观察指标的依据

为毒理学机制研究提供线索

急性毒性的参数

半数致死剂量： LD50

化合物经口急性毒性分级标准

毒性分级毒性分级 大鼠经口大鼠经口LDLD

5050(mg/kg)(mg/kg)

大约相当体重大约相当体重 70kg70kg 人的人的致死剂量致死剂量

mg/kgmg/kg

66 级，极毒级，极毒55 级，剧毒级，剧毒

44 级，中等毒级，中等毒33 级，低毒级，低毒

22 级，实际无毒级，实际无毒11 级，无毒级，无毒

<1<1

1~501~50

51~50051~500

501~5000501~5000

5001~150005001~15000

>15000>15000

稍尝稍尝500~4000500~4000

4000~300004000~30000

30000~25000030000~250000

250000~50000250000~50000

>500000>500000

急性毒性的参数

剂量 - 反应曲线

急性毒性的参数

ED,TD ： ED50, TD50,

急性毒性的参数

急性毒作用带： Zac=LD50/Limac

霍恩法（ Horn ）： 4 个剂量组

平均移动内插法（ moving average int

erpolation ） 改进寇氏法（ Karber 法、平均致死量法）

Bliss 法（多用于新药临床毒理学研究，计算复杂）

最大似然性法（ maximum likelihood m

ethod ），最精确的计算方法

LD50 的几种计算方法

改进寇氏法

利用剂量对数与死亡率呈利用剂量对数与死亡率呈 SS 型曲线而设型曲线而设计的方法计的方法

该法计算简便，准确率高，较为常用该法计算简便，准确率高，较为常用 要求：每组动物数相同、至少要求：每组动物数相同、至少 55 个实验个实验

组、各剂量组组距呈等比级数、死亡率组、各剂量组组距呈等比级数、死亡率呈正态分布、最低剂量组死亡率呈正态分布、最低剂量组死亡率 <20%<20% 、、最高剂量组死亡率最高剂量组死亡率 >80>80 ％。％。

霍恩法（ Horn ）

平均移动内插法（ moving average int

erpolation ） 改进寇氏法 Bliss 法

最大似然性法（ maximum likelihood m

ethod ），最精确的计算方法

LD50 的几种计算方法

总体原则

三、急性毒性试验方法的要点

实验动物 染毒途径 染毒剂量 观察周期 观察指标的选择、计算方法和评价

急性毒性反应与人近似 易于饲养、操作方便 繁殖力较强，数量较大 价格较低，易于获得

（一）实验动物的选择和要求

主要原则

除特殊需要外，首选哺乳动物

实验动物的物种和品系

啮齿类（ rodent species ）

非啮齿类（ nonrodent species ）

小鼠：昆明种、 NIH 、 ICR

大鼠： Sprague-Dawley （ SD ）、 Wistar

犬或猴 为了有利于预测化合物对人的危害，要求选择两种以上的实验动物，最好一种为啮齿类，一种为非啮齿类，分别求出其急性毒性参数。

根据接触途径选择实验动物

急性经口和吸入毒性试验大鼠、小鼠

急性经皮毒性试验成年大鼠、豚鼠、家兔

实验动物的物种和品系

大鼠： 180-240g

小鼠： 18-25g

家兔： 2-2.5kg

实验动物的年龄和体重

刚成年、健康、未曾交配和受孕的动物 小动物根据体重 同一次试验同一批实验动物体重变异范

围不应超过平均体重的 20%

实验动物的性别

雌雄各半 如雌、雄动物毒效应有明显差异，应

分别并求出雌性和雄性动物的 LD50 值 特殊的试验研究可仅作单一性别的急

性毒性试验

实验动物分组与数量

根据组数和每组数量来决定数量

LD50 ，一般为 4-6 组

大、小鼠每组 10只，犬类 6只

严格遵循随机、均衡的原则

实验动物的预检

给药前检疫观察

大、小鼠、兔、豚鼠 1 周，犬猴 2~3 周

①适应新环境，减少环境和生理条件变化可能对试验结果的影响

②筛检健康状况不符合试验要求的动物

实验动物的给药前禁食处理

经口途径染毒，实验动物胃肠道内食物存留量对化学毒物的毒性可产生较明显的干扰

大、小鼠隔夜禁食，染毒 2h 后提供饲料

经口多次染毒可不禁食

（二）受试物及处理

理化特性 水溶液、混悬液、油溶液 水溶性受试物：蒸馏水、去离子水、生

理盐水，保持与体内渗透压一致（注射）

水不溶性受试物：溶于或悬浮于适当的有机溶剂中

受试物一般应临用前新配

受试物成分和配方应稳定不变

适宜容积染毒

毒性较大的受试物给药量较小 毒性较低的受试物常需较大量的染毒 给药容积根据染毒途径和实验动物• 经口： 20ml/kg(空腹动物 )

• 经皮： 2ml/kg

• 静脉： 1ml/kg(5min 以上 )

受试物及处理

(三 ) 染毒方法

模拟实际接触的途径和方式 有利于不同化学物之间结果的比较 受试物的性质和用途 受试物毒性评价程序的要求

工业毒物：经呼吸道、皮肤 农用化学物：经口、皮肤、呼吸道 药品：经口、注射、皮肤 食品：经口 环境污染物：经口、呼吸道、皮肤

染毒途径

染毒方法

消化道、呼吸道、皮肤、注射

染毒途径影响受试物急性毒性

染毒方法

不同途径的吸收量和吸收速率

吸收速率：静脉注射 > 呼吸道 >肌肉注射 >腹腔注射 > 皮下注射 >消化道 > 皮内注射 > 经皮

同一受试物不同染毒途径 LD50 的大小通

常符合上述规律

经口（胃肠道）染毒

LD50 值来比较不同化学物急性毒性大小

灌胃：溶液或混悬液，以注射器经导管注入胃内，等容量灌胃法

吞咽胶囊：将受试物装入胶囊中，放至舌后部，迫使动物咽下。犬、猴

喂饲：将受试物掺入动物饲料或饮水中供实验动物自行摄入

染毒方法

空腹空腹 灌胃后灌胃后 22－－ 3h3h 复食复食

灌胃法

灌胃法灌胃法是用灌胃器将所应投给动物的药灌到动

物胃内。小鼠的灌胃针长约 4～ 5cm ，直径为1mm ，大鼠的灌胃针长约 6～ 8cm ，直径约 1.

2mm 。灌胃针的尖端焊有一小圆金属球，金属球为中空的。焊金属球的目的是防止针头刺入气管或损伤消化道。针头金属球端弯曲成 20°

左右的角度，以适应口腔、食道的生理弯曲度走向

染毒方法

鼠类的灌胃法：用左手固定鼠，右手持灌胃器，将灌胃针从鼠的口腔插入，压迫鼠的头部，使口腔与食道成一直线 ,将灌胃针沿咽后壁慢慢插入食道，可感到轻微的阻力 ,此时可略改变一下灌胃针方向，以刺激引起吞咽动作，顺势将药液注入。一般灌胃针插入小鼠深度为 3～ 4cm ，大鼠或豚鼠为 4～ 6cm 。常用灌胃量小鼠为 0.2～ 1

ml ，大鼠 1～ 4ml ，豚鼠 1～ 5ml

静式吸入染毒 动式吸入染毒

经呼吸道染毒

气管内注入

染毒方法

吸入染毒

静式吸入染毒染毒方法

方法：一定体积的密闭容器，加入易挥发的液态或气态受试物

染毒柜体积、动物数、时间，依据实验动物最低需气量计算

优点：简单、方便、受试物消耗少，适合于小鼠 缺点：氧气减少，浓度不稳定，经皮吸收，不适合稍大动物，挥发性不强的受试物用此法受限

实验动物最低需气量及不同体积染毒柜应放置动物数关系

 动物种属

呼吸通气量(L/ 小时 )

最低需气量(L/ 小时 )

不同容积染毒柜放置动物数 (只 )

25L 50L 100L 300L

小 鼠大 鼠

1.4510.18

3.4530.5

3~5 6~101

12~151~2

36~405~6

动式吸入染毒

将实验动物处于有空气流动的染毒柜中，新鲜空气不断流入，污染空气不断流出。温度、湿度、氧及二氧化碳分压相对恒定，并有随时补充受试物，维持浓度稳定。可采样监测受试物浓度，可持续接触受试物，无时间限制

染毒方法

动式吸入染毒装置的组成

染毒柜

机械通风系统

配气系统

染毒方法

动式吸入染毒设备A 整体暴露 B 口鼻暴露

动式吸入染毒优缺点

染毒方法

优点：受试物浓度和氧分压比较稳定

缺点：设备要求高，消耗受试物量很大，操作比较复杂，费时费工

经皮肤染毒

染毒方法

农药、化妆品、工业、环境、外用药物

常用大鼠

染毒方式：• 脱毛：化学或机械法脱毛（体表面积

的 10% ）• 染毒：局部涂敷或大鼠、小鼠浸尾法

经注射途径染毒

染毒方法

注射药品、机制研究、毒物代谢动力学

分类：

几种动物不同注射途径注射量 (ml) 范围

注射途径注射途径 小鼠小鼠 大鼠大鼠 豚鼠豚鼠 兔兔 狗狗

静脉静脉肌肉肌肉皮下皮下腹腔腹腔

0.2~0.50.2~0.5

0.1~0.20.1~0.2

0.1~0.50.1~0.5

0.2~1.00.2~1.0

1.0~2.01.0~2.0

0.2~0.50.2~0.5

0.5~1.00.5~1.0

1.0~3.01.0~3.0

1.0~5.01.0~5.0

0.2~0.50.2~0.5

0.5~1.00.5~1.0

2.0~5.02.0~5.0

3.0~103.0~10

0.5~1.00.5~1.0

1.0~3.01.0~3.0

5.0~10.05.0~10.0

5.0~15.05.0~15.0

2.0~5.02.0~5.0

3.0~10.03.0~10.0

－－

（四） 剂量选择 参考新化学物的理化性质

参考相关资料

先用少量动物，以较大的剂量间隔染毒，找出 10%-90% （或 0%-100% ）的致死剂量范围，然后设计正式实验的剂量和分组

根据试验所选的 LD50 计算方法确定剂量组

数

预试一般每组 4只动物，每次 3 组，以 10倍为组距。根据第一次预试结果判定需要增加还是降低剂量，组距保持不变，直至粗略预测到 LD100 及 LD0 为止。

各组剂量的计算

i = （ lgLD90-lgLD10 ） / （ n-

1 ）或 i = （ lgLD100- lgLD0 ） / （ n-

1 ） i 为组距， n 为设计的剂量组数。以最低剂量值（ LD0 或 LD10 ）的对数剂量

加上一个 i 值，即是第二个剂量组的对数剂量，依次类推直至最高剂量组

剂量选择

剂量选择

化学物 LD50 大于 2g/kg 或 5g/kg ，表明

毒性不大

我国药品的毒理研究指导原则规定要以最大容积最高浓度给予动物后未见死亡

不必计算 LD50

全面观察动物的各种反应和变化，仔细分析实验动物在染毒后出现的中毒表现、剂量效应、时间分布。观察记录的内容：

中毒体征及发生过程

死亡情况和时间分布

体重

病理形态学变化

（五） 毒性作用观察

毒性作用观察

中毒体征及发生过程

详细观察和记录动物出现的中毒体征

发生时间

体征发展的经过

• 各个系统的特征

• 初步确定急性毒性靶器官

• 不同表现提供毒性机制的信息

续表 6-1 啮齿类动物急性中毒表现

毒性作用观察

死亡情况和时间分布

实验动物的死亡数对 LD50 值产生明显影响

分析中毒死亡时间的分布规律可以提供重要信息 ：原形，代谢

体重

毒性作用观察

反映动物中毒后综合性整体变化，比较客观简便的量化指标

应定期多次称量动物的体重变化，一般为每周 1 次或 2 次

对体重指标的变化要仔细观察和分析

体重变化的原因

毒性作用观察

• 影响食欲或消化系统的功能

• 影响食物的吸收和利用

• 影响水的摄取

• 肾功能急性损伤

毒性作用观察

病理检查

死亡动物：大体病理变化，如脏器外观、大小、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其他改变

存活动物：观察期结束时亦应进行解剖检查，必要时做组织病理学检查

（六） 观察时间和周期

染毒以后应即刻开始观察动物中毒表现和死亡情况

给药当天应连续或多次观察，以后可根据情况，每天 2 次或多次观察直至试验周期结束

观察周期一般为 14 天

LD50(LC50) 计算时以观察周期内各组

动物的总死亡数为依据

不同化学物质引起动物死亡的时间存在个体差异

速杀型化学毒物仅计算 24h 的死亡率

观察时间和周期

急性毒性试验求出 LD50(LC50) 值，通

过 LD50 值进行急性毒性分级 (acute toxicity

classification) ，评价毒物的急性毒性强弱，比较毒物的急性毒性大小

四、急性毒性分级和评价

急性毒性分级和评价

急性毒性分级和评价

按照急性毒性分级标准评价毒性大小是相对粗略的分级

报告： LD50 、急性毒性级别；中毒体征、

出现体征时间、死亡前征兆、死亡时间和剂量组间分布、存活动物的体重变化和恢复情况、死亡动物的病理变化

Introduction

Method and materials

Results

Discussions

11

22

33

44

举 例

举 例

1 材料与方法

1.1 主要试剂：四硼酸钠、亚硒酸钠

举 例

举 例

◆ 结果 急性毒性试验：急性硒中毒动物在服药 5

min 后出现急性硒中毒症状，最初表现为呕吐、腹泻，然后呼吸困难，四肢痉挛，直至死亡。急性硼中毒动物在服药 60min

后出现急性中毒症状，表现为不好动、腹泻、口鼻出血，甚至惊厥死亡

举 例

◆ 结果举 例

◆ 结果 联合作用评价结果

举 例

◆ 讨论 LD50 ：四硼酸钠对雌、雄性大鼠 1470mg/

kg 。亚硒酸钠对雄性大鼠 14.70mg/kg ，对雌性大鼠 6.81mg/kg 。联合对大鼠的急性毒性，雄性大鼠为 1727.10mg/kg ，雌性大鼠 1717.94mg/kg

举 例

◆ 讨论 我国工业毒物急性毒性分级标准评价：

本实验四硼酸钠与亚硒酸钠混合毒物属于低毒类物质。该毒物的值可为亚慢性毒性实验提供染毒剂量水平的设计依据

举 例

毒理学资料的外推

种属差异及外推：致畸、致癌（自发、敏感、靶器官）

高剂量效应与低剂量效应的差异与外推（高剂量和低剂量的效应性质不一定相同，剂量 -反应曲线不同）

对化学物的安全性评价需要充分利用国内外资料，根据毒理学实验和流调

毒理学实验基本原则