分子生物学

2009 实验

质粒酶切、鉴定

及 DNA 片段的凝胶回收

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一 . 实验目的

1. 了解质粒酶切及电泳鉴定原理。

2. 掌握核酸片段的凝胶回收纯化操作技术。

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第一部分第一部分

质粒的酶切及电泳鉴定

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一 . 实验原理

限制性内切酶是一种工具酶，其特点是具有能够识别双链 DNA 分子上的特异核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断 DNA 双链，形成一定长度的 DNA 片段。

如： EcoRⅠ和 HindⅢ的识别序列和切口是： EcoRⅠ： G↓AATTC HindⅢ： A↓AG

CTT

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限制性内切酶对环状质粒 D

NA 有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知分子量的线状 DNA 为对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知 DNA 的分子量。

_

+

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酶切反应系统包括： DNA ，酶， buffer ，灭菌水注意：不同公司的酶和 buffer 系统是不同的，所以一个反应应该用同一个公司的酶和 buffer 。

1 ， DNA ：自己制备的 DNA ，样品中不应该有酚，氯仿，酒精， EDTA ，盐离子等的污染，以免影响酶的活性。2 ，酶：酶量并不是越大越好，酶体积不应该超过总反应体积的 1/10 。 (因为酶是储存在 50% 甘油中的，而反应体积中甘油的浓度超过 5%就会使酶出现星号活性，即切割不应该切的位置 )。3 ， buffer ：不同的酶配有不同的 buffer ，产品目录和酶的使用说明中会说明该酶用哪种 buffer ，有些 buffer 中需要另外添加 BSA 。

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4 ，反应体积，通常 1到几微克 DNA 的反应体积可以控制在50到 100 微升，用 20单位的酶来切。

5 ，反应条件，大多数酶都是 37度半小时以上。6 ，双酶切 因为不同的酶需要不同的 buffer ，所以有两种情况： 1) 两种酶是同样的 buffer 。尽量用同一个公司的酶，这

样就跟单酶切操作差不多，可以同时加入两种酶，注意事项是体积和酶量。

2) 两种酶是不同的 buffer ，先用一种 buffer 离子浓度底的酶切，电泳检测，单酶切开以后，将产物抽提，沉淀，加入离子浓度高的 buffer 再酶切。

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二 . 仪器和试剂

1 ．主要仪器（ 1 ） 1.5mL 塑料离心管（ 2 ）微量加样器 10μL 、 100μL 、 1 000μL 各一支（ 3 ）台式高速离心机（ 120 00r/min ）（ 4 ）水浴锅、电泳仪、电泳槽

2 ．材料 重组质粒 pMD19-b （插入外源基因大小约 500b

p ）

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33 ．试剂．试剂

（（ 11 ）限制性内切酶）限制性内切酶 BamH IBamH I 、 、 HindⅢHindⅢ及缓冲液及缓冲液 K K ；；

（（ 22 ）） 1×TBE 1×TBE 缓冲液：称取缓冲液：称取 Tris 10.88gTris 10.88g 、硼酸、硼酸 5.52g 5.52g

和 和

EDTA 0.72gEDTA 0.72g ，用蒸馏水溶解后，定容至，用蒸馏水溶解后，定容至 200mL200mL ，，

用用

前稀释前稀释 10 10 倍。倍。

（（ 33 ）） EB EB 染色液：终浓度为染色液：终浓度为 0.5μg/mL0.5μg/mL 。。

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三 . 操作步骤

HH22O 5.5 μl O 5.5 μl

质粒质粒 DNA(100 ng/μl) 15 μl DNA(100 ng/μl) 15 μl 　　　　

10×10× 酶切缓冲液酶切缓冲液 (K buffer) 2.5μl(K buffer) 2.5μl

　　 　　 BamH (5 U/μl) 1μlⅠBamH (5 U/μl) 1μlⅠ

Hind 1μlⅢHind 1μlⅢ

2. 37 ℃2. 37 ℃水浴水浴 3 h-4h3 h-4h 。。3. 3. 将将 EppendorfEppendorf 管置管置 65 ℃65 ℃水浴中水浴中 10 min10 min ，通过加热使，通过加热使酶失 酶失 活以终止反应，或加入活以终止反应，或加入 2ul loading buffer2ul loading buffer 终止反应。终止反应。

混匀混匀 (12000 (12000

rpmrpm 离心离心 5 5

sec)sec)

1. 1. 反应体系的建立反应体系的建立 : : （（ 25μl25μl 体体系）系）

4. DNA 4. DNA 琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测

质粒酶切电泳图

质粒 DNA

酶切图

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操作注意事项：操作注意事项：1. 1. 吸样量一定要准确吸样量一定要准确 ;;

2. 2. 为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶 ;;

3. 3. 要求在冰上操作，并充分混匀要求在冰上操作，并充分混匀 ;;

4. 4. 开启开启 EppendorfEppendorf 管时，手不要接触到管盖内面，以防污染管时，手不要接触到管盖内面，以防污染 ;;

5. 5. 样品在样品在 37 ℃37 ℃与与 65 ℃65 ℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管保温时，将离心管盖严，以防水进入管

内造成实验失败。内造成实验失败。

重组所用质粒载体（ 2.692kb ）

pMD19 载体结构

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第二部分第二部分

DNADNA 的凝胶回收的凝胶回收

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传统的 DNA 回收的方法主要基于降低凝胶的熔点以释放 DNA ，然后酚 / 氯仿抽提，乙醇沉淀回收。

现多用公司生产的商品化的试剂盒，其原理是采用凝胶裂解液（如含有降低熔点的 NaI ）融化凝胶释放 D

NA 后，采用特殊的硅胶树脂吸附 DNA 后，用洗液洗去杂质，最后用洗脱液洗出 DNA 。

本次实验采用北京博大泰克生物基因技术有限责任公司 B 型小量 DNA 片段快速胶回收试剂盒回收。

实验原理

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仪器和试剂

1. 1. 仪器： 电泳仪，水浴锅，离心机 仪器： 电泳仪，水浴锅，离心机

2. 2. 材料：酶切的材料：酶切的 DNADNA 样品样品

3.3. 试剂：试剂：北京博大泰克生物基因技术有限责任公司生产北京博大泰克生物基因技术有限责任公司生产的的 BB型小量型小量 DNADNA 片段快速胶回收试剂盒 片段快速胶回收试剂盒 CaCa

t.NO.MK005t.NO.MK005

按凝胶重量：溶胶液 =1:3 加入溶胶液

60℃溶胶 10min-20min

将溶胶液转移至吸附柱

12,000rpm 离心30s ，弃废液

加入 500ul漂洗液

12,000rpm 离心 2min, 弃废液，重复 3次

1

2

3 4

5

加入 20ul洗脱液，静置 5min

吸附柱移至新的 1.5ml离心管

12,000rpm离心 5min

弃洗脱柱，保存样品

DNA 酶切条带回收步骤

回收电泳图

约 2690bp

约 600bp

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DNA 片断的连接

实验六

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二 . 实验原理 ( 质粒酶切与鉴定 )

DNADNA 片段之间的连接主要是在片段之间的连接主要是在 T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶

的作用下，使的作用下，使 DNADNA裂口上核苷酸裸露的裂口上核苷酸裸露的 3’3’羟基和羟基和

5’5’磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使原来断磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使原来断

开的开的 DNADNA裂口连接起来裂口连接起来 ,,需需 ATPATP 。。

学习核酸片断连接的原理和方法

一 . 实验目的

连接酶：把基因连在一起连接酶：把基因连在一起

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11 、 连接缓冲液的影响：、 连接缓冲液的影响：

11 ） ） 20-100mmol/L20-100mmol/L 的的 Tris-HClTris-HCl ，较多用，较多用 50mmol/L50mmol/L ，， pHpH 的范围在的范围在 7.7.4-7.84-7.8 ，目的是提供合适酸碱度的连接体系； ，目的是提供合适酸碱度的连接体系；

22 ）） 10mmol/L10mmol/L 的的 MgCl2MgCl2 ，作用是激活酶反应；，作用是激活酶反应； 33 ）） 1-20mmol/L1-20mmol/L 的的 DTTDTT ，较多用，较多用 10mmol/L10mmol/L ，作用是维持还原性环境，，作用是维持还原性环境，

稳定酶活性，稳定酶活性， 44 ）） 25-50ug/ml25-50ug/ml 的的 BSABSA ，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓

度过稀而造成酶的失活。度过稀而造成酶的失活。 55 ）） 0.5-4mmol/L0.5-4mmol/L 的的 ATPATP ，现多用，现多用 1mmol/L1mmol/L ，是酶反应所必需的。，是酶反应所必需的。 注：含有注：含有 ATPATP 的缓冲液应于的缓冲液应于 -20℃-20℃ 保存，溶化取用后立即放回。保存，溶化取用后立即放回。 连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引 起起 ATPATP 分解。分解。

影响 DNA连接反应的因素

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22 、 连接温度与时间的影响：、 连接温度与时间的影响：因为黏性末端的因为黏性末端的 DNADNA 双链双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，传统间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，传统上将连接温度定为上将连接温度定为 16℃16℃ ，时间为，时间为 4-16h4-16h 。现经实验发现，。现经实验发现，对于一般的黏性末端来说，低温连接较长的时间可取得对于一般的黏性末端来说，低温连接较长的时间可取得较好的连接效果。较好的连接效果。33 、 酶浓度的影响：、 酶浓度的影响：日常使用的日常使用的 DNADNA 浓度比酶单位定义浓度比酶单位定义状态低状态低 10-2010-20 倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-10010-100 倍。倍。44 、 、 DNADNA 浓度的影响：浓度的影响：要求得到环化的有效连接产物， 要求得到环化的有效连接产物， DNADNA 浓度不可过高，一般不会超过浓度不可过高，一般不会超过 20nmol/L20nmol/L 。要求线性。要求线性化的连接产物， 化的连接产物， DNADNA 的浓度可以高些，至少是接近推荐的浓度可以高些，至少是接近推荐的浓度。的浓度。

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仪器和试剂

1. 1. 仪器： 离心机 ， 水浴锅仪器： 离心机 ， 水浴锅

2. 2. 材料：回收的材料：回收的 DNADNA 样品样品

3.3. 试剂：试剂：

11 ）） T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶

22 ）） 10X T4 DNA ligase buffer10X T4 DNA ligase buffer ：： Tris-HClTris-HCl （（ pH7.6pH7.6 ）；）；

MgClMgCl22 ；； DTTDTT ；； ATPATP 。。

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三 . 操作步骤

载体 DNA （大片段）： 6 μ

l ； 插入片段（小片段）： 2μl ； 10× T4 DNA ligase buffer ： 1 μl ； T4 DNA 连接酶： 1 μl2 ） 4℃反应过夜（ >16h ）。

1 ）连接反应液的制备（ 10ul 体系）：

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注意：

1. DNA 纯化回收后 , 电泳检测应为单一的条带。如果切胶过程中不慎带上杂带 , 那么回收后电泳结果可能会出现两条以上的带。这时可以进行重复纯化回收。

2. 当连接反应难以进行时，可以适当延长反应时间。 当连接效率仍然无所改变时，应当对 DNA 进行纯化

后 再反应。 3. 连接反应液可以直接用于转化。另外，当转化 DNA

量 较大或者利用电刺激转化时，先用乙醇沉淀法纯化 DNA 。

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问 题 思 考 ？

1 ．核酸片段双酶切与单酶切相比有何优点？进行双酶切操作时应注意些什麽？

2. 酶切片段的回收与连接时有哪些注意事项。