1

Helicobacter pylori ViraBlot® Диагностический набор для определения IgG, IgAМетод Вестерн-блоттинга для обнаружения IgG или IgA-антител против Helicobacter pylori и для дифференцирования высоко и низко-патогенных штаммов Helicobacter в человеческой сыворотке.Helicobacter pylori ViraBlot использует европейские клинические изоляты различных штаммов Helicobacter pylori. Эта комбинация антигеновгарантирует оптимальную чувствительность и специфику метода. Состав антигеновспециально подготовленных для Helicobacter pyloriViraBlot* содержит штамм-специфические разновидности высокоспецифичных белков 136 kD(CagA), 87 kD(VacA), 30 kD, 26 kD(UreA)и 24 kD.Все полоски имеют интегрированную систему контроля с контролями для функциональной и конъюгатной специфичности. Каждыйдиагностический набор содержит одну полоску с положительным контролем (полоска маркирована PC HG или PC HА).

Helicobacter p. ViraBlot Диагностический набор дляопределения IgG 50 тестов

Изделие № V-HPBGOK

Helicobacter p. ViraBlot* Диагностический набор дляопределения IgG 50 тестов

Изделие № V-HPBAOK

Исследуемый образец 20 мкл сыворотки

Время для испытания 90 минутХранение/Стабильность около 12 месяцев при t +2,+8 °C

Компоненты диагностического набора50 полосок Полоски с антигенами, нитроцеллюлозные полоски с системой контроля и Helicobacter- специфичными антигенами

в аналитической секции; код полоски: HG для IgG или HА для IgA, полоски пронумерованы от 1 до 50. Стрипы невзаимозаменяемы (Номер изделия: V-HPBG/AAS)

9 мл Конъюгат щелочной фосфатазы против IgG или IgA человека, 10-кратный концентрат.

(Номер изделия: V-UVNG/AKI)

100 мл Буфер для разведения/промывки, 10-кратный концентрат (Номер изделия: V-UVNUWP)1 упаковка Порошок для разведения/промывки (5г) (Номер изделия: V-UVNUMP)90 мл Раствор хромоген/субстрата, готовый к использованию (Номер изделия: V-UVNUCS)1 экз. Инструкция по применению диагностического набора

Helicobacter pylori ViraBlot ® для определения IgG, IgA2 экз. Протокол оценки диагностического набора Helicobacter pylori

ViraBlot ® для определения IgG, IgA1 экз. Шаблон, диагностикум-специфический с положительной (IgG)

контрольной полоской (PC HG) для локализации полосБуфер для разведения/промывки, порошок для разведения/промывки и раствор хромоген/субстрата взаимозаменяемы между различнымиViraStripe ® и ViraBlot ® диагностическими наборами.Дополнительно доступны:

0,33 мл Helicobacter pylori IgG положительный контроль, человеческая сыворотка,готовая к использованию

(Изделие №{ V-HPBGPK)

0,33 мл Helicobacter pylori IgG пороговый контроль, человеческая сыворотка,готовая к использованию

(Изделие №{ V-HPBGCO)

0,33 мл Helicobacter pylori IgA положительный контроль, человеческая сыворотка,готовая к использованию

(Изделие №{ V-HPBAPK)

0,33 мл Helicobacter pylori IgA пороговый контроль, человеческая сыворотка,готовая к использованию

(Изделие №{ V-HPBACO)

0,33 мл Helicobacter pylori IgG, IgM, IgA отрицательный контроль человеческая сыворотка,готовая к использованию

(Изделие №{ V-HPBPNK)

9 мл Конъюгат щелочной фосфатазы с антителами против IgМчеловека, 10-кратный концентрат, жидкий

(Изделие №{ V-UVNMKI)

Хранение и стабильность реактивовПолоски с антигенами: полоски в закрытых упаковках устойчивыдо истечения срока годности, если хранятся при температуре 2-8 °C.Плотно закрывайте пакеты с не использованными стрипами.Конъюгат, 10-кратный концентрат: устойчив до истечения срокагодности, если хранится при при температуре 2-8 °CРабочий раствор: использовать немедленно.Буфер для разведения/промывки: концентрат и порошок:устойчив до истечения срока годности, если хранится притемпературе 2-8 °C

Рабочий раствор буфера: 2 недели годен к использованию еслихранится при температуре 2-8 °C. Рабочий раствор буфера можетбыть сохранен в необходимых количествах в течение болеедлительного времени в замороженном состоянии.Раствор хромоген/субстрата: устойчив до истечения срокагодности, если хранится температуре 2-8 °C. Хранить в темномместе!

Подготовка реактивов и исследуемого образцаПеред использованием доведите все компоненты теста докомнатной температуры (20-25°C).Полоски с антигенами:Тщательно отделите требуемое число полосок при помощи пинцета.Касайтесь полосок пинцетом только в области маркировки.Буфер для разведения/промывки (рабочий раствор):Чтобы подготовить рабочий раствор буфера, разведите 10-кратныйконцентрат в пропорции1:10 дистиллированной водой (100 млконцентрата + 900 мл дистиллированной воды), добавьте порошокдля разведения/промывки до полного растворения. Поместитерабочий раствор буфера на 10 - 15 минут на магнитную мешалку, pH= 7,5 ± 0,1.

Конъюгат (рабочий раствор):Растворите необходимое количество 10-кратного концентратасогласно таблице (1): Раствор всегда готовится свежий во времяпроцедуры промывания (пункт 7 проведения теста).Другие реактивы: готовы к использованию.Образцы пациента:Используйте 20 мкл неразведенной сыворотки на один тестДополнительно доступные контроли:Используйте 100 мкл каждого положительного, порогового иотрицательного контроля, в неразведенном виде, на серию тестов.

2

Таблица 1: Приготовление конъюгата рабочего раствораЧислополос

Разбавитель /промывной буферрабочий раствор

Конъюгат - концентрат Конечныйобъем

1 1,35 мл + 0,15 мл 1,5 мл2 2.70 мл + 0,30 мл 3,0 мл3 4,05 мл + 0.45 мл 4,5 мл4 5,40 мл + 0,60 мл 6,0 мл5 6,75 мл + 0,75 мл 7,5 мл6 8,10 мл + 0,90 мл 9,0 мл7 9,45 мл + 1,05 мл 10,5 мл8 10,80 мл + 1,20 мл 12.0 мл9 12,15 мл + 1,35 мл 13,5 мл10 13,50 мл + 1,50 мл 15,0 мл11 14,85 мл + 1,65 мл 16,5 мл12 16,20 мл + 1,80 мл 18,0 мл13 17,55 мл + 1,95 мл 19,5 мл14 18,90 мл + 2,10 мл 21,0 мл15 20,25 мл + 2,25 мл 22,5 мл16 21,60 мл + 2,40 мл 24,0 мл17 22,95 мл + 2,55 мл 25,5 мл18 24,30 мл + 2,70 мл 27,0 мл19 25,65 мл + 2,85 мл 28,5 мл20 27,00 мл + 3,00 мл 30,0 мл21 28,35 мл + 3,15 мл 31,5 мл22 29,70 мл + 3,30 мл 33,0 мл23 31,05 мл + 3,45 мл 34,5 мл24 32,40 мл + 3,60 мл 36,0 мл25 33,75 мл + 3,75 мл 37,5 мл26 35,10 мл + 3,90 мл 39,0 мл27 36,45 мл + 4,05 мл 40,5 мл28 37,80 мл + 4,20 мл 42,0 мл29 39,15 мл + 4,35 мл 43,5 мл30 40,50 мл + 4,50 мл 45,0 мл31 41,85 мл + 4,65 мл 46,5 мл32 43,20 мл + 4,80 мл 48,0 мл33 44,55 мл + 4,95 мл 49,5 мл34 45,90 мл + 5,10ml 51,0ml35 47,25 мл + 5.25 мл 52,5 мл36 48,60 мл + 5,40 мл 54,0 мл37 49.95 мл + 5,55 мл 55,5 мл38 51,30 мл + 5.70 мл 57,0 мл39 52,65 мл + 5,85 мл 58,5 мл40 54,00 мл + 6,00 мл 60,0 мл41 55,35 мл + 6,15 мл 61,5 мл42 56,70 мл + 6,30 мл 63,0 мл43 58,05 мл + 6,45 мл 64,5 мл44 59,40 мл + 6,60 мл 66,0 мл45 60,75 мл + 6,75 мл 67,5 мл46 62,10 мл + 6,90 мл 69,0 мл47 63,45 мл + 7,05 мл 70,5 мл48 64,80 мл + 7,20 мл 72,0 мл49 66,15 мл + 7,35 мл 73,5 мл50 67,50 мл + 7,50 мл 75,0 мл

Проведение теста.1. Ополоснуть инкубационную ванну буфером для разведения/промывки иудалить раствор.

Маркировать ванну водостойким маркером. Ополаскивание буфером удаляетзагрязнения.

2. Разместить по одной полоске в каждый канал. Разместите по одной полоске для каждого контроля и образца пациента, вотдельный канал инкубационной ванны пинцетом. Маркировка полосокдолжна находиться лицевой стороной вверх.

3. Добавить в каждый канал по 1.5 мл буфера и инкубировать в течение 5минут при комнатной температуре на шейкере.

Визуально удостоверьтесь, что полоски полностью смочены и не плаваютчастично на поверхности буфера. Используйте шейкер с частотой колебаний40 циклов/мин.

4. Добавить 20 мкл каждого образца пациента или 100 мкл каждого контролясоответственно.

Наносите при помощи пипетки контроль и образцы непосредственно наярлыки стрипов, во время колебаний шейкера.

5. Инкубировать на шейкере в течение 30 минут при комнатной температуре.6. Удалить жидкость Полоски прилипают к дну каналов инкубационной ванны. Тщательно удалите

оставшуюся жидкость на фильтровальную бумагу.7. Промывка: 3 раза по 5 минут: добавьте 1.5 мл буфера дляразведения/промывки, инкубируйте в течение 5 минут, полностью удалитежидкость.

При промывке приготовьте раствор конъюгата согласно таблице 1. Тщательноудалите оставшуюся жидкость на фильтровальную бумагу.

8. Пипеткой нанести 1.5 мл свежего рабочего раствора конъюгата в каждыйканал

Визуально удостоверьтесь, что полоски полностью покрыты растворомконъюгата.

9.Инкубировать в течение 15 минут, на шейкере, при комнатной температуре.11. Промывка: 3 раза по 5 минут, как описано в пункте 7. Тщательно удалите оставшуюся жидкость на фильтровальную бумагу.12. Добавить дистиллированную воду 1.5 мл14. Удалить жидкость Тщательно удалите оставшуюся жидкость на фильтровальную бумагу.15. Добавить 1.5 мл раствора хромоген/субстрата. Визуально удостоверьтесь, что полоски полностью покрыты раствором

хромоген/субстрата.16. Инкубировать на шейкере:Helicobacter IgG: 5-10 мин.

IgA: 5-15 мин.

Остановите реакцию, как только полоса порогового контроля (cut off)станет четко видима. Внимание:Превышение срока инкубации приводит к появлению фоновых пятен.Полоса порогового контроля IgG: 60 kDПолоса порогового контроля IgA: 66 kD

17.Остановить реакцию, удалить жидкость. Тщательно удалите оставшуюся жидкость на фильтровальную бумагу.18. Промыть три раза с 1.5 мл. дистиллированной воды Не инкубировать.19. Высушить полоски для интерпретации результатов теста. Изъять влажные полоски из каналов, используя пинцет. Разместите влажные

полоски на фильтровальной бумаге и высушите на воздухе перединтерпретацией результатов теста.

3

Helicobacter pylori ViraBlot ® Диагностический набор для определения IgG, IgAПринцип тестаПри помощи Helicobacter pylori ViraBlot' могут быть определены H.pylori-специфические антитела в человеческой сыворотке.Специфические антитела связываются с закрепленным на полоске антигеном в течение инкубации с сывороткой. Конъюгат щелочной фосфатазы связывается скомплексом антиген-антитело в течение инкубации с конъюгатом. Щелочная фосфатаза конвертирует хромоген/субстрат и окрашивает комплекс антиген-антитело наполоске в фиолетовый цвет.. Процедуры промывки между инкубацией с сывороткой, конъюгатом - и хромоген/субстратом удаляют не прореагировавшие реактивы.Иммуноблот с интегрированной системой контроля:Зеленая разделительная линия делит полоску на секцию контроля и секцию анализа. Секция контроля включает контроль сыворотки и три контроля конъюгата (IgG, IgA,IgM). Секция анализа включает в себя электрофоретические раздельные Helicobacter pylori антигены.Оценка

1. Подготовить протокол оценки: Регистрируйте данные в протоколе оценки. Приклейте полоски в протокол.Разместите зеленую линию разделения точно на напечатанную линиюразделения в протоколе.

2. Действительность теста: Тест считается действительным если полосы функционального контороля иполосы контроля конъюгата и полосыпорогового контроля для каждойполоски четко определяются.В случае, если нет реакции хотя бы одного из этих контролей, тест считаетсянедействительным и должен быть повторен с соблюдением всехнеобходимых условий, описанных в инструкции.Не оценивайте недействительные полоски.

3. Проверка шаблона Каждый H. pylori ViraBlot ® комплект включает в себя специфический дляданного теста шаблон с полоской положительного контроля (маркировка PCHG). На этом шаблоне изображена локализация полос. Номера на шаблоне иполосках с антигенами должны быть идентичны.

4. Оценка образцов пациента Выровняйте зеленые линии разделения полоски пациента и полоскиположительного контроля на шаблоне (маркировка PC HG). Позиция полосыпоказана на полосках положительного контроля. Определите полосы наполосках пациента, и отметьте их в протоколе. Неопределенные полосы неоцениваются.

5.Оценка полосы при помощи порогового контроля: В соответствии с лабораторными качественными методиками, пороговыйконтроль должен использоваться для каждой серии испытаний (9).Полосапорогового контроля для H. pylori IgG-Virablot ® - полоса 60 kD (Hsp) илидля H. pylori IgA-Virablot - полоса 66 kD (UreB). Интенсивность пороговогоконтроля указывает границу для оценки полосы.Полосу считается четкой, если ее интенсивность равна или выше чеминтенсивность порогового контроля. Четкие полосы отмечаются знаком X впротоколе.Полосу считают нечеткой, если ее интенсивность меньше чем интенсивностьполосы порогового контроля. Нечеткие полосы отмечаются знаком (X) впротоколе.Только четкие полосы должны оцениваться.Полосы с более низкой интенсивностью чем пороговый контроль не должныоцениваться. Нечеткие полосы могут указывать на низкие титры антител.

Интерпретация результатовПолосы нужно рассматривать как симптомы заболевния. Для заключительного клинического диагноза все результаты этого и других испытаний должны бытькоррелированы с историей болезни, эпидемиологическими данными и другими данными, доступными лечащему врачу.136 kD (CagA), 87 kD (VacA), 30 kD, 26 kD (UreA) и 24 kD характеризуются как высокоспецифические для Helicobacter pylori. Полосы 60 kD (Hsp) и 50 kD имеютнизкоспецифичны для H. pylori и оцениваются с ограниченным значением. Дополнительные нехарактерные полосы могут появляться, но они не оцениваются.lgG, IgA Helicobacter pylori ViraBlot

Идентифицированные полосы / kD Результат ИнтерпретацияНет полос или неспецифические полосы или однаили более полос из: 66 kd (UreB), 60 kD (Hsp), 55kD (Fla), 50 kD.

отрицательный Специфических антител против H.pylori не обнаружено.

Одна четкая полоса из: 30 kD, 26 kD (UreA), 24 kD сомнительный Специфические антитела против H. Pylori обнаружены.Указание на инфекцию с H.pylori. Рекомендуется дополнительноепроведение теста для выявления IgM-и IgA антител и повторноеисследование образцов через 3-4недели.

По крайней мере одна четкая полоса из: 136 kD(CagA), 87 kD (VacA)

положительный, для 1 типа Специфические антитела против H.pylori обнаружены. Инфекциявысокопатогенным штаммом H.pylori тип l весьма вероятна.

Не менее двух четких полос из: 30 kD, 26 kD(UreA), 24 kD или одна четкая полоса от 30 kD, 26kD (UreA), 24 kD плюс одна четкая полоса от 60kD (Hsp), 50 kD.

положительный, для 2 типа Специфические антитела против H.pylori тип 2 обнаржены. Инфекциянизкопатогенным штаммом H.pylori тип 2 весьма вероятна.

Helicobacter pylori ViraBlor Комплект для тестирования lgG, IgAХарактеристики полос Helicobacter pylori ViraBlot"

Молекулярныйвес

Антиген Замечания / Специфика антител

136 kD CagA Цитотоксин-ассоциированный ген A: Высокоспецифичен для штамма Helicobacter pylori тип 1 (1);известен как маркер для язвы, обнаруживается в 80-100 % всех пациентов с желудочными илидуоденальными язвами, редко у пациентов с гастритом без язвы (2, 3, 4).

87 kDVacA

Вакуолизирующий цитотоксин: высокоспецифичен для штамма Helicobacter pylori тип 1 (1); как иCagA, известен как маркер язвы, появляется главным образом вместе с CagA (3).Описаны различныеразновидности белка (5).

66 kD UreB Уреаза-субъединица B; из-за сильного подобия с уреазами других организмов неспецифична дляHelicobacter pylori (6).

60 kD Hsp Протеин теплового шока; специфический для Helicobacter pylori; компонент комплекса тепловогошока (6).

55 kD Fla Flagella: компонент Helicobacter pylori flagella, родственный жгутикам других организмов, из-завыраженной перекрестной реактивности, неспецифичен для Helicobacter pylori (6).

50 kD Не охарактеризованный белок; специфический для Helicobacter pylori.30 kD Не охарактеризованный белок; высокоспецифический для Helicobacter pylori.26 kD UreA Уреаза-субъединица A; UreA не имеет никакого подобия с уреазами других организмов,

высокоспецифична для Helicobacter pylori (6).24 kD Не охарактеризованный белок; высокоспецифичный для Helicobacter pylori

4

Клинические характеристики антител к Helicobacter pylori

1. Helicobacter pylori подразделяется на высокопатогенные штаммы1 типа и низкопатогенные штаммы 2 типа (1). Высокопатогенныештаммы по классификации ВОЗ относятся к классу I веществ,канцерогенных для человека. Высоко и низко патогенные штаммыотличают два высокоспецифических протеина. Эти протеиныописаны только для высокопатогенных штаммов: CagA: Cytotoxinассоциированный ген и Vac A: Вакуолизирующий цитотоксин A. Вслучае инфекции штаммом типа II нет антител против этих белков.Общими для различных штаммов являются уреаза А (kD 26) и дванеохарактеризованных белка с молекулярным весом 30 kD и 24 kD.

2. IgG-антитела появляются в период от нескольких недель домесяцев после инфекции. На ранней стадии инфекции они часто ещене обнаруживаются. IgM-и IgA-антитела должны быть проверены вслучае подозрения на недавнюю инфекцию. В этом случаеповторный образец должен быть исследован некоторое времяспустя. Пациенты с хроническим заболеванием обычноположительны по IgG-антителам. Титр антител устойчивоуменьшается после эрадикационной терапии.3. IgM-антитела, обычно появляются через 1-8 недель после началазаболевания.4. IgA-антитела указывают на воспаление слизистой оболочкижелудка.5. Раннее лечение антибиотиком может подавить образованиеантител.

Предупреждения и предосторожности1. Все человеческие компоненты сыворотки в наших

изделиях были проверены на отсутствие ВИЧ - и HCV-антител иHbs-Antigene. Однако все человеческие компонентыдиагностического теста, а также образцы пациентов нужно считатьпотенциально инфекционными и обращаться с соответствующимипредосторожностями.

2. Не набирать пипетку ртом.3. Носить одноразовые перчатки при работе.4. Не есть, не пить и не курить в рабочей зоне.5. Конъюгат содержит азид натрия 0,1 %, контроли и

буфер для разведения/промывки содержат 0,02 % тимеросал:Внимание: вреден для здоровья. Промыть большим

количеством воды после контакта с кожей или глазами.Ядовит при попадании внутрь! (см. листы данных о безопасности).

6. Раствор хромоген/субстрата содержит BCIP инитросиний тетразолий. Избегайте контакта с кожей и глазами. Вслучае контакта с кожей и глазами промыть большим количествомводы.

7. Образцы исследования и все потенциальнозагрязненные материалы должны быть дезактивированы, используяустановленные лабораторные методы, например 20 минутавтоклавирования при 121,5°C. Жидкие отходы смешать сгипохлоритом натрия в окончательной концентрации 1%-гипохлорита натрия. Выдержать 30 минут для окончательнойдезинфекции.

Литература:1. СЯНЦЗЯН Z., и другие., Анализ выражения CagA и VacA факторов токсичности в 43 штаммах Helicobacter pylori показывает, что клиническийизолят, может быть разделен на два главных типа и что CagA не является необходимым для выражения vacuolating cytotoxin., Infect. Immun., 1995, 63(1): 94-98. 2. Cover T L, и другие. Helicobacter pylori: бактериальная причина гастрита, пептической болезни язвы и желудочного рака., ASM News,1995, 61 (1): 21-26. 3. COVACCI A. S., Молекулярная характеристика 128 kDa иммунодоминантного антигена Helicobacter pylori связанного сцитотоксичностью и дуоденальной язвой., PNAS, 1993. 90 5791 4. Cover T. L, и ал.. Серологическое обнаружение инфекции с cagA + helicobacterштаммов., J Clin. Microbiol., 1995, 33 (6): 1496-1500. 5. Cover T. L., и другие. Расхождение генетических последовательностей для vacuolating cytotoxinсреди штаммов Helicobacter pylori., J Biol Chem., 1994, 269 (14): 10556-10573 6. MALFERTHEIMER P. [редактор], Helicobacter pylori - Фон derGrundlage zur Therapie, Thieme, 1996. 2. Aufl.. 7. VIRAMED GmbH. Публикация в прогрессе. 1999 8. Abel U. Die Bewertung diagnostischer Испытания.Штутгарт, Hippokrates-Verlag, 1993 9. RILI-BAK: Bak-Richtlinie zur Qualitatssicherung quantitativer laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen.(1.1.2002). www.bundesaerztekammer.de <http: // www.bundesaerztekammer.de>1591 HPALen.doc/05.04.05