日医大誌 第54巻 第1号(1987) (17)17

原 著

新 し い 異 常 ヘ モ グ ロビンHemoglobin Sendagi

(β42Phe→Val)の 同 定 と そ の 機 能 特 性

緒方 清行

日本医科大学第1生 化学教室(主 任:岡 崎太郎教授)

Identification and characterization of a new hemoglobin

variant: Hemoglobin Sendagi (ƒÀ42Phe•¨Val)

Kiyoyuki Ogata

The First Department of Biochemistry, Nippon Medical School

A new unstable hemoglobin variant, Hb Sendagi (ƒÀ42Phe•¨Val), was found in a Japanese male and his

daughter both suffering from moderate hemolytic anemia. The structure of the variant was determined and the

functional properties were studied. The results obtained are as follows.

1) The variant was electrophoretically silent, but the abnormal ƒÀ-chain was found to emerge ahead of the

normal ,6-chain when the hemolysates from the patients were applied to a reverse-phase HPLC.

2) The tryptic peptides were prepared with the variant fl-chain enriched by isopropanol precipitation and

column chromatography on CM-cellulose. The abnormal peptide, ƒÀTx-5, was separated by fingerprint mapping

or by reverse-phase HPLC of the tryptic peptides.

3) Sequence analyses of the abnormal peptide revealed that the phenylalanine in position 42 (CD1) of the ƒÀ-

chain was replaced by valine. The variant was named as Hb Sendagi according to the place where it was

discovered.

4) Hb Sendagi showed a decreased stability upon heat denaturation and isopropanol precipitation tests, and

was oxidized faster than Hb A by atmospheric oxygen in the presence and absence of sodium benzoate.

5) The oxygen equilibrium curves of the hemolysates from the propositus also indicated that Hb Sendagi

had a lowered oxygen affinity and a normal response to 2,3-diphosphoglycerate.

Key words: abnormal hemoglobin, unstable hemoglobin, hemolytic anemia, oxygen affinity

緒 言

成 人 ヘ モグ ロ ビンの主 成 分 であ るHbAは,2本 の

α鎖 と2本 の β 鎖 か ら成 る4量 体 で あ り,α 鎖 を構 成

す る141個,β 鎖を構 成す る146個 の ア ミノ酸配 列 は

す べて知 られ て いる.ま た,こ れ らの ア ミノ酸 をcode

す る染色 体上 の遺伝 子位 置,お よびその塩 基配 列 も現

在 で はす べて 明 らか とな ってい る.異 常 ヘ モグ ロ ビン

は,こ の遺伝子 の変 異 の結 果 ア ミノ酸 配列 に異常 を 生

じた ものであ り,そ の異 常部位 お よび置換 した ア ミノ

酸 の種類 に よっ て,引 き起 こす臨 床症 状 を異 にす る.

した が って異常へ モ グ ロビンの 同定 は診断 の確 定 に必

須 と され るの は もち ろんで あ るが,一 方 多 くの異常 ヘ

モ グ ロ ビン の解 析 を通 じて,わ れわ れ は グ ロビン 遣 伝

子発 現 の調節機 構 やヘ モ グ ロ ビンの構 造 と機 能 との相

関 につ いて種 々 の知見 を得 るこ とが で きる.

異 常 ヘモ グ ロ ビンの 中 には,ア ミノ酸 異常 に よ って

ヘ モ グ ロ ビン分子 の安 定性 が失 われ,臨 床的 に様々 な

程度 の溶 血性 貧血 を引 き起 こす 一群 が あ り,こ れ らは

不安 定 ヘ モグ ロ ビン と称 され る.そ の多 くは,ヘ ムポ

ケ ッ ト内 面 にお いてヘ ムと相 互 作用 を有 して い る重 要

な ア ミ ノ酸 残 基 に 置 換 を 生 じ て い る.β 鎖42番

(CD1)フ ェニ ル アラ ニンは,こ のヘ ムポ ケ ッ トにおけ

る重要 な ア ミノ酸 残基 の一 つで あ り,現 在 まで に この

位 置 に置換 を生 じたヘ モ グ ロ ビン と しては,Hb Ham-

mersmith(β42Phe→Ser)お よ びHb Louisville

(Bucuresti)(β42Phe→Leu)の2種 類 が報告 されて

Present address: The Third Department of Internal Medi-

cine, Nippon Medical School, 1-1-5, Sendagi, Bunkyo-ku,

Tokyo, 113 Japan

18(18)

いる.

今 回著者 は,溶 血 性 貧血 を主訴 とす る成人 男 性お よ

びその娘 の血液 よ り,β 鎖42番(CD1)フ ェニル ア ラ

ニンがバ リンに置換 された新 しい不安 定 ヘ モグ ロビン

Hb Sendagiを 分離 ・同定 し,そ の機能 的特 性 につ い て

検 討 した ので報 告す る.

実験材料および方法

(1)症 例

発端 者:60歳,男 性,会 社 役員.

主訴:貧 血.

家族歴:娘 に貧血 を認め た.他 に子供 は な く,両 親

につい ての詳 細 は不明 であ った.

既 往歴:特 記す べき 事項 な し.

現病歴:42年 前 よ り溶血 性 貧血 を 指 摘 され て お り,

精査 を 目的 に 日本 医科 大学 付属病 院 第3内 科 を受 診 し

た.

身 体所見:眼 球結 膜 に軽度 の黄 疽 を認 め,脾 を左季

肋 下 に約8cm触 知 した.

検査 所見:発 端者 お よび その娘 に中 等度 の溶 血性 貧

血 を認 めた 。血 液塗抹 標 本 では,多 染性 赤血 球 に多 数

の好塩 基性 斑点 がみ られ たが,ハ イ ンツ 小体 は認め ら

れ なか った.直 接 な らびに間接 クー ム久試験,ハ ム試

験,蔗 糖 水試 験 は陰性,赤 血球 自己溶血 試験 お よび赤

血 球浸透 圧脆 弱 性は正 常 であ った.血 液 学的 検査 所 見

の一部 をTable1に 示 した .

(2)実 験方 法

1)採 血

Table1 Hematological Data

血 液 試 料 は,ヘ パ リン を 抗 凝 固 剤 と して 患 者 肘 静 脈

よ り採 取 した,対 照 と して,健 康 成 人 男 性 か ら 同 様 に

採 取 した 血 液 を 用 い た.

2)溶 血 液 の 調 製

血 液 試 料 を700×g,10分 遠 沈 し て 得 た 赤 血 球 に5

容 の 生 理 食 塩 水 を 加 え,同 様 の条 件 で 遠 沈 し て3回 洗

浄 し た.得 られ た 赤 血 球 に等 容 の 蒸 留 水 お よ び0.5容

の トル エ ン を 加 え,ド ラ イ ア イ ス ー ア セ トン を 用 い て

凍 結 ・融 解 を3回 繰 り返 した 後,10,000×g,30分 遠 沈

を 行 い 溶 血 液 層 を 分 離 した.

3)血 液 学 的 検 査

臨 床 血 液 検 査 は,常 法 に よ り行 った.ヘ モ グ ロ ビン

の 吸 収 ス ペ ク トル は,リン 酸 カ リウ ム 緩 衝 液,pH6.6

に よ っ て ヘ ム濃 度 約100μMに 希 釈 し た 溶 血 液 に つ

き,日 立200-10型 分 光 光 度 計 を 使 用 して 記 録 した.

メ トヘ モ グ ロ ビ ン 含 量 は,Evelyn-Malloy法 に よ り

CN-メ トヘ モ グ ロ ビン 量 か ら 算 出 し た .HbA2量 は

Huntsmanら の セ ル ロ ー ス ア セ テ ー ト電 気 泳 動 法,

HbF量 はBetkeら の ア ル カ リ変 性 法 に よ り測 定 し

た.赤 血 球 内 諸 酵 素;glucose-6-phosphate dehy-

drogenase,methemoglobin reductase,superoxide

dismutase,glutathione peroxidase ,catalase,

pyrimidine 5'-nucleotidaseの 活 性 は 常 法 に よ り

測 定 し た.ハ イ ンツ 小 体 生 成 試 験 は,Dacieら の フ ェニ

ル ヒ ドラ ジ ン に よ る方 法 で 行 っ た .ヘ モ グ ロ ビ ン の

不 安 定 性 はRiederら の 熱 変 性 試 験 お よ びCarrell

らの イ ソ プ ロパ ノ ー ル 試 験 に よ り判 定 し た.

4)電 気 泳 動 お よ び 逆 相 高 速 液 体 ク ロ マ ト グ ラ

フ ィ ー(逆 相HPLC)に よ る 分 析

電 気 泳 動 は 既 存 の 方 法 に 従 い,Tris-EDTA-borate

(TEB)緩 衝 液,pH8.6お よび 尿 素 ・メ ル カ プ トエ タ

ノ ー ル 緩 衝 液,pH6.0,8.9を 用 い ,セ ル ロー ス ア

セ テ ー トプ レ ー ト上 で 行 った .等 電 点 電 気 泳 動 は,Bas-

setら の 方 法 に よ りポ リ ア ク リル ア ミ ドゲ ル 中 で

pH3.5～8.5の 範 囲 で 行 った.

逆 相HPLCに よ る 溶 血 液 の 分 析 は,Congoteら の 方

法 に 準 じて 行 った.C18東 洋 曹 達5LS-410カ ラ ム

(4×300mm)を 溶 媒A(ア セ トニ ト リル:ト リ フル

オ ロ酢 酸:水=45:0.3:54.7,v/v/v)で 平 衡 化 した

後,溶 血 液10μl(Hb200～300μg)を 注 入 し,溶 媒B

(ア セ ト ニ ト リ ル:ト リ フ ル オ ロ 酢 酸:水=50:

0.15:49.85,v/v/v)によ って 直 線 濃 度 勾 配 を つ く り,

グ ロ ビ ン鎖 を 溶 出 し た.勾 配 は0分 時 に 溶 媒A100%,

溶 媒B0%,170分 時 に 溶 媒A25%,溶 媒B75%と な51Cr T1/2: half-life of 51Cr-tagged red cells

(19)19

る よ うに 作 製 し,流 速 は1ml/minと した.ま た 操 作 中

の カ ラ ム は20℃ の 定 温 と し た.

5)異 常 グ ロ ビ ン鎖 の 分 離

イ ソ プ ロパ ノ ー ル 沈 殿 法 に よ っ て 異 常 グ ロ ビン 鎖

を 大 量 に 集 め た.発 端 者 の 溶 血 液(Hb約100mg/ml)

に17%の イ ソ プ ロパ ノ ー ル を 含 む0.1Mト リス 塩 酸

緩 衝 液,pH7.4を10容 加 え,37℃ に お い て30分in-

cubateし た 後,1,500×g,10分 遠 沈 し,沈 殿 した ヘ モ

グ ロ ビ ン を 蒸 留 水 で 洗 浄 し た.次 い で これ を10mM

の 蟻 酸 に 溶 解 し,Ansonら の 塩 酸 ア セ トン 法 で 脱 ヘ

ム した 後,Cleggら の 方 法 に 従 っ てCMセ ル ロー ス

カ ラ ム ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー に よ り,α お よ び β 鎖 を 分

離 ・精 製 した.精 製 した グ ロ ビ ン鎖 は,Cleggら の 方

法 に よ り,ア ミ ノエ チ ル 化 した 後TPCK処 理 し た ト

リ プ シ ソ を 用 い て 加 水 分 解 した.

6)ア ミ ノ酸 異 常 の 同 定

フ ィ ン ガ ー プ リ ン トの 作 製 は,Haranoら の 方 法

に 従 った.ト リプ シ ソ分 解 に よ って 得 た ペ プ チ ドを 少

量 の 蒸 留 水 に溶 解 し,濃 度 を 約50mg/mlと した.そ

の3～6μlを セ ル ロ ー ス 薄 層 プ レー ト(Eastman

Kodak Co.)に ス ポ ッ ト,し,pH6.8の 緩 衝 液(ピ リジ

ン:酢 酸:水=50:1:450,v/v/v)を 電 極 液 と して

300ボ ル ト,2時 間 電 気 泳 動 した.次 い で この プ レ ー ト

を 乾 燥 さ せ た 後,n.ブ タ ノ ー ル,酢 酸,水(4:1:5,

V/V/V)を 溶 媒 と し た 上 向 性 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ーを 行

い2次 元 に展 開 した.ペ プ チ ドの 検 出 に は1.8%の カ

ド ミウ ム ・ニ ン ヒ ド リン 溶 液 ま た は0.01%の フル オ レ

ス カ ミン 溶 液 を 用 い た.異 常 ペ プ チ ドを,10%酢 酸 で

セ ルロー ス プ レ ー トよ り溶 出 し凍 結 乾 燥 した 後,1ml

の6M塩 酸 に 溶 解,減 圧 下 で110℃,20時 間 加 水 分 解

した.こ の 分 解 物 の ア ミノ酸 組 成 を 日立835型 ア ミノ

酸 分 析 器 に よ り決 定 した.

逆 相HPLCに よ る ペ プ チ ドの 分 離 は,Strahlerら の

方 法 に 準 じて 行 った.ト リプ シ ン 分 解 後 の ペ プ チ ド

約1nmolを,溶 媒C(ア セ トニ ト リル:ト リフ ル オ ロ

酢 酸:水;50:1:49,v/v/v)に 溶 解 し た.こ れ を

5%の 溶 媒D(ア セ トニ ト リル:ト リ フル オ ロ酢 酸=

99.9:0.1,v/v)お よ び95%の 溶 媒E(ト リフ ル オ ロ

酢 酸:水=0.1:99.9,v/v)で 平 衡 化 し たBaker

WP-C4カ ラ ム に 注 入 し た 後,溶 媒Dお よ びEを 用 い

た 直 線 濃 度 勾 配 に よ っ て 溶 出 した.勾 配 は,0分 時 に

溶 媒D5%,溶 媒E95%,120分 時 に 溶 媒D95%,溶 媒

E5%と な る よ う に 作 製 し,流 速 は1.5ml/minと し

た.こ のHPLCに よ り分 離 し た 異 常 ペ プ チ ドに つ い

て,Applied Biosystems社 の470A型 気 相sequencer

を 用 い てEdman分 解 を 行 い,得 ら れ た フ ェ ニル チ オ

ヒ ダ ン トイ ン誘 導 体 を順 次HPLCに よ り同 定 し,ア ミ

ノ 酸 配 列 を 決 定 し た,

7)機 能 的 特 性 の 検 討

ヘ モ グ ロ ビ ン の 酸 素 結 合 能 は,Okazakiら の ト ノ

メ ー タ ー法 に よ っ て,キ ャ リー14型 分 光 光 度 計 を 用

い て 測 定 した.Bermanら の 方 法 に よ り,溶 血 液 中 の

ヘ モ グ ロ ビ ン を ス ト リ ッ プ した 後,Sephadex G25カ

ラ ム に よ って50mMト リス 塩 酸 緩 衝 液,pH7.4で 平

衡 化 した.こ の ヘ モ グ ロ ビ ン 溶 液 を50mMト リス 塩

酸 緩 衝 液,pH7.4に よ りヘ ム濃 度 約60μMに 希 釈 し,

25℃ に お い て 酸 素 結 合 能 を 測 定 した.赤 血 球 中 の2,

3-diphosphoglycerate(以 下2,3-DPGと 略 す)濃 度 は,

Sigma35u.v.kitを 用 い て 測 定 した.

ヘ モ グ ロ ビ ン の 自酸 化 速 度 は,溶 血 液 を0.1Mリ ン

酸 ナ ト リ ウ ム緩 衝 液,pH6.5,37℃ ま た は,0.8M安

息 香 酸 ナ ト リ ウ ム を 含 む0.13Mリ ン 酸 ナ ト リウ ム緩

衝 液,pH7.2,30℃ の 条 件 下 で 一 定 時 間incubateし た

後 の ヘ モ グ ロ ビ ン 吸 収 ス ペ ク トル の 変 化 よ り求 め た.

結 果

1.血 液 所 見

発 端 者 お よ び そ の 娘 の 溶 血 液 に つ い て 測 定 し た ヘ モ

グ ロ ビ ン の 吸 収 ス ペ ク トル に は,異 常 を 認 め ず,ま た

赤 血 球 中 の メ トヘ モ グ ロ ビン 含 量,赤 血 球 内 酵 素

(glucose-6-phosphate dehydrogenase,methemo-

globin reductase,superoxi dedismutase,glutathione

peroxidase,catalase,pyrimidine5'-nucleotidase)活

性 は い ず れ も正 常 範 囲 で あっ た.し か し な が ら,両 者

の 血 液 を0.1%の ア セ チ ル フ ェ ニ ル ヒ ド ラ ジン 存 在 下

で37℃,4時 間incubateす る と,い ず れ も 約60%の 赤

血 球 に 多 数 の ハ イ ン ツ小 体 の 生 成 が 認 め られ,さ らに

溶 血 液 に 対 す る熱 変 性 試 験 お よ び イ ソ プロ パ ノ ー ル試

験 は い ず れ も 陽 性 を 示 し た.こ の 結 果 か ら,こ れ らの

赤 血 球 に は 不 安 定 ヘ モ グ ロ ビ ン が 存 在 す る こ とが 強 く

疑 わ れ 以 下 の 検 索 を 行 っ た.

2.電 気泳動 お よび逆 相HPLCに よる異 常Hbの 検

索

Fig.1はTEB緩 衝液,pH8.6を 用 いた溶血液 の電

気泳 動像 で あ る.図 にみ られ る よ うに,正 常人 に比べ

て発 端老 の溶 血液 はHbAか らHbA2の バ ン ドにか け

て び まん性 のtrailingを 示 し,origin付 近 には遊 離 の

20(20)

Fig.1 Electrophoresis on a cellulose acetate plate

with TEB buffer, pH 8.6

Freshly prepared hemolysates of the normal

man and the propositus were analysed as

described in methods.

Lane 1: normal hemolysate, Lane 2,3:

propositus' hemolysate

α鎖 と思わ れ る淡 いバ ン ドが認め られ たが,そ の他 に

異常 ヘ モ グ ロ ビン と考 え られ る成 分 は認め られな か っ

た.ま た こ こには示 してい ない が,尿 素 ・メル カ プ ト

エ タ ノール緩 衝 液,pH6.0,8.9を 用 いた電 気 泳動 お よ

び 等電点 電 気泳 動 に も明 らかな 異常 を認め なか った.

これ らの結 果か ら,本 例 は電 気泳 動上silentな 異常 ヘ

モ グ ロ ビンを有 す る もので あろ うと考 え られ たの で,

異常 ヘ モ グ ロ ビンの存 在を確 認す るため に,次 に患 者

溶血 液 をCongoteら の 方法 に 準 じて逆 相HPLCに

よって 分析 した,結 果はFig.2に 示す ご とくで,正 常

人溶血 液(Fig.2A)で は,β 鎖 お よ び α鎖 が それ ぞれ

単 一 の ピー クと して きれ いに溶 出 され たが,こ れ に比

べて発 端 者溶 血液(Fig.2B)で は,正 常 β 鎖(βA)

の溶 出 位 置 よ り8分 ほ ど早 期 に 明 らか な異 常 ピー ク

(βX)が溶 出 され た,そ こで この 異常成 分 が α 鎖,β 鎖

の いず れ に由来 す る ものか を知 る 目的 で,各 ピー クの

面 積比 を計 算 した ところ,正 常 人で は α:43.3%,β:

56.7%で あ るの に対 して,発 端 者 で は αA:42.4%,

βA:34.8%,βX:22,8%と な った.こ の結 果 か ら,発

端 者溶 血 液 中 の 異 常 成 分 は β鎖 異 常 に 基 づ く もので

あ ると考 え られ た.同 様 の 分析結 果 は患 者の 娘 につ い

て も得 られ た.こ の 異常 β鎖 は発端 者 にお いて 全 β鎖

の39.6%を 占め,娘 に おい ては28.6%を 占め た.

3.異 常 グ ロ ビン鎖 の分 離

上記 の検 討 に よって 本症 例 が β 鎖 に 異 常 を 有 す る

こ とが ほぼ確 実 視 され たので,次 に異 常鎖 の ア ミノ酸

Fig.2 Globin chain separation by reverse-phase

HPLC using a C18 Toyo Soda column

Samples were the same as those in Fig.1.

A : normal hemolysate, B : propositus'

hemolysate

置 換部 位 を同定 す る 目的 か ら,発 端者 溶血 液 よ り異常

鎖 の亜 精製 を試 み た.

Fig.3は 発端 者 溶 血 液 につ い て イ ソ プ ロパ ノ ール

処 理 を行 い,沈 殿 した ヘ モグ ロビンを脱 ヘ ム後,得 ら

れ た グ ロ ビ ンに つ いてCMセ ル ロー ス カ ラ ム ク ロマ

トグ ラフ ィーを行 った結 果 であ る.図 中 の α鎖 お よび

β鎖 の溶 出位 置 は,い ず れ も正 常 の両 グ ロ ビン鎖 の溶

出位置 とよ く一 致 して いた が,図 に 明 らか な よ うに,

この沈 殿 中 に は α鎖 に比 して β鎖 が 大 量 に 含 ま れて

い る ことが分 か った.こ の事 実 は,イ ソプ ロパ ノール

に よ って異 常 β鎖 が あ る程 度 特 異 的 に沈 殿 した こ と

を示 して い る.こ の β鎖 を 集め,ア ミノエ チル 化 した

後TPCK処 理 した トリプシ ソを用 いて加 水 分解 し,得

られ たペ プ チ ドを以下 の分析 に使 用 した.

4.ア ミノ酸異 常 の 同定

Fig.4は 正常 β鎖 お よ び亜精 製 した 異 常 β鎖 を ト

リプシ ン分解 して得 られた ペ プチ ドの,フ ィン ガ ープ

リン ト像 を示す.両 者 を比較 す る と,正 常 β鎖(A)

(21)27

Fig.3 CM-cellulose chromatography of the

isopropanol-precipitated globins

The propositus' hemolysate was treated with

isopropanol, and the precipitated hemo-

globins were dehemed by the acid-acetone

method and then separated by the chromato-

graphy as described in methods.

Table 2 Amino Acid Composition of ƒÀTx-5

The amino acid composition of the abnormal peptide,

ƒÀ Tx-5, was determined on a Hitachi 835 amino acid

analyzer. Data are presented as the number of amino

acid residues per peptide.

に み られ るβT-5,βT-5oxの 二 つ の ス ポ ッ トが,異 常 β

鎖 で は 上 方 向 へ の 移 動 が お そ く,βT-3の 位 置 に 近 く

な っ て い る こ とが 分 か る(RTx-5, RTx-5ox).ま た,他

の ペ プ チ ドの 移 動 位 置 は い ず れ も よ く 一 致 し,A,B間

で の 差 異 は み られ な か った.そ こ で,異 常 β 鎖 の βTx-

5ス ポ ッ トを プ レ ー トよ り 溶 出 し,ア ミ ノ 酸 分 析 を

行 っ た.そ の 結 果Table2に 示 し た よ う に,異 常 ペ プ

チ ド(βTx-5)は 正 常 ペ プ チ ド(βT-5)と 同 じ く19個

の ア ミ ノ酸 よ り成 るが,正 常 に 比 して フ ェ ニ ル ア ラ ニ

Fig.4 Fingerprints of the tryptic peptides

The ƒÀ-chains were aminoethylated and

digested with trypsin, and the resultant pe-

ptides were subjected to the fingerprinting as

described in methods.

A:normal ƒÀ-chain, B:ƒÀ-chain from the iso-

propanol precipitate of the propositus'

hemolysate. "Ox" means that the methionyl

residue of ƒÀT-5 is oxidized to methionine

sulfoxide.

ン残基 が 一つ 少 な く,代 わ りにバ リン残 基 が一つ 多 い

こ とが分 か った.正 常 βT-5は β鎖 の41～59番 の ア ミ

ノ酸 を含 む ペ プチ ド(β-CD)で あ る こ とが知 られて い

るので,こ の結 果,本 例 の異常 ヘモ グ ロ ビンは β 鎖41,

42,45番 の三 つの フ ェニル ア ラニ ン残基 の うち,い ず

れ か.一つ がバ リン残基 に置 きかわ って い る こ とが示 唆

された.こ の 置 換 部 位 を 明 らか に す るた め,次 い で

βTx-5を 逆 相HPLCに よ って 単離 し,ア ミノ酸配 列 を

決定 した.Fig.5は,ペ プ チ ドの逆 相HPLCに よ る分

離 を示す.図 の よ うに,正 常 β鎖 で は βT-5は58分 の

位 置 に高 い ピーク として溶 出 された が,亜 精 製 した異

常 β鎖 で は,正 常 βT-5ピ ー クはわ ず か に しか み られ

ず,代 わ りに明 らかな 異常 ピー ク(Tx)が53分 の位置

22(22)

Fig.5 Separation of the tryptic peptides by reverse-

phase HPLC using a Baker WP-C4 column

Samples were the same as those in Fig.4.

A:normal ƒÀ-chain, B:ƒÀ-chain from the

isopropanol precipitate of the propositus'

hemolysate.

Table3 Sequence analysis of the abnormal peptide

(ƒÀ41•`59)

The abnormal peptide, ƒÀTx-5, was sequenced using an

Applied Biosystems model 470A gas-phase sequencer.

The phenylthiohydantoin derivatives were determined

by HPLC.

に認め られた(微 量 の正 常 βT-5ピ ークの混 在 は,イ ソ

プ ロパ ノール に よ って 少量 の正 常 β鎖 も とも に沈 殿

した こ とを示 してい る).こ の異 常 ピー クを集 めて ア ミ

ノ酸 配列 を決 定 した.Table3か ら分 か るよ うに,異 常

ピー クのア ミノ酸 配列 は β鎖42番(CD1)の フ ェニル

ア ラニン残基 がバ リン残 基 に置 換 され てい るほか は,

完全にβT-5の もの に一致 した.

以上 の解 析結 果 か ら,発 端 者赤血 球 中 に存 在 す る異

常 ヘモ グ ロビン は,そ の β 鎖42番(CD1)の フェニル

ア ラ ニン残基 が バ リン残基 に置 換 され てい る こ とが明

らか とな った.現 在 まで に本例 と同一 の異常 ヘモ グロ

ビンの報告 例 は な く,わ れ わ れは これ を発見 した地 名

にちな んでHemoglobin Sendagi(千 駄 木)と 名 付け

た.

5.Hb Sendagiの 機 能特 性

Hb Sendagiの 酸 素結 合特 性 を知 るた め,Sephadex

G25カ ラム に よっ て ス トリッ ピン グ を行 った 溶 血 液

につ いて,2,3-DPG存 在 下 お よび非存 在 下で の酸素解

離 曲線 を求 め た.Fig.6は そ の結 果 で あ る.図 の よう

に,2,3-DPG非 存在 下 で は,発 端者 溶血 液 のP50(3.75

mmHg)は 正 常者 のP50(3.05mmHg)に 比 して 明 ら

かに高 く,Hb Sendagiの 酸 素親 和 性が 正常 ヘ モ グ ロ

ビンよ り弱 い こ とを示 して い る.ま た,Hill plotよ り

求 めたn値 は発端者 で2.3,正 常 者 で2.9で あ り,Hb

Sendagiで は ヘ ム間 の協 同作 用(co-operativity)も 低

下 して い る こ とが示唆 された.一 方,2mMの2,3-DPG

存在 下 では,正 常 者 お よび発 端者 溶血 液 の酸 素 解離 曲

線 は ともに 著 し く右 方 にシ フ トし,P50値 は正 常 者 で

9.4mmHg,発端者 で11.0mmHgで あ った.ま たn値

はそ れ ぞ れ2,3-DPG非 存 在 下 の もの と変 わ らなか っ

た.こ れ らの事実 か ら,Hb Sendagiの2,3-DPGに 対

す る感 受 性 は正常 で あ る と思 われ た.ま た,発 端 者赤

Fig.6 Oxygen equilibrium curves of the

hemolysates

Experiments were performed using the

stripped hemolysates with (•œ,•£) or without

(•›,•¢) 2mM 2,3-DPG as described in methods.

Circles:normal hemolysates, Triangles:

propositus' hemolysates

(23)23

血 球 中 の2,3-DPG濃 度 を測 定 した と ころ正 常 範 囲 で

あ った.な お,酸 素結 合能 の測 定中,明 らか な メ トヘ

モ グ ロビンの生成 は起 こらな か った .

Fig.7 Rates of autoxidation of the hemoglobins

Hemolysates were incubated at 37•Ž in 0.1M

sodium phosphate buffer, pH6.6.

Open circles:normal hemolysate, Closed

circles:propositus' hemolysate

Fig.8 Rates of oxidation of the hemoglobins in the

presence of sodium benzoate

Hemolysates were incubated at 30•Ž in 0.13M

sodium phosphate buffer, pH7.2, containing

0.8M sodium benzoate.

Open circles:normal hemolysate, Closed

circles:propositus' hemolysate

6.自 酸 化速度 の測定

Hb Sendagiの 不 安 定 性 を 確 か め る 目的 か ら,in

vitroに おけ る 自酸化 速 度 の測定 を試 み た.ま ず,溶 血

液 を0.1Mリ ン酸 ナ ト リ ウ ム緩 衝 液,pH6.6中 で

37℃ でincubateし,経 時 的 に ヘモ グ ロ ビン吸 収 スペ ク

トル を記 録 した.正 常者 お よ び発 端者 ともに,反 応12

時 間後 ま で メ トヘ モ グ ロ ビンの増量 が観 察 された が,

そ れ以後 は混濁 がみ られ た.メ トヘ モ グ ロ ビン生成 反

応 の経過 はFig.7の ごと くで,こ れ か ら一次反 応 の速

度定 数(k1)を 求 め る と,正 常者 溶血 液 で3.97×10〓-2/

h,発 端 者 で6.73×10〓-2/hと な り,Hb Sendagiの 自酸

化速 度 がHbAに 比 して速 い こ とが示 唆 された.次 に

溶血 液 を0.8M安 息 香酸 ナ トリウムを含 む0.13Mリ

ン酸 ナ トリウム緩 衝 液,pH7.2中,30℃ の条 件 下 で

incubateし,経 時的 にヘ モグ ロビン吸収 スペ ク トルを

記録 した.こ の場合 は上 記 の反応 と異 な って,生 成 物

はヘ ミク ロームで あ り,ヘ ム鉄 の酸化 と同時 に蛋 白部

分の 変 性 を 伴 う もの と考 え られ た.そ の 反応 経 過 を

Fig.8に 示 した が,発 端 者溶 血液 で はヘ ミク ロー ム生

成反 応 が 開始後30分 まで急 速 に進行 し,以 後正 常溶 血

液 と同 じ反応 速 度 に なる こ とが 明 らか にな った.こ の

結果 は,上 記 の メ トヘ モ グ ロ ビン生成 反応 と同様 に,

安 息香酸 ナ ト リウムに よ るHb Sendagiの 変性 も正 常

ヘ モ グ ロ ビ ンに比 して きわ め て速 い ことを示 して い

る.ま た,緩 傾 斜部 分 を外挿 す る こ とに よ り,ヘ モ グ

ロビンの安 定性 の上 か ら,発 端者 溶血 液 中に は正常 成

分 が52%,異 常成 分 が48%含 まれ る こ とが推 定 され

た.

考 察

ヘ モグ ロビン 分子 内 にお いて,ヘ ムは ヘ ムポ ケ ッ ト

と呼 ぼれ る疎 水 性 の環境 内 に位置 し,こ のポ ケ ッ ト内

に露 出す るい くつか の非極 性 ア ミノ酸 残基 と相互 作用

を有 して い る.し たが って,こ れ らの ア ミノ酸 残基 は

ヘモ グ ロ ビンの構造 お よび機 能 の維 持 に重要 な役割 を

果 た して お り,そ の いず れ か に置換 を生 じる と,ヘ ム

部 お よび グ ロビン部 の安 定性 に異常 を来 た し,い わ ゆ

る不安 定 ヘ モグ ロビン症 として臨床 的に は種 々の程度

の溶 血性 貧血 を呈 す る.ヘ モ グ ロ ビンの β鎖42番

(CD1)に 位置 す る フ ェニル ア ラニ ンは,こ のヘ ムポ

ケ ッ トに おけ る重要 な残 基 の一 つで あ り,す べ ての哺

乳類 のべ モ グ ロビンに おい て この残基 が保存 され て い

る,い わ ゆ る不 変残 基で あ る.そ の役 割 はヘ ムポ ケ ッ

トの疎 水性 環境 を形 作 る と ともに,側 鎖 のベ ンゼ ン核

24(24)

が ヘ ムの位 置 を一 定 に保 持 す るspacerと して働 く も

の と考 え られ て い る.こ の フ ェニル ア ラニ ンに 置換

を 生 じた 異 常 ヘ モ グ ロ ビン の 例 と して は,従 来Hb

Hammersmith(β42Phe→Ser)お よ びHb

Louisville(Bucuresti)(β42Phe→Leu)が 報 告 さ

れ て い る.ま た,β 鎖CD1と 相 同 の位置 に あ る α鎖

43番(CE1)フ ェニル ア ラニ ンに置換 を 生 じた例 とし

ては,Hb Torino(α43Phe→Val)お よびHb

Hirosaki(α43Phe→Leu)が あ る.こ れ らの異 常

ヘ モグ ロビンは いず れ も不安 定 であ り,ま た すべ て酸

素 親 和 性 の低 下 を伴 って い た.今 回 著者 が 同 定 した

HbSendagiは,β 鎖42番(CD1)に 関 して は3種 類

目め異 常ヘ モ グ ロ ビンで あ り,上 述 のヘ モグ ロビン と

とも にCD1フ ェニ ル ア ラ ニ ンが ヘ モ グ ロ ビ ンの 構

造,お よび機 能 維持 に果 たす 役割 を知 る上 で の重 要 な

一例 と考 え られ る.

Hb Hammersmithの 患 者 が,幼 小児 期 よ り重 篤 な

溶血 性 貧血 を引 き起 こす の に対 し,Hb Sendagiの 患

者 では 自覚症 状 を欠 く中等 度 の溶血 性貧 血 がみ られ る

にす ぎなか った.こ れ はHb Hammersmithで は,βCD

1フ ェニル ア ラ ニンが極 性 の強 い ア ミノ酸で あ るセ リ

ンに置換 され て い るの に対 し,Hb Sendagiで は,わ ず

か に疎 水 性 の異 な る バ リンに 置換 され て い る事 実 に

よって説 明 され る.す なわ ち,Hb Hammersmithで は

セ リン の導入 に よって ヘ ムポ ケ ッ ト内の 疎水 性環境 に

破 綻 を生 じ,ヘ ム鉄 の安 定性 が極 度 に低下 してい るの

であ ろ う.し か しな が ら,HbSendagiの 安定 性 が正 常

ヘ モグ ロビンに比べ て低 下 して い る こと も事 実 で,こ

れはinvitroに おけ るヘ ム鉄 の 自酸化 速度 お よび変 性

剤 存在 下 にお け るヘ ミク ロー ム生 成速 度 の増 加 に 明 ら

かに示 され て い る.

一方,酸 素結 合反 応 に関 して は,Hb Sendagiは 従来

の βCD1異 常 の ヘ モ グ ロ ビン と同様 に,酸 素 親和 性

の低 下(酸 素解 離 曲線の右 方 移動)を 示 した .周 知 の

よ うに,ヘ モグ ロビン分子 にはR-stateお よびT-state

と呼ば れ る二 つ の ア ロス テ リック構 造が 存在 して,両

者 は平衡 関係(R〓T)に あ り,ま た前 者は 後者 に比

べ て強 い酸素 親和 性 を有 して い る.従 来,β 鎖CD1の

フ ェニル ア ラニ ンは その側 鎖 のベ ンゼ ン核 に よって,

ヘ ムを一 定 の傾 斜位 置 に固 定 し,ヘ モグ ロ ビンをR-

stateに 保 つの に寄 与 してい る と考 え られ て い る.い

ま,こ の フ ェニルア ラニ ンが側鎖 の よ り小 さな ア ミノ

酸 に置 換 され て そのspacerと しての 機能 が低 下 した

とす れば,ヘ モ グ ロ ビンは よ りT-stateに 近 づ くこ と

に な り,酸 素親 和 性 は低 下 す る.CD1異 常 ヘ モグ ロビ

ンにみ られ る親 和 性の低 下 は以上 の機 構 に よって説 明

され るわ けで,今 回のHb Sendagiの 機能特 性 もこの

考え を さ らに支 持 す る もの で ある.

一般 に,電 気 泳動上silentな 異 常 グロ ビン鎖 を同定

す る こ とは 困難 で あ る.Hb Sendagiは 電気 泳動 上

silentで あった が,TEB緩 衝 液を 用い た電気 泳動 にお

い て,HbAか らHbA2に かけ てtrailingを 示 し,さ ら

に遊 離 α鎖 と思 われ るバ ン ドが認 め られた.前 者 は,

泳動 中 に不安 定 な異常 鎖 よ りヘ ムが遊離 した ため と考

え られ,後 者 は不 安 定 な異 常 β鎖 の崩 壊 に よ って相 対

的 に α鎖 が過剰 にな ったた め と考 え られ る.今 回著 者

は,Hb Sendagiの 異 常鎖 を逆 相HPLCに よ って分 離

す る こ とがで き,ま た イ ソプ ロパ ノール沈 殿法 に よ っ

て亜精 製 す る ことがで きた.こ れ らの方法 は,泳 動 上

silentな 異 常 ヘモ グ ロ ビン の同 定 に きわめ て有 用 な手

段 と思 わ れ る.ま た,異 常 ペ プチ ド(βTX-5)の フィン

ガ ープ リン ト上 お よび逆相HPLC上 の挙動 よ り,異常

ペ プチ ドは正 常 ペ プチ ドに比 して疎 水性 が低 い こ とが

示 され た.こ れ は,フ ェニル ア ラニ ンがバ リンに置 換

されて い る事 実に よ く一 致 す る もので ある.

従 来,ヒ トβ グ ロビン鎖mRNAの 塩基 配列 の解 析

か ら,βCD1フ ェニル アラ ニ ンのmRNAcodonは

UUUで あ る こ と が知 られ て い る.一 方,バ リン を

codeす るに はGUU,GUC,GUA,GUGの4種 の塩 基

配 列 が可能 で ある.多 くの異常 ヘ モ グ ロ ビンが 一塩基

置 換 に よ って起 きてい る ことを考 え る と,Hb Sendagi

の成 因 も β鎖mRNA上 に み られ るUUUか らGUU

へ の 一 塩 基 置 換,す な わ ちDNAレ ベ ル に お け る

AAAか らCAAへ の 変異 に よ るもの と推 察 され る.

結 論

溶 血 性 貧血 患 者 の血 液 よ り新 しい 異 常 ヘ モ グ ロ ビ

ン,Hb Sendagi(β42Phe→Val) ,を 同定す ると と

もにその機 能的 特性 を検 討 した.結 論 は以 下 の ごと く

であ った.

1)異 常 グ ロビン鎖 は電 気泳 動上silentで あ った が,

逆 相HPLCに よ り分離 し,ま た イ ソプ ロパ ノール沈殿

に よって亜精 製す る ことが で きた.

2)異 常 グ ロビ ン鎖 を ト リプシ ン分解 して 得 た ペ プ

チ ドを フ ィン ガー プ リン トマ ップお よび 逆 相HPLC

に よ って分析 し,本 例 が β鎖42番(CD1)の フ ェニ

ル ア ラニ ンが パ リンに置換 され た新 しい異 常 ヘ モグ ロ

ビンであ るこ とを示 し,こ れをHb Sendagiと 名付 け

(25)25

た.

3)Hb Sendagiは,熱 変 性試 験,イ ソプ ロパ ノール

試験 お よび 自酸化 速度 の測定 に よって,不 安定 ヘ モグ

ロビンであ る ことが分 か った.

4)Hb Sendagiは 正常 ヘ モ グ ロ ビン に比 して低 い

酸素 親和 性 を示 した が,2,3-DPGに 対 す る感受 性 は正

常 で あ った.

稿を終えるにあたり,御 助言・御協力をいただいた第1生 化学

教室後藤至孝助教授ならびに教室員各位,患 者血液を提供してい

ただいた第3内 科学野村武夫教授ならびに檀和夫博士,患 者溶血

液のHPLC分 析に御協力をいただいた独協医科大学生化学教室

梶田昭彦教授ならびに野沢ゆ り子学士に深 く感謝の意 を表 しま

す。

文 献

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(受付:1986年5月24日)