学号：200226061 udc 厦门大学博硕士论文摘要库 ·...

白氏文昌鱼(B

ranchiostoma belcheri)

分子分类及其m

tDN

A

全序列

许

群

山

指导教师王义权教授

厦门大学

学校编码：10384 分类号_______密级 ______

学号：200226061 UDC

厦门大学

硕士学位论文

白氏文昌鱼(Branchiostoma belcheri)分子

分类及其 mtDNA 全序列 Molecular Taxonomy and Complete mtDNA Sequence of

Branchiostoma belcheri

许群山

指导教师姓名：王义权教授

专业名称：细胞生物学

论文提交日期： 2005 年 7 月 7 日

论文答辩日期： 2005 年 8 月日

学位授予日期： 2005 年月日

答辩委员会主席：评阅人：

2005 年 7 月

厦门

大学

博硕

士论

文摘

要库

厦门大学学位论文原创性声明

兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研

究成果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成

果，均在文中以明确方式标明。本人依法享有和承担由此论

文而产生的权利和责任。

声明人（签名）：

年月日

厦门大学博硕士论文摘要库

目录

目录

中文摘要....................................................1

英文摘要....................................................3

第一章文昌鱼的生物学研究概况............................6

一. 文昌鱼一般生物学特征................................6 1. 形态结构.............................................6 2. 生活习性及生活史.....................................7 3. 地理分布.............................................8 二. 文昌鱼研究概状......................................9 1. 文昌鱼的分类学研究...................................9 1.1 文昌鱼的系统分类地位................................9 1.2 文昌鱼类群内的分类..................................9 1.3 中国海域文昌鱼分类研究概况..........................11 2. 文昌鱼生态学研究.....................................13 3. 文昌鱼的生理生化研究.................................14 4. 文昌鱼的遗传学和系统发育研究.........................14 三. 资源意义............................................16

参考文献...............................................17

第二章厦门海域文昌鱼的分类研究 ........................25

一. 白氏文昌鱼(B. belcheri)分类研究概况....................25

二. 材料和方法..........................................26 1. 样品采集和预处理.....................................26

2. 形态观察和计数测量特征统计...........................27 3. DNA 提取、12S rRNA 基因 PCR 扩增和测序...............28 4. 序列分析.............................................29 5. 多重 PCR 鉴定........................................30 三. 结果................................................30


目录

1. 形态观察.............................................30 2. 计数特征和计量特征的统计分析.........................32 3. 12S rRNA 基因序列分析.................................35 4. 多重 PCR 鉴定........................................38 四. 讨论................................................39

1. 欧厝和黄厝文昌鱼的差异...............................39

2. 厦门海域文昌鱼的分类地位重估.........................39

3. 白氏文昌鱼青岛亚种(B. belcheri tsingtauense)的分类地位重估.40 4. 多重 PCR 方法用于文昌鱼的物种鉴定.....................40

参考文献................................................41

第三章白氏文昌鱼的线粒体基因组研究.....................46

一. 材料和方法..........................................47

1. 样品采集和总基因组 DNA 提取..........................47

2. 全长 mtDNA 的 PCR 扩增及引物步移法测序...............47 1.3 序列拼接、注释和 RNA 结构分析.......................51

二. 结果................................................51

三. 讨论................................................55

参考文献................................................56

第四章文昌鱼的线粒体基因组比较及其系统发生关系探讨..59

一. 材料和方法..........................................59

1. 线粒体 DNA 序列数据..................................59

2. 原始数据处理.........................................59

3. 序列比对、统计分析及构建系统树.......................60

二. 结果................................................62

1. 基因组结构...........................................62

2. 基因序列比较.........................................63

2.1 基因组长度比较......................................64

2.2 非编码区............................................64

2.3 碱基组成比较........................................66

2.4 密码子使用偏好.....................................69

2.5 tRNA 基因结构比较...................................72

2.6 碱基替换分析........................................76


目录

2.7 系统树构建..........................................77

三. 讨论................................................82

1. 基因组比较分析.......................................82

1.1 基因组大小差异......................................82

1.2 非编码区............................................83 1.3 密码子使用差异......................................83 1.4 基因组结构分化......................................84 1.5 碱基替换饱和分析与系统分析..........................85

2. 系统关系探讨.........................................86

2.1 白氏文昌鱼与青岛文昌鱼的遗传分化....................86

2.2 关于太平洋文昌鱼的单系起源..........................86

2.3 关于鲁卡侧殖文昌鱼(E. lucayanum)的分类地位............87

参考文献................................................87

在读硕士期间发表论文.........................................91

致谢.........................................................92

附录 1 和附录 2................................................93


Contents

Contents

Abstract in Chinese...............................................1

Abstract in English...............................................3

Chapter 1 General overview of amphioxus biological study..............6 1. Amphioxus general biological characters.............................6 2. General overview of amphioxus study...............................9 3. Resource character..............................................16 References......................................................17 Chapter 2 Taxonomic study on amphioxus distributed in Xiamen waters..25 1. General overview of B. belcheri taxonomic study......................25 2. Materials and methods...........................................26 3. Results.......................................................30 4. Discussion....................................................39 References......................................................41 Chapter 3 B. belcheri mitochondrial genome research..................46 1. Materials and methods...........................................47 2. Results.......................................................51 3. Discussion....................................................55 References......................................................56 Chapter 4 Comparative analysis of mitochondrial genomes of amphioxus

and phylogeny deduce..................................59 1. Materials and methods...........................................59 2. Results.......................................................62 3. Discussion....................................................82 References......................................................87

Publications....................................................91

Acknowledgements..............................................92

Appendix......................................................93


摘要

- 1 -

摘要

文昌鱼隶属脊索动物门(chordata)中的头索动物亚门(cephalochordate)，

化石记录显示有 5 亿多年的历史，被认为是与脊椎动物的始祖形态最为接近

的现存无脊椎动物，历史上文昌鱼曾几度受到动物学界的青睐或冷落。近几

十年，随着分子生物学技术的发展，文昌鱼作为模式生物，在理解脊椎动物

起源和进化研究中重新占据重要地位。然而，目前对文昌鱼的研究主要集中

在高阶元演化方面，如文昌鱼与其它门类动物的系统学关系等，而对头索动

物亚门内物种间的系统发生关系以及文昌鱼类群的分类学研究不多。

厦门是我国最早发现文昌鱼的地方，也是全世界文昌鱼资源最丰富的

地区之一。我们用线粒体 Cyt b 基因和 12S rRNA 基因为分子标记，结合传

统的形态特征统计分析及形态观察，首次证实：1. 厦门海域分布有两种文昌

鱼，一种为白氏文昌鱼(B. belcheri)，另一种为白氏文昌鱼青岛亚种(B. belcheri

tsingtauense)，鉴于厦门海域这两种文昌鱼遗传和形态上的明显差异，建议将

原先的白氏文昌鱼青岛亚种提升为种，即 B. tsingtauense。2. 在厦门海域首

次发现有青岛文昌鱼(B. tsingtauense)的分布。3. 用本研究设计的物种特异性

引物进行多重 PCR，可准确地鉴定目前我国已知的 2 种鳃口文昌鱼属动物。

本实验以总基因组 DNA 为模板，利用 4 个 LA-PCR 扩增获得白氏文昌

鱼(B. belcheri)的全长 mtDNA。用引物步移的方法(primer walking)完成白氏文

昌鱼(B. belcheri)的全长 mtDNA 测定。白氏文昌鱼(B. belcheri) mtDNA 全长

为 15182 bp，是目前 6 种文昌鱼 mtDNAs 中最长的，长的基因组体现在基因

组中的多个编码区，尤其是非编码区。基因组结构与脊椎动物的典型结构相

比，只有 4 个 tRNA 基因及最大非编码区的位置重排。白氏文昌鱼(B. belcheri)

mtDNA 全序列已提交 GenBank，登录号：AY932825。

本研究结合我们测定的白氏文昌鱼(B. belcheri) mtDNA 全序列，及


摘要

- 2 -

GenBank 上已公布的另外 3 种鳃口文昌鱼属动物(即 B. lanceolatum，B.

floridae 和 B. tsingtauense) 及 2 种侧殖文昌鱼属物种 (Epigonichthys

maldivensis，E. lucayanus)，进行基因组水平比较，及探讨文昌鱼类群的系统

发生关系。基因组水平比较及系统发生分析显示：1. 虽然 Spruyt 和 Boore

等的先前研究认为文昌鱼的非编码区很短（最大非编码区在 43 bp-185 bp 之

间），似乎没有控制区的功能，但是我们的比较分析显示文昌鱼的最大非编

码区中有类似 CSB1 和 CSB3 保守序列，且能与其邻近序列形成茎环结构

(stem-and-loop structure)，暗示文昌鱼的最大非编码区可能有部分控制区的功

能。2. 白氏文昌鱼(B. belcheri)和青岛文昌鱼(B. tsingtauense)间，虽然在

mtDNA 序列水平已有明显的分化，但是这 2 种文昌鱼在基因组结构上完全

一致，碱基组成，密码子使用偏好等方面都很接近。3. 鲁卡侧殖文昌鱼(E.

lucayanus，即原先的 Asymmetron lucayanus)基因组结构相对于其它 5 种文昌

鱼(包括同属的 E. maldivensis)发生了多处重排，而且其碱基组成、密码子使

用偏好等与其它各种文昌鱼也都有明显差异，序列分析显示侧殖文昌鱼属(即

原先的 A. lucayanus 和 E. maldivensis)为并系群(paraphyly)。线粒体基因组水

平证据支持 Nishikawa 等提出的恢复偏文昌鱼属(Asymmetron)的观点。4. 16S

rRNA 和 COI 基因部分序列分析均显示厦门海域的白氏文昌鱼(B. belcheri)与

泰国的马来鳃口文昌鱼(B. malayanum)及青岛文昌鱼(B. tsingtauense)能聚成

一群，但欧洲文昌鱼(B. lanceolatum)不能与佛罗里达文昌鱼(B. floridae)聚成

一群，表明对太平洋与大西洋鳃口文昌鱼属种是否为 2 个单系群

(monophyly)，尚待更多物种的序列信息分析。5. 文昌鱼物种间的遗传差异

与形态差异并非完全一致，表明目前采用的文昌鱼主要分类特征并不能很好

反映物种间的亲缘关系，对文昌鱼类群的形态演化过程还有很多有待研究。

关键词：白氏文昌鱼(B. belcheri)；分子分类；比较基因组


Abstract

- 3 -

Abstract

The amphioxus (subphylum Cephalochordata) is the closest living

invertebrate relative of the vertebrates. Fossil record indicated that the lineage of

amphioxus appeared in the earth about 5 hundred million years ago. Nearly 250

years of biological study history since its discovery, amphioxus has been favored

or ignored for several times by biological community. In the last two or three

decades, amphioxus reoccupied the important role in understanding the origin

and evolution of vertebrate due to the bloom of molecular techniques. However,

most current studies on amphioxus focused on the relationships between

Cephalochordate and Vertebrate, very few on the phylogeny and taxonomy

within the amphioxus group.

This thesis studies on the amphioxus living in Xiamen Oucuo and

Huangcuo Rare Marine Creature Conservation Areas, combining with the

methods of traditional statistical analysis of morphological characters and

mitochondrial 12S rRNA gene sequence. The results clearly indicate: 1. There are

two Branchiostoma species distributed in Xiamen waters. One is B. belcheri, the

other is the original B. belcheri tsingtauense. Based on the clear difference

between B. belcheri and B. belcheri tsingtauense in Xiamen waters, we can

reasonably suggest that B. belcheri tsingtauense should be elevated to species

level on the nomenclatorial rule, namely B. tsingtauense. 2. This is the new record

of B. tsingtauense in Xiamen waters. 3. Multi-PCR with the specific primers

designed in this study can effectively identify the 2 Branchiostoma species living

in Xiamen waters.

In this study, we obtained the complete mtDNA of B. belcheri by 4


Abstract

- 4 -

LA-PCR reactions from total-genomic DNA template. Sequencing of complete

mtDNA of B. belcheri was finished with primer-walking method. The total length

of mtDNA of B. belcheri is 15182 bp, which is the longest mtDNA among

knowen amphioxus mtDNAs. The big size of mtDNA of B. belcheri is accounted

for the elongate in many coding regions, especially the non-coding region. The

mitochondrial genome organization of B. belcheri is identical to the typical

structure of vertebrate except the rearrangements at 4 tRNA genes and the longest

non-coding region. Complete mtDNA sequence of B. belcheri has deposited to

GenBank under accession number AY932825.

We performed genome-wide comparative analysis among amphioxus group,

including 2 Epigonichthys species (E. maldivensis， E. lucayanus) and 4

Branchiostoma species (B. belcheri，B. lanceolatum，B. floridae and B.

tsingtauense). Comparative genome and phylogenic analysis suggest: 1. Although

Spruyt and Boore et al. thought that the non-coding region of amphioxus is too

short and without distinct D-loop characters, and assumed that the non-coding

region of amphioxus had no regulative function, previously. However, present

comparative analysis showed some regulative-like elements in the longest

non-coding region of amphioxus, such as CSB1 and CSB3, which implied that

the longest non-coding region of amphioxus mtDNA probably take partial

function of mt-genome regulative elements. 2. In spite of the distinct divergency

at DNA sequence level between B. belcheri and B. tsingtauense, the gene

organization is complete identical between them, and the base composition as

well as codon usage are very similar between them too. 3. The gene order of E.

lucayanus (the original Asymmetron lucayanus) is different to that of any other

amphioxus known, neither are its base composition and codon usage. Sequence


Abstract

- 5 -

analysis presents the paraphyly of genus Epigonichthys. Obviously,

mitochondrial genome-level evidence supported the proposal of recovering the

genus Asymmetron by Nishikawa et al. 4. Although, partial 16S rRNA and COI

gene sequences showed that the monophyly of Atlantic Branchiostoma species

and paraphyly of Pacific Branchiostoma species, the determined phylogenic

relationships of two oceans Branchiostoma species are still wait for more species

sequence information. 5. Disparity existing between molecular phylogeny and

morphological similarity implies that current amphioxus taxonomic characters

could not reflect the phylogenetic relationships among the amphioxus. Clearly,

there are many remains to be investigated in the process of morphological

evolution in amphioxus.

Key words: Branchiostoma belcheri; molecular taxonomy; mitochondrial

genome


第一章文昌鱼的生物学研究概况

- 6 -


文昌鱼又名海矛(Lancelet)、双尖鱼(Amphioxus)、蛞蝓鱼、扁担鱼、文

祖鱼、银枪鱼等，因终身具有脊索动物的三个主要特征，即脊索(notochord)、

背神经管(dorsal nerve cord)(中央神经索位于消化管及脊索的背面)和咽鳃裂

(gill slits)(咽喉两侧壁上有多对对称鳃裂 )，系统分类属于脊索动物门

(Chordata)的头索动物亚门(Cephalochordata)。该类群种类极少，全世界现存

仅约 29 种，相对于尾索动物亚门(约 2，500 种)和脊椎动物亚门(约 45，000

种)，是高度不分化的一群，至今已有五亿多年的历史，有“活化石”的美誉，

被认为是现存与脊椎动物祖先接近的类群，是研究脊椎动物起源与发育的

理想模式生物。

一. 文昌鱼一般生物学特征

1. 形态结构

文昌鱼个体一般小于 8 cm，身体半透明，侧扁，两端稍尖，呈纺锤形(图

1-1B)；其脊索纵贯身体全长，超出神经管，一直达身体的前端，所以被称

为头索动物(Cephalochordata)；没有明显的头部(即没有分化明显的脑和感觉

器官，所以被称为无头类(Acraniates)；无偶鳍，只有背鳍(dorsal fin)、尾鳍

(caudal fin)和臀鳍(preanal fin)，背鳍基部有一列透明小室称背鳍室，腹鳍基

部排列的透明小室称腹鳍室；身体前端有漏斗状的口笠(oral hood)，上面有

指状突起，称轮器(wheel organ)，口笠边缘有很多触须(buccal cirri)，用于保

护口部防止粗物进入口中(图 1-1A)；身体前腹部两侧有皮肤下垂形成的褶状

物，称为腹褶(metapleural fold)；身体臀鳍前方有个孔，称为围鳃腔孔(atriopore)

或腹孔(图 1-1A)，肛门(anus)位于尾鳍腹面的左侧；身体两侧有多对不对称

肌节(myotome)呈 V 字形，尖端向前(图 1-1C)。



- 7 -

图 1-1：文昌鱼解剖图[1]

Fig. 1-1 Amphioxus anatomy map A：腹面图(自 Parker and Haswell)；B：侧面图(自 Parker and Haswell)；C：部分纵剖面(Storer)。

A: Ventral view of amphioxus; B: Lateral view of amphioxus; C: Longitudinal view of amphioxus..

2. 生活习性及生活史

文昌鱼是一类海洋底栖动物，成体栖息于热带到温带间浅海海域的沙

质海底，喜黑，对光敏感。白昼时以其身体尾部钻进沙中，仅露出头部，为

滤食者，摄食方式是借助前端口须的纤毛运动带动水流，将周围底栖的小型

动、植物，特别是硅藻带入口中；夜间离开沙在水中作短距离的游泳，游动

时以体侧肌肉轮替收缩方式象鳗一般游动，有时以身体右侧侧卧于沙面上。

文昌鱼为雌雄异体，体外受精，自然界中偶有发现雌雄同体的个体[2, 3]。

产卵期不同种间差别较大，但多在水温较高的季节日落后产卵[4-9]。受精卵约

经 20 小时左右的胚胎发育，形成能自由漂浮的幼体，幼体能在水面作纤毛


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