1

运用 MALDI-TOF MS 方法建立食管癌患者血清蛋白指纹图谱诊断模型

河北医科大学第四医院 科研中心 / 河北省肿瘤研究所

刘丽华 王士杰 单保恩 孟君 艾军 田子强 张泽峰

研究背景研究背景 食管癌是最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内是

第六位肿瘤致死病因。约 50%食管癌发生在中国，绝

大多数为食管鳞状细胞癌。目前，食管癌诊断仍然依

赖于胃镜活检，患者依从性差。因此，寻找高效的分

子标志物对食管癌的诊治有重要意义。

• 随着人类基因组计划的提前完成，获得大量不同基因序列的信息，但是执行这些信息所蕴藏的各种复杂生物学功能的却是蛋白质。因此，蛋白质组学的地位被提到了前所未有的高度。

• 基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）是近年出现的一种新的蛋白质组学研究方法，可用于检测临床各种标本，如血清、尿液、脑脊液等。而且，MALDI更特异性关注分子量 1000-10000的小分子多肽的特点更优于传统的技术。

• 本研究利用MALDI-TOF MS技术平台，对食管癌患者及正常对照者血清进行检测，并建立食管癌蛋白质谱诊断模型，探讨其在食管癌诊断中的应用。

材料与方法材料与方法研究对象 71 例食管癌患者血清标本全部来自河北医科

大 学 第 四 医 院 胸 外 科 ， 62 例 经 病 理 诊 断 为 食 管 鳞癌， 9 例腺癌，根据 AJCC/UICC 食管癌 TNM 分期标准进行分期，正常对照者 38 例，为健康体检患者，两组间年龄性别比较无显著性差异（ P>0.05 ）。

stage I stage II stage III stage IV Total

ESCC 7 15 32 8 62

EA 1 3 5 0 9

Tatol 8 18 37 8 71

方法 应用磁珠分选的方法进行血清蛋白标本分离富集，采用德国 Bruker Daltonics 公司的 AutoflexШ 型质谱仪进行数据采集，并用 ZUCI- 蛋白芯片数据分析系统进行高通量数据处理，运用遗传算法结合支持向量机运算建立诊断模型并验证。

Cluster analysis

Disease

Normal

Cluster analysis

Disease

Normal

结果• 实验质控结果 采用标准血清进行外标校正，校正平均分子量偏差小于 100ppm，数据变异系数为 18%。（下图为标准品图谱）。

* pep and pro mi x_autofl ex2_080710_1\ 1_G3\ 1\ 1SLi n, Smoothed, "Basel i ne subt. "

0

1

2

3

4

4x10

Inten

s. [a.

u.]

1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000m/z

Figure 1 Peptide and protein standards by MALDI-TOF MS.

Substance Average mass(M+H) Resolution StDeV

AngiotensinⅠ 1297.48 365 10

AngiotensinⅡ 1047.18 360 10

Substance P 1348.64 380 17

Bombesin 1620.86 420 23

ACTH clip 1-17 2094.42 475 22

ACTH clip 18-39 2466.68 540 17

Somatostain 28 3149.57 580 25

Ubiquitin 4283.45 800 40

Insulin 5734.56 580 25

Cytochrome c 6181.05 560 85

Ubiquitin 8565.89 345 25

• 血清蛋白质荷比峰的筛选 在相对分子质量 1000 ～10000 范围内，共检测到 138 个蛋白质荷比峰。统计学处理后食管癌组与健康对照组间 P 值小于 0.05 的峰有 79 个，小于 0.01 的峰有 71 个。 P值越小，说明在两组中差异越显著，单个峰分组能力越强。选择这些峰随机组合后应用支持向量机法进行运算，建立诊断模型。

1895. 980

3238. 557

2658. 394

4206. 521

4640. 484

0

2

4

6

8

4x10

Intens. [a.u.]

1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000m/ z

• 模型 1 区分食管鳞癌组和健康对照组的差异模型 •（由下表 11 个质荷比峰组成）

Mass/Charge (Da)

Intensity in ESCCIntensity in health

controlP

2 087 107.92 ± 49.69 2777.98 ± 1068.70 0.000000

2 210 325.26 ± 235.91 11724.23 ± 2600.55 0.000007

3 258 1589.21 ±502.07 6254.80 ± 1524.00 0.000002

3 973 96.59 ± 63.80 2278.15 ± 828.17 0.0087

4 283 123.86 ± 88.19 2585.24 ± 1284.28 0.00132

4 645 8437.77 ±710.44 2343.56 ± 943.61 0.000037

4 092 7225.07 ±451.40 1833.69 ± 567.12 0.006

4 210 25999.73±2034.50 4279.75 ± 585.67 0.00005

1 985 215.62 ± 63.53 447.80 ± 55.69 0.000239

2 818 293.24 ± 37.73 538.93 ± 61.07 0.030346

2 046 477.35 ± 98.54 10373.94 ± 1358.90 0.046807

Figure 2. Representative spectra and gel views of the selected biomarkers. The serum marker 2210 Da from esophageal squamous cell carcinoma (ESCC 1-3) vs. healthy individuals (C 1-3).

例举 2210 Da 蛋白峰在食管鳞癌组表达

• 模型 2 区分食管鳞癌的不同病理阶段（ stage I-II vs. III-IV ）：由以下 8个峰组成 m/z of 4195, 4074, 4268, 2106, 4905, 5965, 2863 and 3953 Da。下图例举 4195 Da蛋白峰的表达情况。

Figure 3. Representative spectra and gel views of the selected biomarkers.The serum marker 4195 Da from stage I-II esophageal squamous cell carcinoma (I-II 1-3) vs. stage III-IV esophageal squamous cell carcinoma (III-IV 1-3).

• 模型 3 区分食管癌的不同病理类型（ ESCC vs. EA ）：由以下 7 个峰组成 m/z of 4055 2960, 2953, 5388, 2670, 5906 and 4077 Da。下图例举4055 Da蛋白峰的表达。

Figure 4. Representative spectra and gel views of the selected biomarkers. The serum marker 4 055Da from esophageal squamous cell carcinoma (ESCC 1-3) vs. esophageal adenocarcinoma (EA 1-3).

Table 3 The predicted results of patterns distinguishing ESCC from health control (Pattern 1), different pathological types of ESCC (Pattern 2) and ESCC from EA (Pattern 3).

• 模型验证 所有的样本随机划分， 2/3 样本作为训练组， 1/3 样本作为盲法测试组，并将训练组样本再随机分出 1/3 进行交叉验证，经软件包运算后计算每个样本的平均预测值，并计算出灵敏度和特异度如下表。

Number

of protein

peaks

Training set Test set

Sensitivity

(%)

Specificity

(%)Sensitivity (%) Specificity (%)

Pattern 1 11 90.0% 84.0% 88.0% 80.0%

Pattern 2 8 92.9% 92.3% 87.5% 85.7%

Pattern 3 7 91.3% 80.0% 81.8% 75.0%

食管癌作为消化系统常见的恶性肿瘤，治疗平均 5年生存率一直徘徊在 30% 左右，而早期食管癌患者及癌前病变患者经胃镜下行粘膜内切除术， 5年生存率达 95% 以上。

因此，寻找敏感度好、特异度高的食管癌肿瘤标志物应用于早期诊断，对提高患者生存率有重要意义。

讨论讨论

MALDI-TOF-MS 是当今最先进的蛋白组学技术之一，以这一技术开发的系列液体蛋白质芯片可以非特异性结合被测样本中的各种蛋白质，去除高丰度蛋白，而且其结合面积远大于以往的固体蛋白芯片，克服了传统二维凝胶电泳难以解决的诸多问题，为临床筛查肿瘤标志物提供了理想的平台，在发现疾病相关蛋白和后续蛋白鉴定方面具有光明的前景。

本研究运用 MALDI-TOF MS 技术检测食管癌组和健康组的血清蛋白表达图谱，经过数据分析后我们选择11 个蛋白峰建立诊断模型，其中 4 个高表达于食管鳞癌组， 7 个低表达。同样，我们建立了高灵敏度和特异度的不同病理分期和病理类型的差异模型。此种联合检测模式，在提高敏感度的同时，保证了较高的特异度。

应用蛋白质组学后的一个问题是大量数据的收集和处理，本研究选用蛋白芯片数据分析系统进行高通量数据处理，经过大量计算机运算和统计学分析，筛选出最优肿瘤标志物组合，确保了诊断模型的准确性和严谨性，优于以往建模方案。

总之，本研究应用 MALDI-TOF MS 方法能够检测食管癌患者血清蛋白指纹图谱并建立高灵敏度和特异度的诊断模型。在以后的研究中将进一步扩大样本量，如果能够鉴定并验证特异性的食管癌血清学标志物将对未来的研究具有深刻意义，对于食管癌高发现场的工作具有巨大推动作用。