مقدمه•دستگاه • معرفیپروب • MLPAمعرفیMLPAتکنیک •توسط • ای نقطه های جهش MLPAبررسی

پروتکل • MLPAتوضیح

توسط • متیلسیون MLPAبررسیهای • MLPAمزیتMLPAمعایب •کیت • MLPAمعرفی

MLPAمحصولت •

ینده • آ های MLPAبرنامه

Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MLPA)

سال • در بار همکارانش Schoten.JPتوسط 2002اولین وشد . داده شرح

های • یابی 40توالی توالی روش این توسط نوکلئوتیدی اسیدشوند می

از • از 150بیش استفاده با مختلف موضوعات در مقالهMLPA است شده منتشر

از • بیش در یا دن در معمول شکل این 00به از آزمایشگاه دمیشود استفاده تکنیک

MLPAدستگاه

• 1 : Thermocycler

• 2 : Sequence type electrophoresis

Probs

MLPA technique

• Denaturation

• Hybridization

• Ligation

• Amplification

Hybridysation

میکس- 1• شده DNAبه MLPAپروب دناتوره ژنومیشود می اضافه

مجاور- 2• هدف توالی به پروب هر از بخش دومیشوند بریداز هی

Ligation

متصل • بهم حرارت به مقاوم لیگاز توسط ها پروبمیشوند

Hybridization and Ligation

Amplification

برای • جهانی پرایمر جفت یک همه Amplifyاز کردنهای شود .Ligatedپروب می استفاده شده

منحصر Amplificationمحصول • طول پروب هردارد بفردی

)bp 480الی 130( •

Separation and quantification by capillary electrophoresis

محصول قله هریک Probeتکثیر

است خاص

اوج ارتفاع در تفاوتاوج منطقه یا و نسبیدر تغییر دهنده نشان

توالی از کپی تعداداست هدف

Detection of Chr X copy number

Homozygous deletion

Heterozygotes deletion

Many variables have only a small influence on MLPA results

DNA Amount of DNA used has little influence on MLPA results

Detection of point mutations

کامل • که زمانی ها متصل پروب بهم شدند همسانمیشوند.

و • مشترک های جهش برای ها بکار SNP`sپروب هامیروند.

خواهد • وجود سیگنال باشد داده رخ جهشی که زمانی.داشت

MLPA discriminates sequences that differ in only a single nucleotide & can be used to detect known point mutations

MLPA protocol

DNA DENATURATION-1دمای ng DNA 500-20حرارت دقیقه 5بمدت oC 98 در

HYBRIDIZATION-2پروب بافر MLPAافزودن MLPAو

بمدت کردن دمای 1انکوبه در دمای oC 95 دقیقه در بریداسون هی 60 وoC ساعت 16بمدت

LIGATION-3لیگاز دمای 65افزودن در کردن انکوبه و بافر لیگاز 15بمدت oC 54 و

دقیقهدمای تا دادن بمدت oC 98 حرارت لیگاز آنزیم کردن فعال غیر دقیقه 5برای

• 4- PCR• Primers

شروع dNTPs افزودن وPCR

Polymerase

•5-CAPILLARY ELECTROPHORESIS

قله • اوج و طول صدورالکتروفورز • محصولت الیز ن آ

Methylation detection

Epigeneticsئوتیدهای • نوکل متیلسیون به توجه با ژن رونویسی CPGتنظیم

پروموتور در واقع

Imprintingمحافظت صورت به آنها متیلسیون الگوهای که ژنوم از مناطقی

است رسیده ارث به مادر و پدر از شده

Methylation specific MLPA (MS MLPA)

Methylation changes in imprinted regions

Advantages of MLPA

ا: ( 1• ت هدف توالی چندین ) 45بررسی طور به توالیواکنش یک در همزمان

و: 2• شدن متیله ، ای نقطه های جهش بررسی امکانلیز ا ن آ یک در نسخه تعداد

اندک: 3• مقدار به )DNA (20-100 ngنیازکامل : 4• سلول به یاز ن عدمپرایمر: 5• جفت یک تنها از استفادهقابلیت: 6• با آسان و قوی ، ارزان ا ت نسب ، کمی روش

طبی تشخیص آزمایشگاههای برای مناسب خودکاریها: 7• حذف ریز تشخیص به قادر

Disadvantages of MLPA

ها: 1 پروب تهیه بالی های هزینه و بودن پیچیده ، گیر وقت

روش: ( 2 برخلف انفرادی شکل به را ها سلول بررسی نایی توا )FISHعدم

و: 3 سالم های سلول با تومور نمونه آلودگی دلیل به درست تشخیص عدمژنتیکی ناهنجاری دارای های سلول کم درصد نیز

تومورها: 4 مطالعه هنگام در ویژه به مناسب مرجع های نمونه کمبود

های: 5 پروب طراحی ضرورت و ها واژگونی و ها جابجایی تشخیص عدممنظور این برای ویژه

لوئیدی: 6 پ تری از لوئیدی پ دی تمایز عدم

طراحی: 7 آنها برای پروب که مکانهایی در ژنومی تغییرات شناسایی عدماست نشده

به: 8 از ی آن DNAن مانند و فنل ، نمک آلودگی فاقد و مناسب کیفیت با

نها: 9 ت یرات تغی این که زمانی ویژه به شده شناخته های جهش ایید ت به از ی نپشت ژنومی های مکان به مربوط های پروب در یا و شده شامل را پروب یک

ندهند رخ هم سر

MLPA kits

حداقل • برای هرکدام که میکس پروب سه با مخلوط 20یکاست استفاده مورد واکنش

برای • ها کیت از هستند MS-MLPAو MLPAبرخی یکسان

•RNA MLPA Kits خاصیهستند معرف افزودن مستلزم

کیت Hhalآنزیم • نمیباشد ME-MLPAشامل

های • کیت های میباشند MLPAآنزیم پایدار ار بسی

MLPA products

های • کروموزوم یوپلوئیدی ن آ , بررسی ,13 18 21,X,Yدوتاشدگی • و کروموزومی بزرگ های حذف تشخیص

ها آتروفی : یامز، ویل ، جرج دی سندرم مثال

نخاعی ساب ، SMAعضلنی مناطقغیره و تلومریک

سرطانی • بافت در ژن کاهش یا افزایش بررسیاگزونی • ا ی و ژنی تک های دوتاشدگی یا حذف بررسیهای • اگزون تمام از نامبر CFTRکپیتمام • از نامبر واکنش DMDاگزون 79کپی دو در

MLPAهای • MS-MLPAکیت

Future applications MLPA

روش • حساسیت MLPAافزایش

•SC MLPA

بدست جنینی تک های سلول از تریزومی تشخیصمادر پلسمای از آمده

تومورها • تشخیص برای میکس پروب تهیه

جزایر • در نابجا متیلسیون تشخیص برای میکس پروب تهیهCPG

پیمان دکتر آقای از تشکر باهای حمایت جهت زاده قریشی

نار سمی این اجرای در لزم