Βασίλης Γ. ΓοργούληςΕργαστήριο Ιστολογίας - Εμβρυολογίας

Ιατρικής Σχολής ΕΚΠΑ

Εργαστήριο Ιστολογίας – Εμβρυολογίας

Νεότερα δεδομένα στη μοριακή βιολογία του

καρκίνου του παγκρέατος

Η καρκινογένεση είναι μια πολυσταδιακή διαδικασία

Precancerous lesions

Grades of aggressive behavior

tel, KRAS del 9p21 (p16INK4) 17p13 (p53), SMAD4

Phenotype

π.χ. καρκίνος παγρέατος

Patterns of molecular defects

refl

ects

IDEA

Anti-tumor barriers: Reacting force Acting force: Oncogenes

… πως αντιδρούν τα κύτταρα σε ογκογόνα ερεθίσματα;

Anti-tumor barriers: Reacting force Acting force: Oncogenes

Αρχικά είχε αναγνωριστεί μόνο το ARF …

INK4A/ARF locus (9p21)

Καθώς η Γενωμική Αστάθεια αναγνωρίστηκε ως βασικό

χαρακτηριστικό του καρκίνου …

Nat Rev Mol Cell Biol 2010

IDEA

… θα μπορούσε το DDR να έχει παρόμοιο ρόλο;

Anti-tumor barriers: Reacting force: DDR Acting force: Oncogenes

Το δίκτυο DDR και επιδιόρθωσης (repair) (DDRR)

Pharmacol Ther 2015

Preservation of the Genome integrity ?

Exogenous factorsIR, UV, chemical agents, toxins

Endogenous factorsCellular metabolism (i.e. RONS), replication stress

DNA damage

Single-stranded DNA (ssDNA) Double-strand breaks (DSBs) Mismatched bases Damaged bases Intrastrand crosslinksInterstrand crosslinks (ICL)

CSA

RPA

DNA Damage Response (DDR)

PARP1

DNA-PKcs

upstream effectors

Slowing down / arrest of cell cycle progression

G1 S MG2

mediators

sensors

transducers

“proteins that recognize DNA lesions” MRN

ATM

“proteins that fine tune the DDR regulating both

transducers and effectors”

ATR-ATRIP

ChK2

ChK1

RPA Ku70/Ku80 DNA glycosylaseH3-K36me3

FAAP24/FANCM/MHF

ATR-ATRIP

ChK1

P

Replication-dependent Replication-independent

TopBP1/BACH1

activation

RAD17-RFC/9-1-1 complex

P

PP

Claspin

BRCA1

recruitment andactivation

“transcription factors, cell cycle regulators, apoptotic machinery, DNA repair factors”

P

PH2AX

MDC1

+

BRCA153BP1

P

CtIP

DSB

-en

dre

sect

ion

ssDNA

RPA

ATR-ATRIP

P

ChK1

“kinases that spread the damage signal

throughout the nucleus”

activation

P MRN

ATM

Rad51

downstream effectors

P

BRCA2+p53

P

+

“apical kinases”

p21waf1/Cip1

XPC-HR23B CSB

TFIIH/XPG

XPA

P

FANCE

ssDNA exposure

P

P

P

CDC25A CDC25C

BRCA1ub

P

P

P

CDK2 CDK1

+

P

CDC25B

PPCNA

CDC45

MDM2

P

PP

activation

ub

TopBP1/BACH1

+

MSH2/6MSH2/3

RPA

loading

APE1

(PARP, PNK)P

P

NHEJ

BRCA2/FANCD1 +FANCN/PALB2

SLX4,FAN1

XPF/ERCC1MUS81/EME1

(unhooking of ICL)

HR

DNA Repair

Stabilization and restart of replication fork

HR MMR BERTLS

in leading strand Non-effective

DNA repair

DNA Pol β

+MLH1/PMS2

P

FANCD2/FANCI

MRN

CtIP

DSB-end resection

FANCL

ub

TLS polymerases(Pol ζ, Rev1 )

recruitment

alt-EJ

Artemis

Ligase IV-XRCC4-XLF

SSA

P

PNK, APLF+

Ligase III-XRCC1

exonuclease 1, FEN1

DNA Pol δ/ε

GG-NER TC- NER

XPG, XPF/ERCC1

dNTP synthesis

+

Ligase III-XRCC1

3’ single strand overhang in lagging strand

RAD51

NER

NER

• apoptosis• senescence• other ways of cell death

Genome instability

Carcinogenesis

Rad52+

XPF/ERCC1

CtIP

PNK, FEN1,ERCC1/XPF

DNA Pol λ

TLS

TLS

NER

NER

TS

2005 2006

2007 2008

Με βάση τα ευρήματα των άρθρων

διαμορφώσαμε το ακόλουθο μοντέλο

καρκινογένεσης …

0

20

40

60

80

100

% i

ncr

ease

d d

ensi

ty i

n C

FS

s

com

pa

red

to

no

n-C

FS

are

as

Genes in (KEGG)

cancer pathways miRNAsCTCF binding

sites

Cell Mol Life Sci. 2014Cell 2016

ARF MDM2

Τα ογκογονίδια ενεργοποιούν ARF και DDR. Συμβαίνει αυτό όμως

ταυτόχρονα ή σε διαφορετικά στάδια της καρκινογένεσης;

Science 2008, Cell Death Diff 2013

Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Normal Hyperplasia

γΗ2ΑΧ

p1

4A

RF

p1

6IN

K4

Ap

21

WA

F1

p5

3

Dysplasia Tumour

Ch

k2-p

T6

8

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Normal Hyperplasia Dysplasia Tumor

γ-H2AX

p14ARF

p16INK4a

p53

p21WAF1

% i

mm

un

op

osi

tive

ce

lls

Normal Hyperplasia Dysplasia Tumour

γH2AX

p14ARF

p16INK4A

p53

p21WAF1

0

10

20

30

40

50

60

70

Normal LG Dysplasia HG Dysplasia

p-ATM

P19ARF

P16INK4A

P53

P21WAF1

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45p16INK4A

p14ARF

Re

lati

ve

(ave

rage

) m

RN

A le

ve

ls

Normal Hyperplasia TumourDysplasiaLOH

8/13 (61,5%)

Heterozygosity

5/13 (38,5%)

p1

6IN

K4

A

Normal Dysplasia

LO

H a

na

lysi

s D9S171

Lo

cu

s

ii.

Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Tumour

Η ενεργοποίηση του DDR προηγείται του ARF κατά την καρκινογένεση στον άνθρωπο

Conclusion: Late ARF induction reflects primarily a transcription-based mechanism that requires escalating oncogenic load

for efficient activation, compared to the lower activation threshold for DDR

Cell Death Differ 2013

Μήπως το ARF είναι ένας δεύτερης γραμμής φραγμός που ενεργοποιείται όταν

δυσλειτουργεί το DDR;

ARF

Early Late

An

titu

mo

ur

Ba

rrie

rs

DDR

Time-line

ATM

P

P

PP1I-2

PP1I-2

Pactive

inactive

Σύνοψη: ATM-PP1-NEK2-NPM-ARF pathway - ATM activation

NPM-P

NEK2

-P+P

NPM ARF

ULF

P

P

PP1I-2

PP1I-2

Pactive

inactive

NPM-P

NEK2

-P+P

ATM

ULF

NPM ARF

NPM

P P

ARF

ATM-PP1-NEK2-NPM-ARF pathway – ATM inhibition

TumourGrowth

Nat Cell Biol 2013

Δυνητικές θεραπευτικές εφαρμογές

ATM PP1

ARF

I - 2

ULF

Nek2

ARF

p - NPM

ppp -NPM

Tumour growth

NPM

+p

-p

C

S70 S88

In p53-mutant tumors, targeting of ATM could trigger p53-independent and ARF-

dependent tumour suppressor activity as a second barrier to tumour development

DDRARF

hyperplasiadysplasia

in situ cancer

invasive cancer

Nat Cell Biol 2013

ATM p14ARFp-ATM p16INK4A Ki67Cyclin E

No

rma

l AT

ML

ow

AT

M

mt p

53

Hu

ma

n L

un

g C

arc

ino

ma

s

Lenti-ctl

shARF

ATM

p14ARF

actin

Av

era

ge

tum

ou

r m

ass

H1299 xenografts

80,00

60,00

40,00

20,00

0,00

ATM absent/ High p14

expression

ATM present

p53 negative/mutant cases

Cy

clin

E E

xp

ress

ion

p < 0,05

60

40

20

0

ATM absent/ High p14ARF

expression

ATM present

p53 negative/mutant cases

Ki6

7 e

xp

ress

ion

p< 0,05

H1299-ctl-shRNA

Lenti non-target shRNA

H1299-ctl-shRNA

Lenti-shATM

H1299-shARF

Lenti-shATM

H1299-ctl-shRNA

Lenti non-target shRNA

Ctl-shRNA

Lenti-shATMLenti-ctl

shARFCtl-shRNA

Lenti-shATM

Η αναστολή του ATM οδηγεί σε μείωση της αύξησης του όγκου σε p53-

null (χωρίς έκφραση της p53) ξενομοσχεύματα ανεπτυγμένα σε ποντίκια

Nat Cell Biol 2013

Science 2008, Nat Cell Biol 2013

ARF MDM2

Το ATM ελέγχει το μονοπάτι του ARF

2013

pRb E2Fs p-pRb E2Fs

E2Fs

Mitogenic/oncogenic signals

Replication licensing machinery

Re-replication

Υπόθεση εργασίας: Αν το στρες αντιγραφής (replication stress) συμβάλλει στην καρκινογένεση

τότε θα πρέπει να υπάρχει αποδιοργάνωση του μηχανισμού αδειοδότησης της αντιγραφής

του DNA …

Sem Can Biol 2016

Στα περισσότερα φυσιολογικά κύτταρα η

αντιγραφή του γενετικού υλικού γίνεται μια

φορά ανά κυτταρικό κύκλο

DNA Replication Licensing machinery is:

1. responsible for the uniqueness of this process,

2. and thus, vital for normal cellular proliferation

Replication Licensing takes place….

Liu et al., Molecular Cell, 2000, 6:637-648

Pyrobaculum aerophilum

hCdt1T29

N C

16q24.3

T67

S45

S54S74

S106 S419

N C

WH-domainCdt1 interaction domain

hCdc617q21.3

ATPase Superfamily AAA+(ATPases associated with various cellular activities)

Mus Musculus

Lee et al., Nature, 2004, 430:913-917

geminin

Cdt1

G1 S/G2/M G1 S/G2/M G1 S/G2/M G1 S/G2/M

G1 S/G2/M G1 S/G2/M G1 S/G2/M G1 S/G2/M

Cell cycle

Cell cycle

1 2 3

RL

Fs’

lev

els

CD

K/D

DK

act

ivit

y

Normal cell

Οι μηχανισμοί ελέγχου της αντιγραφής υπέρ-εκφράζονται στον καρκίνο, επάγουν την γενωμική αστάθεια και προάγουν την καρκινογένεση

Tum

or

form

atio

nL

oss

of

p5

3

RLFs ↑↑ Replication stress DNA breaks

0

1

2

3

4

5

6

Mock Cdc6

Ta

l Mo

men

t

*

Ran

dom

chro

moso

me

aber

rati

on

s

Anti

tum

or

Bar

rier

s

Bypass

Random aberrations Clonal aberrations

and tumor formation

Genomic instability

A549-Mock A549-Cdc6TP53 D17S179E

0

5

10

15

20

25

30

35

40

% o

f ca

ses

Cdc6 ↑

Cdt1 ↑

Normal

Cdt1 ↑Cdc6 ↑

Am J Pathol. 2004, Nature 2006, Cancer Res. 2007, Oncogene 2008,

JCB 2011, Transcription 2012, Sem Cancer Biol 2016

hC

dc6

hC

dt1

Hea

d &

Nec

k

Normal Hyperplasia Dysplasia Tumor

hC

dc6

hC

dt1

Colo

n

NormalGrade I

Adenoma

Grade III

Adenoma Tumor

Προς μεγάλη μας έκπληξη επίσης

παρατηρήσαμε ...

Η υπερ-έκφραση του Cdcd ή Cdt1 προάγει την επιθηλιακή προς

μεσεγχυματική μετατροπή (ΕΜΤ) και την εξαλλαγή

Cancer Res. 2007

P1-pBabe-hCdc6 P1-pBIB-hCdt1

P1-pBabe P1 (parental) P1-pBIB P1-hCdc6P1-pBabe

DA

PI

Pan

-ker

atin

Vim

enti

nM

erge

E-Cad

Loss of E-cadherin: hallmark of EMT

Επιθηλιο-μεσεγχυματική μετατροπή (EMT)

Pathological EMTPhysiological EMT

Hallmark : Loss of membranous E-cadherin

Με αφορμή την αναφορά βρήκαμε επίσης ότι...

The RD element and the CDH1 promoter

demonstrate conservation of the CANNTG consensus

Status:

E-Cad

Actin

Cdc6

Days: 0 3 +3

OFF ON OFF

A549-TetON-Cdc6

E-Cad

Actin

Cdc6

siCdc6ctrsi

A549-Cdc6

A5

49

cd

c6

ctr

sisi

Cd

c6

DAPI/E-Cadherin Cdc6

active

non-active

CDH1 locus

INK4/ARF locusCdc6

Actin

Snail

E-Cad

Twist

Zeb 1

Cdc6 Cdc6Mock Cdc6Mock Mock

MCF-7 A549 P1Traditional

CDH1 repressors

Snail-1 Snail-2

ZEB-1 ZEB-2

TWIST

JCB 2011, Transcription 2012

…independent from…

The phenomenon is reversible and …

Με ενδιαφέρον παρατηρήσαμε ότι ...

Το Cdc6 εκφράζεται κατά την εμβρυική ανάπτυξη του παγκρέατος

9.5 dpc8.5 dpc

Cd

c6 I

HC

A B

1

2

3

4

5

6

7

8

9

P7

normal

P7

KRAS

P30

normal

P30

KRAS

Rel

ati

ve

exp

ress

ion

to 1

8S

RN

A Cdc6b

Cdc6a

Cdc6b

exons

UTR

Στο ενδόδερμα φυσιολογικών ποντικών Στο πάγκρεας KRASG12D knock-in

ποντικών

KRASG12D

Cdc6?

Cell membrane

Nucleus

?

KRAS

Cdc6?

Cell membrane

Nucleus

?

KRAS KRASG12D

Ένδειξη 1η

KRAS KRASG12D

Το Cdc6 εκφράζεται στον καρκίνο του παγκρέατος

0

2,5

5

7,5

10

HPDE: normal human pancreatic duct epithelium

beta-TC: insulinoma pancreatic beta cells (mouse)

alpha-TC: adenoma pancreatic alpha cells (mouse)

Panc1: pancreatic carcinoma cells [mut p53 (hom R273H), low c-erbB-2 expression]

Capan1: pancreatic carcinoma cells [mut KRAS(12Val), CDKN2A -/-, mut p53 (195

Val)]

MIA-PaCa-2: pancreatic carcinoma cells [mut p53 (hom R248W)]

HepG2: hepatocellular carcinoma cells

Ductal adenocarcinomaPancreatic intraepithelial lesionsNormal ductal

epithelium

Human pancreas

B

A

Cdc6

actin

C

i. ii.

normal PanIN

1/2

PanIN

3PDAC

Fo

ld o

f C

dc6

mR

NA

in

crea

se

iii.

0

2

4

6

Rela

tiv

e D

NA

co

pie

s o

f C

dc6

N T N T

Case # 9 Case # 17 Case # 3

Cdc6

actin

N NT T

Case # 7 Case # 12

Η υπερέκφραση του Cdc6 είναι πρώιμο γεγονός στην

διαδικασία της καρκινογένεσης στο πάγκρεας

Cdc6

KRAS

Ένδειξη 2η

RAS

Cdc6?

Cell membrane

Nucleus

?

Η κυτταρική γήρανση είναι σημαντικός αντικαρκινικός φραγμός από τα πρώμια

στάδια (PanINs) της καρκινογένεσης στο πάγκρεας

Aging 2013, Aging Cell 2017

Tet-ON (Senescence)Tet-OFF

Human Bronchial Epithelial Cells (HBECs) Cdc6 Tet-ON

a.

c.

Detection process of senescent cells

Synthetic procedure for SBB analogues

i.

ii.

b.Biotin structure

Th

iop

hen

e rin

gU

reid

o rin

g

Valeric acid

Steps:

1) Chemical synthesis

2) Biotin conjugation

3) Histochemical staining, confirming binding to Lipofuscin

4) Successive chromogenic reaction: : 3,3'-Diaminobenzidine (DAB)

Reagents and conditions: a) hydroxyacetone (7), EtOH, 75 ˚C, 3 hrs; b) i) NaNO2, H2O, HCl(c.), 0 ˚C, 2h, ii) 1-naphthylamine, H2O,

EtOH, HCl(c.), 0 ˚C, 2h, then r.t. for 16 h; c) i) NaNO2, DMF, H2O, HCl(c.), 0 ˚C, 2h, ii) 8, EtOH, 0 ˚C, 30 min, then r.t for 90 min;

d) D-biotin, DCC, DMAP, CH2Cl2(dry), r.t., 5 days.

Senescent cell

Nucleus

Lipofuscin

Biotin

1. Biotin Nucleus

Lipofuscin

BiotinDetection

system

Senescent cell

4. 3. 2. Synthesis

Compound

Marking

Senescence

Compound

Marking

Senescence

Compound

Marking

Senescence

Compound

Marking

Senescence

Compound GL13

Human diploid lung fibroblasts (DLFs)

Irradiated (Senescence)Non irradiated

Tet-ON (Senescence)Tet-OFF

Saos2 p53Tet-ON

4-OH-Tamoxifen + (Senescence)4-OH-Tamoxifen -

U2OS E2F1-ER

Tet-ON (Senescence)Tet-OFF

Human Bronchial Epithelial Cells (HBECs) Cdc6 Tet-ONa.

AdenomaAdenoCa

Mouse model conditionally expressing K-rasV12 in the lung

Bleomycin induced lung fibrosis mouse model

Senescent PneumonocytesControl

XenograftControl

Palbociclib induced tumor (melanoma) senescence mouse model

c

b. Irradiated human breast tissue

IrradiatedNon irradiated

2016

Είναι τελικά το Cdc6 καθοδικός (downstream)

τελεστής στο μονοπάτι RAS;

Το Cdc6 ως καθοδικός (downstream) στόχος στο μονοπάτι του KRAS

BJ-HRAS

OFF ON

HRAS

Cdc6

actin

HBEC CDC6

ON vs OFF

Downregulated

HBEC KRAS

V12 vs wt

Upregulated

HBEC CDC6

ON vs OFF

Upregulated

HBEC KRAS

V12 vs wt

Downregulated

HBEC-Cdc6

induction

Fo

ld c

ha

ng

e

0

20

40

60

80

100

120

Control hCdc6

SDF-1

IP-LC-MS/MS

Prostaglandin F2 receptor

TRIM21

Tubulin-beta

ADP/ATP translocase 2

Plexin-A1

HIF3-a

SETD2

Desmoplakin

Nucleophosmin

Plectin

Filamin A

RAN

Plakofilin-1

FOS

2 unique

peptides

Peptide 1

Peptide 2

InputUn-

bound

HBEC-Cdc6-TET ON

3 days ON

Beads

Myc-IP

Cdc6 blot

Gen

es u

p-r

egu

late

d b

y C

DC

6 i

nd

uct

ion

(Gen

e S

et E

nri

chm

ent A

na

lysi

s A

dj.

p-v

alu

e<0

.05

)

ON

OF

F

Under

Expression

Medium

Expression

Over

Expression

HBEC-Cdc6

induction ON

OF

F

b-microglobulin

(control region)

Coding

region

SDF-1

-2000

E-box TSS TSS

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

Control IP Cdc6 IP

SDF-1 b-microglobulin

Fo

ld c

ha

ng

e

RAS

Up

-regu

lati

on

Do

wn

-regu

latio

n

Gene set enrichment analysis showed that more than 60% of the genes

regulated by KRAS were also regulated by Cdc6

Gen

es d

ow

n-r

egu

late

d b

y C

DC

6 i

nd

uct

ion

(Gen

e S

et E

nri

chm

ent A

na

lysi

s A

dj.

p-v

alu

e<0

.05

)

Heatmaps of differentially expressed genes

HBEC-Cdc6

ON vs OFF

HBEC-KRAS

V12 vs wt

Number of differentially expressed genes

Probability of total

overlap being random

is lower than 10E-16

CV

CVCV

CVCV

44%56%

Common targets of KRAS and Cdc6

Targets of KRAS or Cdc6

RAS

Cdc6?

Cell membrane

Nucleus

?

Επιπλέον παρατηρήσαμε ότι ...

10 days5days0 days

P1

-co

ntr

ol ce

lls

P1-C

dc6

cel

ls

Sp

her

es

Το Cdc6 οδηγεί στην εμφάνιση κυττάρων:

1) με CD44high/CD24low έκφραση

2) με οργάνωση σφαιριδίων (tumorsphere)

CD24

CD

44

CD

44

A459 Vector A549 Cdc6

P1 Vector P1 Cdc6

7.71%

17.71% 32.27%

0.16%

CD24

Το Cdc6 απορυθμίζει γονίδια τα οποία υπερεκφράζονται από εμβρυικά και πολυδύναμα κύτταρα

(ESC/iPSCs: Embryonic Stem Cells & induced Pluripotent Stem Cells)

FAM72A POLQ TTK ZNF681 POLE2 NUSAP1 SNHG4 HMGA2 ODC1

SPC25 CENPA PLK1 LAMA1 RAD51 MED22 GSG2 UBE2S RACGAP1

HJURP FAM64A RAD51AP1 PSRC1 C18orf54 BCAT1 PRKDC WDHD1 FZD7

MCM10 CENPI FOXM1 SPAG5 ARHGAP11A FSD1 ORC6 CDH3 CEP78

CENPF BUB1 CCNB2 CDCA5 CCNA2 LOC100506469 BRIP1 KIF11 CKS2

DLGAP5 NDC80 TRIP13 FRAS1 ZNF347 ZNF215 BRCA2 DAZAP1 MIR17HG

CDC25C DEPDC1 KIF23 EME1 HAS3 ST6GALNAC3 FANCI MGC57346 DBN1

ASPM CENPE GINS4 LRAT CENPW FGFBP3 MTG1 DSCC1 POLE

PIF1 NCAPH FANCD2 AURKA SGOL2 C4orf21 GPC2 TRIM59 EXTL2

UBE2C HMMR BRCA1 DTL CACHD1 MLF1IP LRRC8B CENPJ PDK1

NUF2 NCAPG AURKB CDCA8 ZNF589 CENPO ECT2 TLCD1 CAD

KIF18B BUB1B ERCC6L CDCA2 KNTC1 ALG13 KIF20B ARHGAP19 CHAC2

KIF14 TOP2A GAS2L3 CENPK CDK1 DNMT3B OIP5 ZWILCH GINS2

MYBL2 C11orf82 TRAIP KIF2C NCAPG2 POC1A TIMELESS ZNF649 OTUD6B

KIF4A KIF15 ZWINT ZNF300 AASS C5orf34 LOC441666 PAR5 MDN1

CEP55 C16orf59 SKA3 PFAS KIAA1524 KIF22 PRPF38A CYP2S1 ATP6V0A2

KIF20A ESPL1 KIFC1 RAD54L KIF18A MFSD3 GPR63 HEATR1 MELK

BIRC5 CCNB1 ETV4 MND1 WDR4 LPAR2 PODXL ZBTB3 NUP205

EXO1 ANLN RRM2 SALL4 LMNB1 CCNF DARS2 POLD1 DNMT3A

CDC20 SKA1 TPX2 PLK4 STIL ZNF708 MYEF2 SMC4 CDC6

C16orf87 TAF5 BOD1 SALL2 MRPS2 CCNG1 FAM46B DNAJA2 CCNB1IP1

HSPE1 ASCC1 QRSL1 TAF4B NDUFAF4 DEK FRAT2 EXOSC5 FAM117B

BEND3 PPAT CCT4 FBL POP7 PPP1CC COL2A1 MTHFD2 CA14

PIM2 BCCIP AEN MRPL44 RCC1 SIRT1 MRPL10 HESX1 ZNF581

STOML2 BRIX1 MRPS30 NTHL1 RAC3 ZNF876P PDCD2L GMNN TNFSF11

Under

Expression

Medium

Expression

Over

Expression

Induction - - - + + +

HBEC-Cdc6 Tet-ON

Replicates: 1 2 3 1 2 3

Ο παράγοντας Stromal Derived Factor-1 (SDF-1) – ως

μεταγραφικός στόχος του Cdc6

Control Cdc6

P1 cells

200

200

Control Cdc6

P1 cells

150

150

SDF-1

input

1000SDF-1NC (150bp):

-1000SDF-1SDF-1(200bp):

0

20

40

60

80

100

120

SDF-1

Fo

ld C

ha

ng

e

Control

Cdc6 Cdc6Control Cdc6Control-- si Cdc6ctrl si

SDF-1

actin

Capan1 cells

pBabe:

siRNA:

1. SDF1/CXCR4 axis which is critical for proliferation, migration and survival of pancreatic ductal cells

2. CD133+/CXCR4+ signature in human pancreatic cancer cells is related with a high metastatic potential

and chemoresistance

Με δεδομένο ότι:

- Οι anti-RAS θεραπείες στον καρκίνο, βασιζόμενες είτε σε

αναστολείς ενζύμων που ρυθμίζουν την μετα-μεταφραστική

τροποποίηση είτε στην παρεμβολή με την ικανότητα

πρόσδεσης/υδρόλυσης GTP, δεν έχουν δώσει επιθυμητά αποτελέσματα,

Θα μπορούσε το Cdc6 να αποτελέσει εναλλακτικός θεραπευτικός στόχος;

Διάγραμμα ροής για την αναζήτηση και επιλογή αναστολέων του Cdc6

Συλλογές μορίων

In silico ανάλυση

(Virtual Screening)

Εκτίμηση επίδρασης στην

αύξηση, στο διηθητικό, στο

μεταστατικό και στο

ογκογόνο δυναμικό

In vitro δοκιμασία

σε επίπεδο πρωτεΐνης

(isolated protein)

In vitro δοκιμασίες

σε κυτταρικά

συστήματα

(cell-based assays)

In vivo δοκιμασίες

In silico πρόβλεψη χημικής

συγγένειας για Cdc6

Ομοιότητα με γνωστούς

αναστολείς άλλων AAA+

ATPασών

Προβλέψεις ADMET

In vitro προσδιορισμός

χημικής συγγένειας προς

Cdc6

In vitro μέτρηση έκφρασης

E-cad/INK4A

Θεραπευτικές δοκιμασίες σε

ξενομοσχεύματα, ιδιότητες

ADMET

Ζητήματα πνευματικής

ιδιοκτησίας

Θεραπευτική στόχευση του παράγοντα

Cdc6

Θεραπευτική στόχευση του καρκίνου με αναστολείς κατά του Cdc6

In silico 3D (Α) και 2D (Β) πρόβλεψη χημικής

συγγένειας του compound 1718 με το Cdc6

In vitro δοκιμασία της ικανότητας αναστολής του

Cdc6 από το compound 1718

Compound 1718

OFF ON ON

Cdc6

p14ARF

actin

HBEC-Cdc6 Tet-ONA. B.

1718: + + +

OFF ON ON

Cdc6

p14ARF

actin

HBEC-Cdc6 Tet-ONA. B.

1718: + + +-

Lab members, Collaborators and Funding

Hellenic Association For Molecular

Cancer Research

Vassilis Gorgoulis Lab

Molecular Carcinogenesis lab,

NKUA

Biomedical Research Foundation,

Academy of Athens

Faculty of Biology and Medicine, Manchester University

Thanos Kotsinas

Kostas Evangelou

Sophia Havaki

Ioannis Pateras

Panos Galanos

Kostas Vougas

Eirini Komseli

Marilena Papaioanou

Nikos Antoniou

Christos Zampetidis

Sofia Rizou

Giorgos Pappas

Thanos Halazonetis LabDepartment of Molecular Biology,

University of Geneva

Jiri Bartek LabCentre for Genotoxic Stress Research

Danish Cancer Society

Moshe Oren LabDepartment of Molecular Cell Biology

Weizmann Institute of Science

Claus Storgard Sorensen LabBiotech Research & Innovation Centre,

University of Copenhagen

Angel Nebreda LabIRB Barcelona

Aristidis Moustakas LabLudwig Institute for Cancer Research

Sinisa Volarevic LabDepartment of Molecular Medicine and

Biotechnology, University of Rijeka

Fabrizio d'Adda di Fagagna LabIFOM-FIRC

Institute of Molecular Oncology

Julian Blow LabUniversity of Dundee

Thomas Helleday LabKarolinska Institutet

Massimo Lopes LabInstitute of Molecular Cancer Research,

University of Zurich

Zoi Lygerou LabUniversity of Patras

Petros Sfikakis LabMedical School, NKUA

infla-Care

Co-finance by the EUand Greek national funds

through OP: Education and Lifelong Learning,

Research Program: THALES

ΙΚΥ- Siemens

Ευχαριστώ