Каменский Петр Андреевичpkame@list.ru

Импорт биомакромолекул в митохондрии

Митохондриальные болезни и их лечение

Транслоказа внутренней мембраны TIM23

TIM23-комплекс осуществляет (1) транспорт белков в митохондриальный матрикс и (2) встраивание некоторых белков во внутреннюю мембрану.

Коровый комплекс TIM23 (TIM23CORE)

1. Tim17 и Tim23 формируют канал2. Tim50 поддерживает канал в закрытом состоянии в

отсутствие предшественников3. Tim21 (неконститутивный компонент TIM23CORE)

связывается с Tom22 и облегчает перенос предшественников с TOM- на TIM23-комплекс.

Стадии транслокации предшественников через TIM23-комплекс в матрикс

1. Pam17, связываясь с TIM23-комплексом со стороны матрикса, стимулирует высвобождение Tim21 и проникновение сигнальной последовательности предшественника в матрикс.

Стадии транслокации предшественников через TIM23-комплекс в матрикс

2. К комплексу со стороны матрикса привлекаются белки Pam16, Pam18 и Tim44. После этого Pam17 спонтанно отсоединяется от комплекса.

Стадии транслокации предшественников через TIM23-комплекс в матрикс

3. Предшественник частично проникает в матрикс, где к его сигнальной последовательности присоединяется шаперон mtHsp70, который, вместе с Tim44, обеспечивает проникновение в матрикс остальной части белка.

Мотор импорта белков в митохондрии: как же он работает?

В результате гидролиза АТФ mtHsp70 связывается с импортируемым белком и претерпевает структурные изменения, в результате чего «наклоняется» перпендикулярно мембране. Таким образом, белок «протаскивается» в матрикс.

Мотор импорта белков в митохондрии: как же он работает?

Импортируемый белок совершает «статистические» движения в канале. Как только белок немного продвинулся в сторону матрикса, с ним связывается молекула mtHsp70, и это запрещает движение белка в обратную сторону. Процесс повторяется много раз, в результате чего белок оказывается целиком в матриксе.

В настоящее время неизвестно, какая именно из двух моделей реализуется при импорте белков в митохондрии.

Транслокация предшественников через TIM23-комплекс во внутреннюю мембрану

Некоторые белки встраиваются во внутреннюю мембрану непосредственно из TIM23-комплекса. Этот процесс не требует участия АТФ и обеспечивается только мембранным потенциалом.

Общая схема работы TIM23-комплекса

Транслоказа внутренней мембраны TIM22

TIM22-комплекс встраивает во внутреннюю мембрану интегральные белки (например, АТФ/АДФ-переносчик).

1.Tim22 – канальный белок2.Tim54 привлекает к комплексу малые Tim-белки3.Tim18 и Sdh3 участвуют в сборке комплекса и регулируют его стабильность

Схема встраивания интегральных белков во внутреннюю мембрану

1. Белок в цитозоле связывается с рецептором Tom702. Белок транспортируется через внешнюю мембрану3. В межмембранном пространстве с белком связываются малые Tim-белки: Tim9 и Tim104. Эти белки переносят белок к TIM22-комплексу, он встраивается в канал, после чего

происходит его латеральное открывание, и белок встраивается в мембрану

Отщепление сигнальных последовательностей импортируемых белков

В настоящее время более или менее подробно описан только механизм отщепления N-концевых сигнальных последовательностей посредством MPP.

Общая схема отщепления сигнальных последовательностей

Импорт РНК в митохондрии

Импорт РНК в митохондрии – видоспецифичный процесс

В митохондрии могу импортироваться тРНК, 5S рРНК, а также РНК-компоненты РНКазP и MRP (у млекопитающих)

Импорт тРНК в митохондрии

1. Как происходит разделение тРНК на импортируемые и неимпортируемые?2. Как тРНК попадают к поверхности митохондрий?3. Как происходит собственно транслокация тРНК через мембраны органеллы?4. Имеет ли место регуляция этого процесса, и если да, то как она осуществляется?

Нуклеотидные детерминанты/антидетермининты импорта тРНК в митохондрии

Универсальных нуклеотидных детерминант не имеется.

Другие необходимые условия импорта РНК

Импорт тРНК в митохондрии простейших

Даже внутри группы простейших механизмы импорта тРНК различаются.

Импорт тРНК в митохондрии простейших

1. Импортируются все элонгаторные тРНК2. Для доставки тРНК к поверхности митохондрий

необходим eEF1а3. VDAC не принимают участия в импорте; мембранные

белки, обеспечивающие импорт, неизвестны

Chlamydomonas – интересный случай импорта тРНК в митохондрии

Эффективность импорта различных тРНК составляет от 0 до 100%...

…и коррелирует с частотой использования соответствующих кодонов в митохондриях!

Импорт тРНК в митохондрии растений

1. Растворимые цитозольные белки не требуются2. Показаны три компонента внешней мембраны,

принимающие участие в импорте: Tom40, Tom20, VDAC3. Белки внутренней мембраны, необходимые для

импорта, неизвестны

Импорт тРНК в митохондрии дрожжей

CCA-OHU

G - C

G - C

C - GC - G

U - GU - A

U - A

- AA - UU - AG - CA -

C G C G

G C G C

UGAA

CGG A

C

C UU

UAA

AG

G

UU

C C C C

G G G G

U

A

тРЛ1

D

D m2

t6

m2

m7

CG AGC

(m1A)

m2G

2

CCA-OHG

- A

G - C

C - GC - G

U - A

G - U - A

G - C

C C C C

G G G GC U C G

G A G C

U

AGDGG A

U

C

U*UU

UAA

A

A

тРЛ2

D

D

t6

m2

G m7

- A

C G AG

C

(m1A)

m2G

2

тРЛ3

U - G

A

- AC - G

C5

D

Закодир. в ядерной ДНК95% в цитозоле 5% в митохондриях

U

U*=mnm 5S2U

CCA-OH

U - A

U - A - A

G - C

C G A C C

G C U G GU U U G

A A A C

UAA

GG A

A

AD

D

A

- GC

U**UU

U

At6

A

G - CA - UG - C

A - UA - U

A - UU

G - C CC

U U

C

C

AA

U

U**=cmnm 5U

Закодир. в ядернойДНК100% в цитозоле

Закодир. вмитохондр. ДНК 100% в митохондриях

Наиболее хорошо изученная система импорта РНК в митохондрии.

Необходимые условия импорта тРЛ1:

1. Нуклеотидные детерминанты импорта

2. Третичная структура тРНК

3. АТФ и мембранный потенциал

4. Белки-компоненты аппарата импорта белков в митохондрии и/или порины

5. Растворимые цитозольные белки: - цитоплазматическая лизил-тРНК- синтетаза (Krs1p) - энолаза 2 (Eno2p) - предшественник митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы (preMsk1p)

Енолаза-2 меняет структуру импортируемой тРНК

Схема событий в цитозоле, предшествующих импорту тРНК в митохондрии дрожжей

тРЛ1

тРЛ3

CCA-OH

U - A

U - A - A

G - C

C G A C C

G C U G GU U U G

A A A C

UAA

G

G A

A

AD

D

A

- GC

U**U

U

U

A

t6

A

G - CA - UG - C

A - UA - U

A - U

U

G - CC

C

U U

C

C

AA

U

CCA-OHG

- A

G - C

C - GC - G

U - A

G - U - A

G - C

C C C C

G G G GC U C G

G A G C

U

AG

DGG A

U

C

U* U

UUAA

A

A

тРЛ2

D

D

t6

m2

G m7

- A

C G A

GC

(m1A)

m2G

2

U - G

A

- AC - G

C5

D

U

CCA-OHU

G - C

G - C

C - GC - G

U - GU - A

U - A

- AA - UU - AG - CA -

C G C G

G C G C

UGAA

CG

G A

C

C U

UU

AA

AG

G

UU

C C C C

G G G G

U

A

D

D m2

t6

m2

m7

C G AG

C

(m1A)

m2G

2

?AAA / AAGAAAAAG

mcm5S2U

cmnm5S2

Роль тРЛ1 в митохондриях - ???

Адаптационный механизм митохондриальной трансляции дрожжей при повышенных температурах роста

тРЛ3 при 37С гипомодифицируется по wobble-положению антикодона, в связи с чем становится неспособной распознавать AAG-кодоны. В этих условиях присутствие тРЛ1 в митохондриях становится необходимым.

Импорт 5S рРНК в митохондрии млекопитающих

Нуклеотидные детерминанты/антидетерминанты импорта 5S рРНК

Белковые факторы импорта 5S рРНК в митохондрии клеток человека

1. Белок preMRP-L18 обеспечивает связывание 5S рРНК с роданезой2. Роданеза, связываясь с 5S рРНК, меняет свою конформацию и становится способной

(видимо, в комплексе с 5S рРНК) проникать через внешнюю мембрану

5S рРНК входит в состав миторибосом клеток человека

5S рРНК детектируется только в присутствии обеих субъединиц. Видимо, их диссоциация приводит к высвобождению 5S рРНК из митохондриальных рибосом.

Полинуклеотидфосфорилаза (PNPase) – регулятор импорта РНКв митохондрии млекопитающих

Митохондриальные болезни и их лечение

Митохондриальный геном человека

13 белков, 22 тРНК, 2 рРНК

DiabetesThyroidD

isease

Myopathy

Peripheral Neuropathy

Deafness

CVA / Seizures / Dev. delay

Respiratory Failure Optic Atrophy / Retinitis Pigmentosa

Cardiomyopathy

Short Stature

Marrow Failure

Liver Failure

Мутации в мтДНК и их фенотипические проявления

Мутации в мтДНК встречаются у каждого 500-го жителя Земли

(гетероплазмия)

Способы супрессии мутаций в митохондриальном геноме

Мутация в гене белка

Импорт соответствующегобелка с сигнальным пептидомиз цитозоля

Мутация в гене рРНК

?

Мутация в гене тРНК /протяженная делеция

Импорт РНК в митохондрии

На сегодняшний день все работы по супрессии таких мутаций сделаны ТОЛЬКО на культурах клеток человека (ни доклиники, ни клиники не делалось).

1. Импорт производных дрожжевых тРНК в митохондрии клеток человека с мутациями в генах изоакцепторных тРНК

А. Мутация в гене тРНК(Лиз) вызывает синдром MERRF

1. Импорт производных дрожжевых тРНК в митохондрии клеток человека с мутациями в генах изоакцепторных тРНК

Б. Мутация в гене тРНК(Лей) вызывает синдром MELAS

2. Импорт «мини-версий» дрожжевых тРНК в митохондрии клеток человека с протяженной геномной делецией

Вставочная последовательность «мини-РНК» комплементарна участку митогенома, образующемуся в результате делеции.

2. Импорт «мини-версий» дрожжевых тРНК в митохондрии клеток человека с протяженной геномной делецией

«Мини-РНК», импортируясь в митохондрии клеток человека, связываются только с мутантными митохондриальными ДНК и блокируют их репликацию. В результате снижается уровень гетероплазмии, и клетки практически «выздоравливают».

3. Опосредованный ферментом PNPase импорт гибридных РНК в митохондрии клеток человека

При слиянии митохондриальных тРНК с «сигнальной» последовательностью, узнающейся PNPase, гибридные тРНК импортируются в митохондрии и частично супрессируют мутации, приводящие к развитию синдромов MERFF и MELAS.

РНКаза Р