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二相代谢酶诱导剂 PYDDT 激活Keap1-Nrf2 通路的机制研究

浙江大学药学院张潇雨 , 马忠俊

报告人：张潇雨Email: zhangxy_zju@hotmail.com

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研究背景肿瘤的发展过程包括起始期、促进期和发展期，这一过程大概经历10~40 年的时间。《中国癌症预防与控制规划纲要》（ 2004-2010 ）的指导原则中第一条就明确指出，“癌癌症防治必须坚持‘预防为主’症防治必须坚持‘预防为主’”。肿瘤的预防措施包括一级预防和二级预防。一级预防一级预防是指消除致癌因素的影响、采取能降低致癌风险的生活方式；二级预防二级预防即化学预防化学预防，系采用无毒的天然或合成物质，通过逆转、阻断或延迟癌症发生的各个阶段降低恶性肿瘤发生的危险。

二相代谢酶诱导剂二相代谢酶诱导剂属于一类癌症化学预防剂，它通过升高具有清除自清除自由基和亲电试剂由基和亲电试剂作用的二相代谢酶保护细胞避免致癌作用。二相代谢酶家族包括 NAD(P)H: 醌氧化还原酶（ NQO1 ）、单加氧酶（ OH-1 ）以及谷胱甘肽转移酶（ GST ）等。

卷心菜卷心菜

红酒红酒

异硫氰酸酯异硫氰酸酯类类（ isothiocyanates ） 二苯乙烯类二苯乙烯类（ stilbenes ）

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研究背景二相代谢酶的表达依赖于 AREARE 基因基因的激活，这个过程是通过激活核转核转录因子录因子 Nrf2Nrf2 实现的。在基本的生理状态下，转录因子 Nrf2 与 Keap1 结合存在于细胞质中并通过 Keap1-Cul3-Rbx 依赖的泛素化过程保持平衡。在氧化应激条件下， Nrf2 可与Keap1 解离从而使其泛素化减少，从而更多的进入细胞核，激活 ARE基因并诱导二相代谢酶的表达。

PYDDTPYDDT 为一种从传统中药禹州漏芦中分离得到的炔醇取代噻吩类化合炔醇取代噻吩类化合物物。中国药典（ 2005 年版）：漏芦具有清热解毒、排脓止血、消脓止血的功效。

图 1 Keap1-Nrf2 通路示意图

图 2 PYDDT 的化学结构

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材料与方法结晶紫法结晶紫法确定 IC50值NQO1NQO1 诱导测试法诱导测试法确定 CD值Western BlottingWestern Blotting考察蛋白表达情况LC-MS&NMRLC-MS&NMR技术技术考察 PYDDT 与 GSH 结合情况免疫荧光免疫荧光考察 Nrf2 入核及总蛋白谷胱甘肽化修饰情况免疫沉淀免疫沉淀考察 Keap1 谷胱甘肽化修饰情况DTNBDTNB法法测定细胞内 GSH含量流式细胞术流式细胞术测定细胞内 ROS水平分子对接分子对接模拟谷胱甘肽化修饰对蛋白相互作用的影响

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研究结果1. PYDDT 具有很强的二相代谢酶诱导二相代谢酶诱导作用，且该作用是通过激活激活 Keap1-Nrf2Keap1-Nrf2 通路通路实现的；

图 3 PYDDT 激活 Keap1-Nrf2 通路并诱导二相代谢酶的表达

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研究结果2. PYDDT 在体外实验中能够与 GSH强烈结合，在细胞内可在 4小时内迅速降低细胞内降低细胞内 GSHGSH含量含量，并上调 ROS水平；

图 4 PYDDT 在体外能够与 GSH强烈结合

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研究结果2. PYDDT 在体外实验中能够与 GSH强烈结合，在细胞内可在 4小时内迅速降低细胞内降低细胞内 GSHGSH含量含量，并上调 ROS水平；

图 5 PYDDT 在细胞内可迅速降低细胞内 GSH含量，并上调 ROS水平

23%23%

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研究结果3. PYDDT 激活 Nrf2 及 Nrf2介导的 NQO1 表达均可被外被外源性源性 GSHGSH 逆转逆转；

图 6 外源性 GSH 对 PYDDT 激活 Keap1-Nrf2 通路及诱导二相代谢酶的影响

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研究结果4. PYDDT所导致的细胞内 GSH/GSSG比例的下降可引起细胞内蛋白的广泛谷胱甘肽化蛋白的广泛谷胱甘肽化，这其中也包括 Keap1 ；

图 7 “Thiol-disulfide exchange” 理论图 8 PYDDT 导致细胞内蛋白谷胱甘肽化修饰

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研究结果5. 利用计算机分子对接，当 Keap1 的 Cys434被谷胱甘肽化修饰后， Keap1Keap1 与与 Nrf2Nrf2 的相互作用显著减弱的相互作用显著减弱；

图 9 Keap1 的 Cys434残基被谷胱甘肽化修饰后对 Keap1-Nrf2复合物的影响

强氢键干扰

Keap1 和 GSSG 在体外孵育反应，经过 LC-MS分析，有七个半胱氨酸残基发生谷胱甘肽化修饰Chem. Res. Toxicol. 2008, 21, 2051–2060.

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结论与讨论1. PYDDY 为一类结构新颖的迈克尔受体小分子，在低细胞毒浓度下即具有很强的二相代谢酶诱导作用，说明 PYDDT 可作为一种有效的肿瘤化学预防剂进行更加深入的研究；

图 10 PYDDT 激活 Keap1-Nrf2 通路的可能机制

图 11 PYDDT 的其它潜在分子靶点

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2. 传统上认为迈克尔受体小分子（包括异硫氰酸酯类异硫氰酸酯类、查尔酮查尔酮类类、丹参酮类丹参酮类等）发挥活性作用的方式为直接与蛋白半胱氨酸残基的巯基结合。虽然很多体外实验证明了该假设，但在细胞内的情况目前尚无明确阐述。我们在一定的实验基础上提出一种全新的假设：即该类化合物可能并非与蛋白质巯基结合而更并非与蛋白质巯基结合而更倾向于首先与细胞内倾向于首先与细胞内 GSHGSH 结合结合，这种 GSH 的迅速下调可导致蛋白质的不同修饰（包括本研究中的谷胱甘肽化），从而发挥该类化合物的生物活性；

结论与讨论

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经典推测模型经典推测模型

细胞内表现？细胞内表现？

迈克尔受体小分子迈克尔受体小分子（（ Michael addition acceptorMichael addition acceptor

ss ））

结论与讨论

为何各类迈克尔受体小分子又为何各类迈克尔受体小分子又体现出不同的分子靶向性？体现出不同的分子靶向性？

11 、激活、激活 Keap1-Nrf2Keap1-Nrf2 通路；通路；22 、抑制、抑制 NF-NF-κκB;B;

33 、诱导凋亡；、诱导凋亡；44 、细胞周期阻滞。、细胞周期阻滞。

11 、改变细胞内、改变细胞内 GSHGSH 的能的能力和速率不同？力和速率不同？22 、残留靶向性？、残留靶向性？

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致谢

感谢浙江大学药学院药物信息学研究所马忠俊老师及其课题组全体同学！

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