ナノ粒子の細胞内動態制御技術； エンベロープ型 … raw) 未処理群vs kala...
TRANSCRIPT
ナノ粒子の細胞内動態制御技術；エンベロープ型遺伝子封入ナノ粒子を
利用したDNAワクチンを中心として
2013年11月29日 北海道地域 新技術説明会
北海道大学大学院 薬学研究院薬剤分子設計学研究室
准教授 秋田 英万教授 原島秀吉
我々の技術
樹状細胞に対する
を併せ持つナノ粒子
遺伝子導入能
免疫活性化能
本技術に関する知的財産権•発明の名称：核移行性を有する脂質膜構造体
•出願番号：特願2010-097888、PCT/JP2011/059738
•出願人 ：北海道大学
•発明者 ：原島秀吉、秋田英万、石井聡一郎
シャリフモハメドシャヒーン、中村孝司、二木史朗
⇒DNAワクチン
② 免疫活性化（アジュバント）による樹状機能の活性化
siRNA
活性化 DC
樹状細胞(DC)
① 効率的な遺伝子導入システムの構築
腫瘍・ウイルス抗原を発現するプラスミドDNA
ex vivo遺伝子導入
遺伝子発現⇒抗原発現⇒MHC ClassI分子への抗原提示
Tumor
DNA ワクチンの原理T細胞への抗原提示
抗原特異的T細胞の活性化
細胞障害性T細胞
腫瘍細胞、ウイルス感染細胞を攻撃
リンパ管
DNAワクチンのメリット
・抗原タンパクの大量精製が必要ない（遺伝子組み換えのほうが簡便・迅速）⇒抗原変異の高いウイルス感染にも迅速に対応⇒テーラーメードワクチン⇒人工抗原の構築が容易に可能
・樹状細胞自身に抗原を作らせる⇒翻訳後修飾（糖鎖修飾・折り畳み等）を
考慮する必要なし
Khalil IA et al. Gene Ther. (2007) 14(8):682-689
MEND ; Multifunctional Envelope-type
Nano Device
Stearyl-R8CH3(CH2)16CONHR8
RRRRRRRR(R8) peptide
Lipid envelope
Condensed DNA core
Adenovirus (particles/cell)
Tra
nsf
ection a
ctivi
ty(RLU/m
g p
rote
in)
分裂細胞
Kogure K et al. J Control Release. (2004) 2 : 317-323.Tra
nsf
ection a
ctivi
ty(RLU/m
g p
rote
in)
HeLa細胞と樹状細胞由来細胞株における遺伝子発現活性の違い
DC (JAWSII)HeLa
1x1055x103 R8-MEND
HeLa
105
106
107
108
109
105
106
107
104
108
109
R8-MEND の分裂・非分裂細胞における遺伝子発現活性
核膜
ＭＥＮＤの多重膜構造
細胞膜
GALA
へリックスランダムコイル
pH7.4pH↓
エンドソームリソソーム
膜融合活性
エンドソーム
リソソーム(分解系路)
pH↓
？
従来技術～GALA～
KALA
ランダムコイル
pH↓
へリックス
ステアリルKALAKALA 脂質（ステアリル）
（C末端のCEAは除く）
新規ペプチド素子の開発
膜融合活性
pH7.4
脂質エンベロープ
KALAの表面提示Wyman TB et al., Biochemistry 36: 3008-3017 (1997)
膜融合戦略による細胞内動態の概念図
100 nm
転写
改良点細胞膜との膜融合性強化
pH7.4
pH7.4
改良点核膜との融合性強化細胞質（中性pH）環境下で膜融合を促進
新技術～KALA～
核
膜融合
Shaheen SM and Akita H et al. Biomaterials; 32(26):6342-50 (2011)
樹状細胞由来細胞株における遺伝子発現活性
KALAを修飾したMENDでは遺伝子発現活性が大きく上昇
Luci
fera
se a
ctiv
ity(R
LU/m
gpr
otei
n)Gene Expression R8-KALA-MEND
R8-GALA-MEND
104
105
106
107
103
修飾量(%) 0 1 2 5 8 1 2 5 8
修飾 GALA KALA
R8-MEND
Akita et al. Biomaterials; 34(35):8979-90 (2013)
ばらつきの大きい遺伝子を除去した解析対象遺伝子のスキャッタープロット (21995 遺伝子)
解析対象とした遺伝子の発現変動(トランスフェクション6時間後)
KALA
-MEN
D群
発現
強度
(Log
２Ra
w)
未処理群 vs KALA修飾
未処理群 発現強度 (Log2Raw)
未処理群 vs KALA未修飾
R8-M
END
群発
現強
度(L
og２Ra
w)
未処理群 発現強度 (Log2Raw)
②KALA-MENDのみで3倍以上
発現変動(1187 遺伝子)
①R8-MENDのみで3倍以上
発現変動(181 遺伝子)
③ともに3倍以上発現変動
(275 遺伝子)
未処理群と比較して発現が3倍以上変動した遺伝子数
Akita et al. Biomaterials; 34(35):8979-90 (2013)
0.1
1
10
100
1000
IL-1β IL-6 IL-12 IFNβ TNFα CXCL9 CXCL10 CXCL11
103
102
101
100
10-1
01234567
NF-κB IRF3 IRF5 IRF7 STAT1 STAT2 STAT3 STAT5
mRNA e
xpre
ssio
n
(re
lative
to n
on-treate
d)
mRNA e
xpre
ssio
n
(re
lative
to n
on-treate
d)
KALA修飾MENDはアジュバント効果（免疫活性化能）も併せ持つ！
マイクロアレイ解析を用いた細胞内シグナル/サイトカイン産生の発現変動
1 h 3 h 6 h 1 h 3 h 6 hNon-treated R8-MEND R8/KALA-MEND
Akita et al. Biomaterials; 34(35):8979-90 (2013)
SWITCH
免疫活性化（アジュバント効果）
外来遺伝子の転写亢進（CMVプロモーター）
IFN-IR
TLRs
TBK1
IRF3
JAKSTAT
CMV
KALA-MENDs
Autocrine/Paracrine
IRF3P
RelA p50
IRF3P
IFN-β
Plasmid DNA
NF-κB
NF-κB
IL-6
STAT
P
P
P
P
P
P
IRF7
IFN-βIFN-
NF-κB
IkB
IkBP P
IFN-β
P : Phosphorylation
KALA搭載MENDによる免疫活性化及び外来遺伝子の転写促進機構
Akita et al. Biomaterials; 34(35):8979-90 (2013)
活性化 DC
樹状細胞(DC)
Tumor
ＫＡＬＡ－ＭＥＮＤのＤＮＡワクチンへの展開
T細胞への抗原提示
抗原特異的T細胞の活性化
細胞障害性T細胞
腫瘍細胞の攻撃
リンパ管
アジュバント効果
ＫＡＬＡ－ＭＥＮＤによるＤＣへの高い遺伝子導入効率
腫瘍特異的抗原を発現するプラスミドDNA
ex vivo遺伝子導入
遺伝子発現⇒抗原発現
⇒MHC ClassI分子への抗原提示
・細胞内動態制御・スイッチオン機能
出願番号：特願2010-097888、PCT／JP2011／053963（※国際出願に対する見解書で特許性ありと認可済）
スライド11
腫瘍予防効果 (ex vivo)
Control (PBS-)
アジュバント （ＣｐＧ）
Kala MEND (抗原ＯＶＡコードなし)
Kala MEND (抗原OVAコードplasmid DNA)
Kala MEND (抗原OVAコードplasmid DNA) + アジュバント （ＣｐＧ）
0 5 10 15 20 25 30
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Tum
or
volu
me (
mm
3)
3.5
E.G.7-OVA
(x 104)
Days after tumor inoculation
0
One-way ANOVA,followed by
Dunnett's MultipleComparison Test
**: p<0.01
(vs control)
********
Tum
or
volu
me (
mm
3)
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
0
(x 104)
****
One-way ANOVA,followed by
Dunnett's MultipleComparison Test
**: p<0.01
(vs control)
アジュバントの有無に関わらず高い抗腫瘍効果⇒KALA-MEND自身にアジュバント効果あり
Day 30
生体内直接投与による抗腫瘍効果（用途） 家畜用DNAワクチンを想定
直接投与
抗原 （OVA）発現pDNA
ＯＶＡ発現腫瘍細胞 (E.G.7-OVA)
直接投与
抗原 （MALT-1）発現pDNA
メラノーマ細胞 (B16F10)
Tum
or v
olum
e (m
m3 )
0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Tum
or v
olum
e (m
m3 )
(x104)
**
****
***
***
***
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
6 10 14 18 22 24 26 28 300
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
6 10 14 18 22 24 26 28 30
PBS
Tum
or v
olum
e (m
m3 )
KALA-MEND(OVA抗原遺伝子）
KALA-MEND(ルシフェラーゼ遺伝子）
MEND(ルシフェラーゼ遺伝子）
PBSKALA-MEND
(ルシフェラーゼ遺伝子）
7，14日前2回投与
7，14日前2回投与
胆癌後日数 胆癌後日数
想定される用途ex vivo樹状細胞への遺伝子導入
生体内直接投与
予防
治療
ヒト細胞治療用ＤＮＡワクチン（癌治療）
家畜用ＤＮＡワクチン（原虫・感染症予防）
ペット用ＤＮＡワクチン（癌・感染症治療）
ヒト癌治療用ＤＮＡワクチン
原虫用ＤＮＡワクチンに関して帯広畜産大学と共同研究を開始
家畜用のワクチンなど生物学的製剤 年間 264億円 （国内）国内のワクチン市場 ～1300億円
ペット用ＤＮＡワクチン（癌・感染症予防）
我々の技術
本技術に関する知的財産権•発明の名称：脂質膜構造体（目的物質を標的細胞に
効率的に送達可能なリポソーム）
•出願番号：特願2010-103333、PCT/JP2011/053963
•出願人 ：北海道大学
•発明者 ：原島秀吉、畠山浩人、イクラミ カリル、
高良和宏
血管内皮細胞へ抗がん剤を輸送して癌を治療するための２つのリガンド搭載リポソーム
Tumor cell
Doxil® as a gold standard
世界約８０カ国で承認（2008年）商品名：DOXIL (米国など)，CAELYX (欧州など)発売元：J&J (2011年1月から全世界で販売)
卵巣癌患者 ：日米欧などエイズ関連カポジ肉腫 ：日米欧など多発性骨髄腫 ：米欧など乳癌 ：欧など
Harrington KJ, et al.Clin. Cancer Res. (2001)
癌血管内皮標的⇒兵糧攻め
腎細胞種(RCC) は薬剤耐性の高い腫瘍と言われている
薬剤耐性細胞と癌血管内皮細胞間の薬物感受性の違い
Soto-Vega E, et al. Urol. Oncol. 27, 363-366 (2009)
血管内皮細胞は、薬剤耐性癌細胞よりも50倍以上抗がん剤（ドキソルビシン）に対して耐性である
OSRC-2 担癌
TEC 0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0.01 0.1 1 10 100 1000 10000ドキソルビシン濃度(g/ml)
細胞
生存
率(%
)
EC50
2.0 g/ml
95.1 g/ml
血管内皮の単離
腫瘍血管内皮細胞選択的結合
細胞透過性ペプチド (CPP)
Dualリガンド型リポソーム
++
+
細胞表面の負電荷
細胞取り込み効率の向上
NGR 標的化リガンド
標的となる受容体（CD13）
血管内皮細胞 (TEC)
PCT/JP2011/053963Kibria et al. J. Control. Release, 153, 141-148 (2011)
Takara et al. J. Control. Release, 162, 225-232 (2012)
Dualリガンドリポソームと Doxil®の抗腫瘍効果
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 3 6 9
PBS
Dualリガンドリポソーム
Doxil®腫
瘍堆
積(m
m3)
初回投与からの日数
****
**
Mean ± SD n=5-7, **P<0.01 vs PBS treatment one-way ANOVA, followed by 'Dunnett
投与量：1.5 mg/kg(ドキソルビシン量換算）
100 nm
Doxil®
Dual
300 nm
Tumor delivery
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
8.0
**
%ID
/g tis
sue
我々の技術
本技術に関する知的財産権•発明の名称：脂質構造体に細胞透過能を付与および/または脂質膜構造体
の細胞透過性を増強するペプチド、ならびにそれらペプチドを結合した脂質を構成脂質として含む、細胞透過能を有するまたは細胞透過能が増強された脂質膜構造体
•出願番号：特願2009-283091、PCT/JP2010/072485出願人 ：北海道大学
•発明者 ：原島秀吉、秋田英万、藤原孝博
血管内皮細胞を透過するためのトランスサイトーシス経路標的化ペプチド
正常組織への血中投与型DDS技術の構築
血流
実質細胞
血管内皮細胞
末梢血管投与
肝臓
癌
脳など
癌・肝臓を標的としたDDS
血管内皮細胞の間隙（癌）有窓血管内皮(肝臓)を介した実質細胞への浸潤
内封薬物放出
血管浸潤
実質細胞
正常標的としたDDS
Dualリガンド型ナノ粒子
血管
実質
血流
1.標的化
2.トランスサイトーシス
１．標的化リガンド
２．トランスサイトーシス経路標的化素子
0
20
40
60
80
100
120LRQRRRL
R R
*
**
**
** **
**
LRQRRRLLRQRRRL
アミノ酸置換
0
20
40
60
80
100
120
140
160LRQRRRL LRQRRRL
S: 水溶性 L: 疎水性D: アニオン性
**
****
アミノ酸置換
LX1X2X1X1X1LＸ１は極性アミノ酸残基Ｘ２は極性無電荷側鎖アミノ酸残基
世界初のトランスサイトーシス標的化ペプチド
トランスサイトーシス標的化ペプチドのスクリーニング
未処理 インスリン
Green: FITC-IB4（血管内皮）Red: Rhodamine（リポソーム）
Scale bar: 25 m
血中投与後２４時間後
脂肪組織への応用
脂肪血管内皮標的化リガンド
脂肪血管内皮標的化リガンド
+トランスサイトーシス
標的化ペプチド
１．標的化リガンド
２．トランスサイトーシス経路標的化素子
