ห น า | 1

บทท 1

บทน า ขนตอนในการคดสรรยาโดยทวไปเรมจากการศกษาเบองตนในหลอดทดลอง (in vitro) ทงน

เนองจากสามารถทดสอบไดในจ านวนมากในเวลาเดยวกน และสารทมฤทธดในหลอดทดลองจะถกน ามา

ศกษาตอในสตวทดลอง (in vivo) ซงปญหาทพบคอสารทแสดงฤทธดในหลอดทดลองจ านวนมากไมมฤทธ

เมอน ามาศกษาในสตวทดลอง แสดงใหเหนวาผลการศกษาในหลอดทดลองบางครงไมสอดคลองกบการ

ทดลองในสตวทดลอง (รปท 1) แตอยางไรกตามเราไมสามารถน าสารทงหมดมาทดสอบกบสตวทดลองได

โดยไมตองมผลการศกษาเบองตนจากหลอดทดลอง ทงน เนองจากตองใชสตวทดลองเปนจ านวนมากและม

คาใชจายสง รวมถงมปญหาทางดานจรรยาบรรณสตวทดลอง เพอลดปญหาทกลาวขางตนจงเรมมผสนใจน า

สตวไมมกระดกสนหลงมาท าการศกษาเบองตนกอนทจะน ามาทดสอบกบสตวทดลอง หรอคาดหวงวาจะ

น ามาศกษาแทนการทดลองในหลอดทดลอง โดยสตวไมมกระดกสนหลงทมรายงานการน ามาศกษาแลว

เชน แมลงหว (Drosophila melanogaste) หรอนมาโทด (Caenorhabditis elegans) เปนตน (Tan และคณะ,

1999) ซงในปจจบน มการศกษาและน ามาใชเปนตนแบบในการทดลองเพมมากขน

รปท 1 ภาพแสดงการคดสรรยาโดยทวไป โดยเรมจากสารปรมาณมากน ามาทดสอบฤทธในหลอดทดลองและจง

น าไปทดสอบประสทธผลของสารในสตวทดลอง

ห น า | 2

การน าสตวไมมกระดกสนหลงมาเปนตนแบบในการศกษาฤทธ พบวาสวนใหญเปน การศกษาฤทธ

ตานการตดเชอจลชพ แตพบวาการน าแมลงหว Drosophila melanogaster และนมาโทด Caenorhabditis

elegans มาทดสอบฤทธตานเชอจลชพยงมขอจ ากดเนองจากสตวทง 2 ชนดมขนาดทเลกมาก จ าเปนตองท า

ภายใตกลองจลทรรศน รวมถงปรมาณยาทใหในการทดสอบไมแนนอน เนองจากไมสามารถฉดเขาไปท

สตวไดโดยตรง นกวจยจงเรมหนมาศกษาสตวไมมกระดกสนหลงชนดอนๆ ทมขนาดใหญขน คอ หนอน

ไหม ซงมขอไดเปรยบในเรองของขนาดทใหญกวา และสามารถฉดยาปรมาณทแมนย าเขาสตวหนอนไหม

ได รวมถงสามารถใหได 2 ทางคอ ฉดใหทางเลอดเปด ( Intrahemolymph) และล าไสตอนกลาง

(Intramidgut)

ห น า | 3

บทท 2

ทบทวนวรรณกรรม

หนอนไหม หรอ Bombyx mori เปนตวออนของผเสอชนดหนงซงอยในล าดบ Lepidoptera ในวงศ

Bombycidae มวงจรชวตคอนขางส นเพยง 45-50 วน โดยวงจรชวตเรมจากเมอผเสอไหมผสมพนธและ

วางไข โดยผเสอหนงตวสามารถวางไขไดราว 400-600 ฟอง ไขจะใชเวลาฟกประมาณ 10 วนซงไขจะมส

เขมขนจนเปนสด า และฟกออกเปนตวหนอนไหม ซงมทงหมด 5 ระยะ ในชวงทเปนหนอนไหม จะกนใบ

หมอนเปนปรมาณมากและตลอดเวลา แตเมอเขาสตวเตมวยในระยะท 5 เปนประมาณ 7 วนจงจะเรมหยดกน

อาหาร มการพนใย และเปลยนเปนดกแด โดยฟกตวอยประมาณ 10 วนจงเปลยนเปนผเสอไหม และท าการ

ผสมพนธวางไขตอไป ดงแสดงในรปท 2A

ลกษณะโดยทวไปของหนอนไหมประกอบดวยสวนหว (head) อก (thorax) และทอง (abdomen)

ล าไสของหนอนไหมประกอบไปดวยล าไสตอนตน ตอนกลาง และตอนปลาย (รปท 2B) ล าไสตอนกลาง

(Midgut) เปนสวนทหนาทในการดดซมสารอาหาร สวนล าไสตอนปลาย (hind-gut) เปนสวนทใชในการดด

น าจากกากอาหาร ท าใหกากอาหารแหง ส าหรบการขบถายหนอนไหมม Malpighian tube เปนอวยวะท า

หนาทเกยวกบการขบถายของเหลว

หนอนไหมเปนสตวเลอดเปดดงนนหากฉดสารเขาใหทางเลอด hemolymph จะท าใหเกดการซม

ผานโดยตรงเขาสเซลลและอวยวะตางๆไดโดยไมตองอาศยการล าเลยงผานทางเสนเลอดฝอยเหมอนใน

มนษย ดงนนเมอฉดสารทตองการทดสอบเขาล าไส และเกดการดดซมจะเกดการกระจายสารอยางรวดเรว

ไปทวตวหนอนไหม

ห น า | 4

A.

B.

รปท 2 วงจรชวตของหนอนไหม(A) และสรระวทยาของหนอนไหม (B) (ดดแปลงจาก http://www.suekayton.com/Silkworms/images/Manyee/ Silkworm%20cycle%2034%20silkworm%20cycle.gif/ เมอวนท 10 มกราคม 2554)

ห น า | 5

การน าหนอนไหมมาทดสอบฤทธทางชวภาพ

1. โมเดลทดสอบฤทธตานการตดเชอจลชพ

1. โมเดลในการทดสอบฤทธตานเชอแบคทเรย (Bacterial infection model)

การน าสตวหรอสงมชวตอนๆทไมใชสตวเลยงลกดวยนมมาใชในการทดลอง สามารถหลกเลยง

หรอลดปญหาเกยวกบจรรยาบรรณสตวทดลองได มการศกษากอนหนาถงความสามารถในการตดเชอ

แบคทเรยของนมาโทด Caenorhabditis elegans, พช Arabidopsis thaliana และ ผเสอกนไขผง Galleria

mellonella ตอเชอ Pseudomonas aeruginosa และ อะมบา Dictyostelium discoideum สามารถท าใหตดเชอ

Legionella pneumophila , นมาโทด Caenorhabditis elegans และยสต สามารถตดเชอ Salmonella

typhimurium ได

จากการศกษาของ Kaito และคณะ (2002) พบวาเชอแบคทเรยทสามารถกอโรคในมนษย เชน

S. aureus, P. aeruginosa สามารถท าใหหนอนไหมระยะท 5 (สายพนธ Hu.Yo-Tukuba.Ne) ตดเชอและตาย

ไดภายใน 2 วนหลงการไดรบการฉดเชอเขาทเลอด (Intrahemolymph) (รปท 3) ในขณะทกลมทไดรบ E.

coli สายพนธทไมกอโรคในมนษยและกลมควบคมทไดรบเพยงน าเกลอ หนอนไหมสามารถเจรญเตบโตตอ

กลายเปนดกแดไดดงแสดงในรปท 4

นอกจากนทางกลมนกวจยไดท าการศกษาถงการตดเชอและการเจรญเตบโตของเชอ S. aureus ใน

หนอนไหม โดยการน าเนอเยอสวนนอกของล าไสตอนกลาง (Outer midgut) มาท าการยอมตดสเรองแสง

ดวยวธ Immunostaining assay หลงจากไดรบเชอ S. aureus ปรมาณ 3x108 cells/larvae ไปแลว 40 ชวโมง

ผลการยอมสแสดงใหเหนวาในกลมหนอนไหมทไดรบการตดเชอจะสามารถยอมตดสของเชอ S. aureus ท

เนอเยอได ในขณะทกลมควบคม(ไดรบน าเกลอ) จะไมพบการเรองแสง (รปท 5) และเมอศกษานบปรมาณ

เชอในสวนเลอดหรอสวนเนอเยอของหนอนไหมทเวลา 10, 20, 30 และ 40 ชวโมงหลงการฉดเชอ S. aureus

พบวาปรมาณของเชอแบคทเรยมปรมาณเพมขนทงในสวนของเลอดและเนอเยอ พบมปรมาณเชอมากกวา

1x108 cells/larvae ( ปรมาณเชอในหนอนไหมหลงจากฉดเชอมประมาณ 5x105 cells/larvae ) (รปท 6)

จากผลการทดลองดงกลาว ทางนกวจยยงไดทดลองฉดเชอ S. aureus ทผานการฆาดวย autoclave

แลวพบวาหนอนไหมไมเกดการตดเชอ และสามารถมชวตเจรญเตบโตตอไปได รวมถงไดทดลองให E. coli

สายพนธทกอเชอในมนษยได (O-157) พบวากสามารถท าใหหนอนไหมตายได แสดงใหเหนวาหนอนไหม

ห น า | 6

สามารถตดเชอแบคทเรยไดเชนเดยวกบในมนษย และไมใชทกสายพนธทสามารถฆาหนอนไหมได จากรป

ท 6 จะสงเกตเหนไดวาสายพนธทตางกน กใหผลการตายของหนอนไหมทตางกน โดยสายพนธ Smith ของ

S. aureus จะเหนถงผลทแตกตางจากสายพนธอนอยางเดนชด ซงเชอวาเนองจากมการแสดงออกของการ

สรางและปลอยสารพษออกมาทตางกน รวมถงปรมาณเชอทใหตางกนกมผลตอ % การรอดชวตของหนอน

ไหมเชนกน โดยถาใหเชอมากหนอนไหมกตายมากกวาเชอปรมาณทนอยกวา

รปท 3 ภาพหนอนไหมในกลมควบคม, ไดรบเชอ และเมอไดรบทงเชอและยารกษา

รปท 4 กราฟแสดง % การรอดชวตของหนอนไหมวย 5 (N=10) ภายในระยะเวลา 5 วน หลงจาก

ไดรบเชอ ปรมาณ 3x108 cells/larvae S. aureus (RN4220, Smith, MSSA, MRSA)

, P. aeruginosa (S24), E. coli (K12-3,W3110,NIHJ)

ห น า | 7

รปท 5 ภาพแสดงการตดส Immunostaining ของเนอเยอสวนนอกของล าไสตอนกลางของหนอน

ไหมวย 5 ทไดรบน าเกลอ (A) และไดรบเชอ S. aureus (B)

รปท 6 กราฟแสดงปรมาณเชอ S. aureus ในเลอด hemolymph (A.) และเนอเยอ (B.) ของหนอน

ไหมวย 5 ทเวลาตางๆ หลงจากไดรบเชอ S. aureus (MSSA) 3x107 cells/larvae

ห น า | 8

รปท 7 แสดงกราฟ %การรอดชวตของหนอนไหมภายใน 4 วนหลง

การไดรบเชอ MSSA (A) และ MRSA (B)

Kaito ไดศกษาทดลองใหยาตานเชอแบคทเรยในมนษย เชน Ampicillin, Oxacillin, Vancomycin

พบวาสามารถใหฤทธการรกษา และท าใหหนอนไหมรอดชวตไดเชนเดยวกน โดยยาทง 3 ชนดสามารถออก

ฤทธรกษาท าใหหนอนไหมทตดเชอ MSSA มชวตรอดได 90% ภายใน 4 วน ดวยยาขนาด 200 ไมโครกรม

ในขณะทกลมหนอนไหมทตดเชอ MRSA มเฉพาะยา Vancomycin ทสามารถใหผลการรกษาท าใหหนอน

ไหมรอดชวตได 80% ของทงหมด (รปท 6)

นอกจากน Kaito และคณะยงไดท าการทดลองใหน ายาฆาเชอ Disinfection กบหนอนไหม ผลการ

ทดลองพบวาไมสามารถหาคา IC50 ไดเนองจากคา LD50 ของสารต ากวาคา MIC จากการทดสอบดวยวธ

Agar diffusion จงท าใหหนอนไหมตาย ซงผลดงกลาวแสดงถงขอแตกตางของการทดสอบดวยหนอนไหม

และในหลอดทดลอง เนองจากน ายาฆาเชอ Disinfection ไมสามารถใหฤทธการรกษาเชอ S. aureus ทตดใน

หนอนไหมได ดงแสดงในตารางท1

Hamamoto และคณะ (2004) ไดท าการศกษาการตดเชอแบคทเรย S. aureus และ S. maltophilia

ของหนอนไหม และทดสอบในยารกษาทหลากหลายมากขน ผลการทดสอบเปนไปในทางเดยวกน (ตาราง

ท 2) ยาสามารถใหฤทธการรกษาในหนอนไหมทตดเชอไดเชนกน (รปท 8)

ห น า | 9

Hamamoto และคณะไดใหขอสงเกตวาคา ED50 จากการทดลองในหนอนไหมและ คา MIC จาก

หลอดทดลอง เมอน ามาเปนสดสวนกนคอ ED50/MIC พบวาในผลการทดลองยาทกตวทน ามาทดสอบให

คาทนอยกวา 10 และในยาบางชนดเมอน าไปเปรยบเทยบกบคา ED50/MIC ในหนทดลอง พบวามคาท

คอนขางใกลเคยงกน แสดงใหเหนถงความสอดคลองของผลทไดจากหนอนไหม และหนทดลอง (ตารางท

2)

การทดลองของ Barman และคณะ (2008) ในการทดสอบฤทธยากลม Oxazolidinones รวมถงสาร

ใหมทน ามาทดสอบฤทธ (RBx) ถงการออกฤทธตานเชอ S. aureus (MRSA 562) โดยทดสอบในหนอนไหม

สายพนธ CSR-2 x CSR-4 ผลการทดลองพบวาในการทดลองดวยหนอนไหมและหนทดลอง ใหฤทธการ

รกษาทมความคลายคลงกนเชนกน แตอยางไรกตามเมอค านวณคา ED50/MIC จากผลการทดลองนนไมได

ใหคาทนอยกวา 10 เสมอไปเหมอนในการทดลองของ Hamamoto และคณะ ซงทาง Barman ไดให

ความเหนวานาจะเกดจากการเลยงด สภาพแวดลอมและสายพนธของหนอนไหมทแตกตางกน ( ตารางท 3 )

รปท 8 กราฟความสมพนธระหวาง %การรอดชวตและความเขมขนของยาตานเชอแบคทเรยท

ใหกบหนอนไหมวย 5 ทตดเชอ S. aureus (A) และ S. maltophilia (B)

ห น า | 10

ตารางท 1 ตารางแสดงผลคา LD50, MIC และ IC50 ของยาปฏชวนะและน ายาฆาเชอ จากการทดสอบฤทธ

ตานเชอ MSSA, MRSA ในหลอดทดลอง และในหนอนไหม

ตารางท 2 คา ED50 ของยาชนดตางๆทใหกบหนอนไหมทตดเชอ S. aureus และ S. maltophilia

ตารางท 3 แสดงคา ED50 ในหนอนไหมและหนทดลอง, คา MIC จากการทดลองดวยวธ Agar diffusion

ห น า | 11

2. โมเดลในการทดสอบฤทธตานเชอรา

Hamamoto และคณะ (2004) นอกจากท าการศกษาในแบคทเรยแลว กไดลองน าเชอรา C. albican

และ C. tropicalis ซงสามารถกอโรคในมนษยมาฉดและศกษาในหนอนไหมเชนกน ผลการทดลองพบวา

เชอรา C. albican และ C. tropicalis ขนาด 1x106 และ 4x106 cells ใน Sabouraud medium 0.05ml ตามล าดบ

สามารถท าใหหนอนตดเชอและตายภายใน 2 วน แตเมอไดรบยา Amphotericin B, Fluconazole พบวา

สามารถใหฤทธการรกษาในหนอนไหมไดเชนกน โดย %การรอดชวตของหนอนไหมเพมขนตามความ

เขมขนของยาทมากขน (dose-dependent) ดงแสดงในรปท 9

รปท 9 กราฟความสมพนธระหวาง % การรอดชวตของหนอนไหมกบความเขมขนของยา

Amphotericin B และ Fluconazole ตอเชอ C. tropicalis (A) และ C.albican (B)

ห น า | 12

3. โมเดลในการทดสอบฤทธตานเชอไวรส

Orihara และคณะ (2008) ไดท าการศกษาฤทธของยาตานเชอไวรสในมนษย ไดแก Ganciclovir,

foscarnet, vidarabine และ ribavirin พบวาสามารถใหฤทธรกษาไดในหนอนไหมทไดรบการตดเชอไวรส

Baculovirus (รปท 10,11) ซงยาฆาไวรสทน ามาทดสอบสามารถยบย งการเจรญเตมโตของเชอไวรสใน

หนอนไหมเมอทดสอบใน cell cultures (รปท 12 ) ซงคา ED50 จากการทดสอบในหนอนไหม และคา IC50

จากการทดสอบดวย cell culture พบวาเมอน ามาเทยบอตราสวน (ED50/IC50) จะไดคาทต ากวา 5 ในทกยาท

น ามาทดสอบ Orihara และคณะจงเชอวา ยาหรอสารทน ามาทดสอบในหนอนไหม หากใหคา ED50/IC50ท

นอยกวา 5 จะเปนสารทเหมาะสมและสามารถน าไปศกษาตอในสตวทดลองจ าพวกเลยงลกดวยนมตอไปได

ดงนนทาง Orihara จงชใหเหนวา Silkworm-baculovirus infection model นาจะเปนโมเดลทเปน

ประโยชนใชในการประเมนฤทธตานเชอไวรสกลม DNA virus อยางไรกตามการประเมนฤทธตาน RNA

virus ซงเกยวของกบการกออาการตางๆในมนษย เชน ไขหวดใหญ เปนตน ยงคงตองท าการศกษาเพมเตม

โดยคาดวาจะน า cytoplasmmic polyhedron virus ซงอยในวงศ Reoviridae และม RNA dependent RNA

polymerase มาใชเปน virus ในการศกษา

รปท 10 ภาพแสดงหนอนไหมเมอไดรบการฉดดวยน าเกลอ(กลมควบคม)[ซาย], เมอไดรบ

เชอไวรส[กลาง] และเมอไดรบไวรบรวมกบยาฆาเชอไวรส Ganciclovir [ขวา]

ห น า | 13

รปท 11 แสดงกราฟความสมพนธระหวาง %การรอดชวตของหนอนไหม

และปรมาณความเขมขนของยาฆาเชอไวรสชนดตางๆ

รปท 12 กราฟความสมพนธระหวางปรมาณเชอไวรส

ในเลอด hemolymph ในกลมควบคมและยาแตละชนด

ตารางท 4 แสดงคา ED50 , IC50 และ ED50/IC50 ratio ของยาตานไวรสใชในการทดสอบฤทธตาน

ไวรสในหนอนไหมและ cell culture

ห น า | 14

2. โมเดลทางเภสชจลนศาสตร

1. การดดซมของยาตานจลชพ

การทดลองในหลอดทดลองหาฤทธตานเชอจลชพนนบางครงเมอน ามาทดสอบตอในสตวทดลอง

พบวาไมใหฤทธในการรกษา ซงปญหาสวนหนงมาจากเหตผลเนองจากมเภสชจลนศาสตรทไมเหมาะสม

เชน สารดงกลาวอาจดดซมไดไมด, มการขบออกทไวมาก หรอเกดการเปลยนแปลงโดยเอนไซมในตบ เปน

ตน Hamamoto และคณะ(2004) ไดทดลองศกษาดการดดซมของยาตานเชอแบคทเรย Tetracycline,

Chloramphenicol, Kanamycin และ Vancomycinในหนอนไหม โดยฉดเขาหนอนไหมเขาสเลอด

hemolymph (Intrahemolymph) หรอฉดเขาทล าไสตอนกลาง (Intramidgut) เพอเปรยบเสมอนการใหโดย

การรบประทาน รวมถงใหทางปาก (per oral) โดยการผสมกบอาหารและใหหนอนไหมกนตลอดทงหนงคน

ซงวธการฉดเขาเลอดหรอล าไสนนไดรบการทดสอบโดยฉดสเขาทเลอด hemolymph หรอเขาทางล าไส

ตอนกลางของหนอนไหม จะพบวาหนอนไหมทถกฉดสเขาเลอดจะเหนการกระจายของสทผวของหนอน

ไหม ในขณะทหนอนไหมทไดรบการฉดสเขาล าไสจะไมเหนสทบรเวณผวหนงของหนอนไหม ดงแสดงใน

รปท 12

รปท 13 แสดงการฉดสเขาเลอดและล าไสของหนอนไหม

ห น า | 15

ผลการทดสอบฤทธการรกษาหนอนไหมทไดรบเชอ S. aureus และใหยาปฏชวนะโดยบรหารยาใน

รปแบบทแตกตางกน 3 รปแบบ (Intrahemolymph, intramidgut, per oral) พบวาการใหยาแบบฉดเขาเลอด

ยาทกชนดสามารถออกฤทธและใหผลการรกษาในหนอนไหมได ในขณะทการใหโดยการฉดเขาล าไส

ตอนกลางหรอผสมใหกบอาหารเลยงหนอนไหมและปอนใหกน ม เฉพาะ Tetracycline และ

Chloramphenicol เทานนทสามารถออกฤทธการรกษาได แต Kanamycin และ Vancomycin ไมสามารถให

ฤทธการรกษาได (รปท 14) จากการศกษาทง in-vivo และ in-vitro โดยการแยกเอาล าไสหนอนมาบรรจยา

และดการซมผานออกมาภายนอกล าไส (รปท 15) ท าใหพบวาเปนผลเนองมาจากการทยา Kanamycin และ

Vancomycin ไมสามารถดดซมผานผนงล าไสของหนอนไหมเขาสเลอด hemolymph ได (รปท 16) ซง

ชใหเหนถงความคลายคลงกนของความสามารถในการดดซมจากล าไสเขาสเลอดของหนอนไหมกบมนษย

เนองจากในมนษยเอง Kanamycin และ vancomycin กไมสามารถใหฤทธการรกษาเมอใหโดยวธ

รบประทานซงเปนผลเนองมาจากขนาดโมเลกลทใหญและมความเปนขวมาก

ในขณะทยา Cefcapene pivoxil ซงเปนยากลม 3rd gen Cephem ทโครงสรางมการน า

Pivaloyloxymethyl ester moiety มาเตมในโครงสรางท าใหสามารถใหโดยการรบประทานได เทยบกบ

Cefcapene sodium ซงมปญหาดานการดดซมในมนษย ผลการทดสอบกบหนอนไหมกเปนไปในทาง

เดยวกนคอ ยา Cefcapene pivoxil สามารถออกฤทธรกษาไดดทงการใหแบบฉดเขาเลอด hemolymph และ

เขาทางล าไส (Intramidgut) จะสงเกตไดวา Cefcapene sodium ใหคา ED50 ทใกลเคยงกบ Cefcapene pivoxil

ในการบรหารแบบ Intrahemolymph แตมคา ED50 ทสงมากเมอใหทางการฉดเขาล าไสตอนกลาง

(Intramidgut) ดงแสดงในตารางท 5

ในป 2005 Hamamoto และคณะ (2005) ไดทดสอบผลของขนาด( Molecular mass) และความชอบ

ไขมน (Hydrophobicity) ของสารตอการซมผานล าไสของหนอนไหม ผลการทดสอบพบวาขนาดโมเลกลท

มากกวา 400 Da จะผานล าไสไดนอย รวมถงสารทมความชอบไขมน (Hydrophobicity) มากขนกจะสามารถ

ผานล าไสไดลดลงเชนกน (รปท 18) อยางไรกตามบางสารถงแมจะมโมเลกลทมากกวา 400 Da กสามารถ

ผานและดดซมได หรอสารทมขนาดนอยกวา 400 Da บางสารกไมสามารถผานได ซงกตองพจารณาถง

ปจจยอนๆอกเชนกน เชน เรองของรปทรง หรอแรงทกระท าตอกนระหวางสาร หรอตวน าสง เชน P-

glycoprotein เปนตน ซงกเปนเรองทตองท าการศกษาเพมเตมตอไป

ห น า | 16

รปท 14 กราฟแสดงความสมพนธระหวาง % การรอดชวตกบความเขมขน

ของยาชนดตางๆ เมอฉดเขาล าไสโดยตรง (i.m.) และใหทางปาก (p.o.)

รปท 15 แสดงภาพการน าล าไสของหนอนไหมมาใชในการศกษา in-vitro transport assay

ห น า | 17

รปท16 กราฟความสมพนธระหวางความเขมขนของยา Chloramphenicol และ

Vancomycin ทผานล าไสออกมาไดกบความเขมขนของยาขนาดตางๆทใชในการทดลองดการผาน

ของสารกบล าไสของหนอนใน in-vitro transport assay

รปท 17 กราฟความสมพนธระหวางอตราการผานของยา Cefcapene pivoxil(CFPN-PI), Cefcapene

sodium(CFPN-Na) ตอเวลา(a) และ ความเขมขนของยา ตอเวลา (b)

ห น า | 18

รปท 18 แสดงกราฟความสมพนธระหวางอตราการผานของสาร

กบขนาดของสาร(a) และ logPOW/M.W. ของสาร (b)

ตารางท 5 แสดงคา ED50, IC50 จากการทดลองยา Cefcapene pivoxyl และ Cefcapene sodium ในหนอนไหม

ทตดเชอ S. aureus และคา MIC จากการทดลองใน agar plate

ห น า | 19

2. การศกษาถงกระบวนการเมตาบอลซมของหนอนไหมตอสารแปลกปลอม

เอนไซมไซโตโครม P450 เปนเอนไซมทเกยวของกบกระบวนการเปลยนแปลงสารในรางกายของ

มนษย ส าหรบในหนอนไหมนนเอนไซมดงกลาวจะท าหนาทเกยวของกบการสรางสารหรอฮอรโมนภายใน

รางกายของหนอนไหม (Niwa และคณะ, 2004) Hamamoto และคณะ (2009) จงไดทดลองศกษาเปนครง

แรกวา หากมการใหสารแปลกปลอมเขาไปในหนอนไหม หนอนไหมจะมกระบวนการจดการสง

แปลกปลอมดงกลาวเชนไร โดยผวจยไดทดลองใหสาร 4-methyl umbelliferone ฉดเขาไปในรางกายของ

หนอนไหม และดดเลอด hemolymph มาวดทเวลาตางๆเพอวดปรมาณและหาคาครงชวต และพสจน

เอกลกษณของสารเกดขนจากการเปลยนแปลงในรางกายหนอนไหม

4-Methyl umbelliferone (7-hydroxycoumarin) เปนสารทเรองแสง ในรางกายมนษยจะถก

เปลยนแปลงโดย Glucuronide conjugation ไดเปนสารทไมเรองแสง จากการทดลองในหนอนไหมพบวาท

เวลามากขน มปรมาณของสาร 4-Methyl umbelliferone (7-hydroxycoumarin )ลดลง โดยมคาครงชวต

ประมาณ 7 นาท (รปท18) เมอเทยบกบการทดสอบในหนทดลอง ซงด าเนนการทดลองมาพรอมกน พบวา

ในหนมคาครงชวตประมาณ 9 นาท คาดงกลาวแสดงใหเหนถงความคลายคลงกนตออตราการเปลยนแปลง

ของสารดงกลาวในหนอนไหมและในหนทดลอง

จากการพสจนเอกลกษณสารทเกดจากการเปลยนแปลงของ4-Methyl umbelliferone ในหนอนไหม

หลงฉดสารดงกลาวเขาไป 20 นาท เมอวดดวย HPLC พบพคของ metabolite ขนท retention time เทากบ 13

นาท ซงเปนสารทถก conjugate ดวย Glucose ไมใช Glucuronide เหมอนในมนษย ( รปท 20 )และเมอให β

-glucosidase แลวพบการกลบมาเรองแสงเหมอนสารตงตน ในขณะทเมอให β-glucuronidase จะไมเกดการ

กลบมาเรองแสงอก จงเปนตวชวยยนยนวาสาร 4-Methyl umbelliferone ในหนอนไหมจะถกเปลยนแปลง

เปน Glucose-conjugate form ซงจากการทดลองแยกสวนอวยวะตางๆของหนอนไหม ไดแก fatbody, silk

gland, gut และสวนอนๆ มาท าการศกษาแยกสวนวากระบวนการ Conjugation ดงกลาวเกดมากทสวนใด ผล

การทดลองพบวาสวนใหญกระบวนการดงกลาวเกดขนทสวนไขมน (Fat body) ของหนอนไหม (รปท 21)

และเกดในสวนของ Microsomal fraction (ตารางท 6) ซงมความคลายคลงกบในมนษยทกระบวนการเมตา

บอลซมเกดท ไมโครโซมในตบ ดงนนเราอาจเปรยบไดวาสวนไขมน(Fat body) ในหนอนไหมมความ

คลายคลงเปรยบเทยบไดกบตบของมนษย

นอกจากนยงไดมการทดลองน าสาร 7-ethoxycoumarin ซงเปน General substrate ของเอนไซมไซ

โตโครม P450 (CYP450) ในมนษย มาทดสอบในหนอนไหมพบวาสารดงกลาวสามารถเปลยนแปลงถก O-

ห น า | 20

deethylation ไปเปน 7-hydroxycoumarin และ Umbelliferyl-β-D-glucopyranoside ซงเชอวาการ

เปลยนแปลงดงกลาวเกด 2 ขนตอนคอ กระบวนการ deethylation โดยเอนไซม CYP450 และกระบวนการ

คอนจเกชนโดย กลโคส ซงจะเหนไดวากลไกการเปลยนแปลงสารแปลกปลอมทเขาสรางกายของหนอน

ไหมนนมความคลายคลงกบในมนษย จงเชอวาหากมการศกษาเพมเตมกบสารทมากขน และไดขอมลท

นาเชอถอมากพอ จะสามารถน าหนอนไหมมาใชศกษาเกยวกบกระบวนการเปลยนแปลงยาภายในรางกายได

คราวๆ เบองตนกอนทจะไปศกษาในสตวทดลองเลยงลกดวยนมตอไป

รปท 19 แสดงกราฟความสมพนธระหวาง %สาร 4-Methyl umbelliferone

ทเปลยนแปลงไป ณ เวลาตางๆ

รปท 20 แสดง HPLC Chromatogram ของสาร 4-Methyl umbelliferone หลงจากฉดเขาหนอนไหม

และน ามาวดทนท (A) และเมอวดในเลอด hemolymph หลงจากฉดสาร 20 นาท (B)

ห น า | 21

รปท 21 กราฟแสดงความสมพนธระหวางปรมาณสาร Glucose conjugated – 4-

Methylumbelliferone ทเวลาตางๆ ในสวนตางๆของหนอนไหม

รปท 22 แบบเสนทางจ าลองการเปลยนแปลงสาร 7-ethoxycoumarin ในหนอนไหม

ตารางท 6 กระบวนการเกด glucose-conjugation ในสวนของ microsomal fraction และ soluble fraction

ห น า | 22

โดยทวไปหนอนไหมจะมกระบวนการขบถายโดย Malphigian tube อยางไรกตามกระบวนการ

ขบถายสารแปลกปลอมในหนอนไหมนนยงไมมขอมลการศกษา จ าเปนจะตองท าการศกษาเพมเตม ซงจาก

การศกษาโดยน าอจจาระของหนอนไหมมาสกด และหาปรมาณของสาร Umbelliferone รวมถง Glucose-

conjugated umbelliferone พบวาโดยสวนใหญ ขบออกในรป Glucose-conjugated และขบออกเกอบหมด

ภายใน 3 ชม. แรก (รปท 23)

รปท 23 กราฟความสมพนธระหวาง %การขบออกของสาร glucose-conjugated

umbelliferone และ สารในรปทไมเปลยนแปลง กบเวลาตางๆ

ตารางท 7 ปรมาณสาร Umbelliferone, Glucose-conjugated umbelliferone ทพบในอจจาระของหนอนไหม

หลงไดรบ Umbelliferone, 7-ethoxycoumarin

ห น า | 23

3. โมเดลทดสอบความเปนพษของสาร

Hamamoto และคณะ (2009) ไดท าการศกษาถงความเปนพษของสารตางๆ ตอหนอนไหม และหา

คา LD50 จากสารทเปนพษตอเซลล (Cytotoxic substances) โดยการฉดสารดงกลาวเขาไปในตวของหนอน

ไหม และดขนาดของสารทท าใหหนอนไหมตายครงหนงภายในหนงวน(LD50) ผลการทดลอง Hamamoto

ชใหเหนวาคา LD50 ของสารสวนใหญทน ามาทดสอบทไดจากการทดลองในหนอนไหมคอนขางเปนไป

ในทางเดยวกนกบการทดสอบในสตวเลยงลกดวยนม โดยเปรยบเทยบการฉดเขาในเลอดหนอนไหมเหมอน

การฉดเขาเสนเลอดด า(intravenous, i.v.) หรอฉดใตผวหนงของมนษย(subcutaneous, s.c.), และการฉดเขา

ล าไสหนอนไหม(intramidgut, i.m., m.)เปรยบเหมอนการใหโดยการรบประทาน(per oral, p.o.)

ผลของ potassium cyanide และ sodium azide ซงเปน aerobic ATP synthesis inhibitor มคา LD50

ในหนอนไหมทสงกวาในสตวเลยงลกดวยนม สวนในสารทมความเปนพษตอระบบประสาท (Neurotoxic

substances) ในสตวเลยงลกดวยนม เชน morphine, strychnine, D-tubocurarine และ botulinum toxin B จะม

LD50 มากกวา 10 เทาในหนอนไหมเมอเทยบกบในสตวเลยงลกดวยนม อยางไรกตามการน าหนอนไหมมา

ใชทดสอบความเปนพษของสารยงคงเปนเรองทใหม และยงตองค านงถงอกหลายๆดาน เชน เรองของระบบ

หายใจในมนษยเรานนใชปอด แตหนอนไหมใช spiracle ซงมลกษณะทแตกตางกน ดงนนพษในเรองของ

การกดการหายใจจงทดสอบไมไดในหนอนไหมเนองจากปอดถกควบคมโดยระบบกลามเนอและระบบ

ประสาทมาเกยวของ ดงนน morphine และ D-tubocurarine sulfate ซงมผลตอระบบหายใจ เมอทดสอบใน

หนอนไหมจะไมเหนผลดงกลาว หรอในเรองของความเปนพษตอตบและไตทอาจไดผลคลาดเคลอนกบการ

ทดลองในสตวเลยงลกดวยนม ซงเรองดงกลาวเปนเรองทตองค านงถงมากและตองมการศกษาเกยวกบ

หนอนไหมตอการทดสอบทางพษของสารเพมเตมตอไป

ห น า | 24

ตารางท 8 คา LD50 ของสารทมความเปนพษตอเซลล(Cytotoxic substances) จากการทดลองในหนอนไหม

และหน, m=intramidgut, h=heamolymph, p.o.=peroral, i.v.=intravenous, s.c.=subcutaneous

ตารางท 9 คา LD50 ของสารทมความเปนพษตอระบบประสาท (Neurotoxic substances) ในหนอนไหมและ

หน

ห น า | 25

4. โมเดลทดสอบความสามารถในการกระตนภมคมกนของสาร

ในระบบภมตานทานทตอตานการตดเชอในมนษยสามารถแบงยอยไดเปน 2 ชนดคอ ภมตานทาน

แตก าเนด (Innate immune response) และทสรางขนภายหลง (Acquire immune response) ซงพบวาทงสอง

ชนดมการท างานทใกลเคยงกนคอกระตนการหลง cytokine โดยปกต cytokine มผลดชวยปองกนรางกาย

อยางไรกตามหากมการสรางทมากเกนไปกสามารถสงผลใหเกดอนตรายได เชน ท าใหเกดภาวะตดเชอใน

กระแสเลอดได แตเนองจากความซบซอนของกลไกทเกยวของกบ cytokine, กลไกทกอใหเกดอาการ

ดงกลาวจงยงไมทราบแนชด ส าหรบสตวไมมกระดกสนหลงกลไกการปองกนสงแปลกปลอมทเขามาเชน

แบคทเรย ไดมาจากภมคมกนแตก าเนดเทานน ( Ishii และคณะ, 2008)

ภมคมกนแตก าเนดในสตวไมมกระดกสนหลงประกอบดวยสวนของ humoral และ cellular ,

humoral ประกอบดวย antimicrobial peptides, lectins และ melanin สวน cellular ประกอบดวย hemocyte ท

จะท าการ phagocytosis สารแปลกปลอม ส าหรบกลไกการกระตนภมตานทางในหนอนไหมทางหนงคอ

เมอมสารแปลกปลอมเขามาในตวหนอนไหม เชน สวนของ peptidoglycan ของ bacteria จะไปจบกบตวรบ

PGRP ซงสงผลใหเกดกระบวนการ melanization และกระตนการหลง Serine protease และท าใหเกดการ

สงเคราะหเมลานนและ reactive quinine ซงมความเปนพษตอแบคทเรย

Ishii และคณะ (2008)ไดศกษาถงกระบวนการตอตานสงแปลกปลอมทเขาสหนอนไหม เนองจาก

สงเกตเหนวาเมอฉดเชอแบคทเรยหรอราเขาทตวหนอนไหม หนอนไหมจะเกดภาวะอมพาตขน แมแตเชอท

ผานการฆาดวยความรอนกสามารถท าใหหนอนไหมเกดภาวะอมพาตไดทความเขมขนของเชอระดบหนง

ทาง Ishii เลยตองการศกษาถงกลไกทท าใหเกดภาวะดงกลาว โดยในชวงแรกเชอวาเกดจากการทสารอาจไป

จบท Kainic acid receptor จงท าใหเกดการหดตวของกลามเนอเหมอนทมรายงานกอนหนาน แตอยางไรก

ตามพบวามขอทแตกตางกนในสองจดคอ เรองของการเกดภาวะกลามเนอหดซงเกดชามาก ( ประมาณ 10

นาท) ในขณะท kainic acid สามารถกระตนไดในทนท และอกเรองหนงคอหากเปน kainic acid จะสามารถ

ถกยบย งภาวะหดตวของกลามเนอไดดวย L-glutamic acid แตพบวาการเกดกลามเนอหดตวจากการไดรบ

peptidoglycan หรอ glucan นนไมสามารถยบย งไดดวย L-glutamic acid จงเชอไดวากลไกการเกดกลามเนอ

หดตวนนเกดผานกลไกทตางจากกลไกผาน kainic acid

สาร Paralytic peptide (PP) เปนสารตวหนงทสงผลใหเกดการเปนอมพาตของหนอนไหม ทาง Ishii

สงเกตเหนวาหนอนไหมเกดภาวะอมพาตหลงไดรบเชอเขาไป จงสนนษฐานวา สาร PP นาจะมสวน

ห น า | 26

เกยวของกบกระบวนการตอตานในรางกายของหนอนไหม จงท าการศกษาโดยใหสาร anti-PP ฉดกอนแลว

จงตามดวยการให peptidoglycan หรอ glucan กบหนอนไหม พบวาผลภาวะอมพาตในตวหนอนไหมลดลง

(รปท 24) แสดงใหเหนวาสาร PP เปนสารสอตวหนงทเกยวของกบการเกดกลามเนอหดตวในหนอนไหมท

ไดรบ peptidoglycan หรอ glucan

Ishii ยงไดศกษาถงผลของ Reactive oxygen specie (ROS) ตอการตอตานสงแปลกปลอมของ

หนอนไหม โดยเชอวา ROS สามารถกระตนใหเกดการ activation PP และท าใหเกดการหดตวของกลามเนอ

ได จากการทดลองพบวา H2O2 สามารถกระตนใหเกดภาวะกลามเนอหดตวไดโดยแปรผนตรงกบความ

เขมขนของ H2O2 นอกจากนพบวาเมอให N-acetyl-L-cysteine หรอ edaravone ซงเปน free radical

scavengers สามารถลดการหดตวของกลามเนอทถกกระตนดวย peptidoglycan หรอ glucan ได แตไมมผล

ยบย งในกลมทถกกระตนดวย PP (รปท 25) จงท าใหเชอวา peptidoglycan หรอ glucan เปนตวสราง ROS ซง

จะสงผลตอใหเกดการ activated PP และเกดกลามเนอหดตวตอไป

จากการสงเกตวาในเซลลทไดรบเชอแบคทเรยสามารถหลงพวก ROS ออกมาได ทางผวจยจง

ตองการศกษาวา hemocyte ในหนอนไหมเปนแหลงสราง ROS จรงหรอไม โดยท าการศกษา NBT

reduction assay พบวา hemocyte ทไดรบ peptidoglycan ผลต ROS ออกมามากกวากลมทไมไดรบ (รปท

26) โดยพบ NBT formazan particle ซงเกดจากปฏกรยาระหวาง NBT และ ROS ขนใน hemocyte เมอมอง

ผานกลองจลทรรศน นอกจากนทางผวจยยงไดสนนษฐานวา Serine protease นาจะมสวนเกยวของกบการ

เกด activated PP ทถกกระตนโดย peptidoglycan โดยไดทดสอบให Serine protease inhibitor

(benzamidine, p-APMSF) พบวาสามารถลดการเกดกลามเนอหดตวจากการกระตนดวย peptidoglycan ได

อยางมนยส าคญทางสถต แต Serine protease inhibitor นไมมผลยบย งใน ภาวะกลามเนอหดตวทกระตนดวย

PP (รปท 27)ดงนนจงเชอวา Serine protease ท าการactivate PP เมอถกกระตนดวย peptidoglycan หรอ

glucan เพราะฉะนนสามารถสรปไดวาเมอหนอนไหมตดเชอแบคทเรยหรอจลชพอนๆ จะท าใหมการหลง

Cytokine-like factor ชอวา Paralytic peptide (PP) ซงเปนเปปไทดในกลม ENF peptide family ตามการแบง

ตามความเหมอนของล าดบกรดอะมโน โดย PP นนถกสงเคราะหออกมาในรป inactive และจะ active เมอม

สารแปลกปลอมเขามา

ดงนนทางนกวจยจงเชอวา กลไกการปองกนตวเองเกดโดยเมอแบคทเรยหรอราเขามาในรางกาย

ของหนอนไหม สวนของ peptidoglycan หรอ glucan จะไปจบกบตวรบและท าให hemocyte หลง ROS

ห น า | 27

ออกมาซงสงผลให Serene protease กระตนใหเกด activated PP และเกดกระบวนการตอตานสงแปลกปลอม

โดยการเกดการหดตวของกลามเนอดงแสดงในรปท 28 อยางไรกตามกยงคงมขอมลไมทราบแนชด

เกยวกบ ROS วาเกดจากการหลงของ hemocyte แนชดหรอไม หรออาจเกดจากภายนอกแลวซมผานเขาไป

ในเซลล และกลไกในการกระตน protease ทแนชดยงคงตองท าการศกษาเพมเตมตอไป

กลไกการปองกนรางกายของหนอนไหมโดยการหลง Cytokine-like PP และท าใหกลามเนอหดตว

นน ในรางกายมนษยเองกมกระบวนการดงกลาว เชน cytokine interleukin-4 ซงสามารถกระตนใหเกดการ

หดตวของกลามเนอเรยบทระบบยอยอาหาร ซงเปนกระบวนการปองกนตวเองจากการไดรบเชอพวกปรสต

จงเชอวากลไกการปองกนตวเองจากการตดเชอจลชพ และสาร cytokine-like PP นมความคลายคลงกน

ระหวางหนอนไหมและสตวเลยงลกดวยนม หรออาจเปน cytokine ทมอยและท าหนาทในสตวเชนกน

โดยคาดวาประโยชนทไดรบจากการศกษากลไกดงกลาวคอกลไกนนาจะเปนกญแจเพอน าไปหา

ค าตอบถงกลไกทท าใหเกดอาการตางๆจากการทมการสราง Cytokine ในรางกายทมากเกนไป นอกจากน

จากความรในเรองของกลไกการตอตานของหนอนไหมซงแสดงออกโดยกลามเนอหดตวของหนอนไหม

ท าใหมการน ามาศกษาใชเปนการทดสอบเบองตนในการหาสารทมความสามารถในการกระตนภมคมกน

เชน มการศกษาในอาหารทางการเกษตรหากอาหารดงกลาวสามารถกระตนภมคมกนไดกจะกอใหเกด

กลามเนอหดตวในหนอนไหม ดงแสดงในรปท 29, 30

ห น า | 28

รปท 24 แผนภมแทงแสดงคาการหดตวของกลามเนอหนอนไหมหลงจากถกกระตนดวย 1 mg/ml

peptidoglycan, 1mg/ml glucan, 4 µg/ml PP () และเมอมการให anti-PP serum รวม ()

รปท 25 แผนภมแทงคาการหดตวของกลามเนอหนอนไหมเมอถกกระตนดวย peptidoglycan,

glucan และ PP ในกลมทดลองทใหSaline, N-acetyl-cysteine; NAS, Edaravone

รปท 26 แผนภมแทงแสดงคา Intensity ของ ROS ในหนอนไหมทถกกระตนดวย peptidoglycan

(10mg/ml) หรอ phorbol myristate acetate (PMA; 10µg/ml) และ Phosphate buffer saline (PBS)

ห น า | 29

รปท 27 แผนภมแทงคาการหดตวของกลามเนอหนอนไหมเมอถกกระตนดวย peptidoglycan,

glucan และ PP ในกลมทดลองทใหSaline, Benzamidine และ p-APMSF

รปท 28 แผนภาพแบบจ าลองเสนทางการเกดภาวะปองกนตวเองจากการถกกระตนดวย Peptidoglycan

ห น า | 30

รปท 29 รปการทดลองการหดตวของกลามเนอเมอ

ถกกระตนดวยสารกระตน(i), และน าเกลอ (ii)

รปท 30 กราฟแสดงความสมพนธระหวางความยาวของหนอนไหมกบ

เวลาของตวอยางทไดรบน าเกลอ()และอาหารทางการเกษตร()

ห น า | 31

5. โมเดลศกษาหา Bacterial virulence genes S. aureus กอใหเกดโรคฉวยโอกาส (Opportunistic disease) ในคนไขทมความบกพรองของภม

ตานทาน ความเขาใจเกยวกบกลไกระดบโมเลกลของการแสดงออกทางพยาธสภาพของ S. aureus ใน

รางกายสตวจะชวยใหเขาใจและสามารถหาวธมารกษาเชอดงกลาวได ซงหากดจากล าดบยนของแบคทเรย

ชนดนพบวาม 589 ยนทเกยวของกบการเกดโรคแตหนาททชดเจนยงคงไมทราบแนชด (Kaito และคณะ,

2007)

จากการศกษาของ Kaito และคณะ (2005) ไดทดลองกลายพนธของล าดบยนของเชอแบคทเรยเปน

สายพนธทแตกตางกน 100 สายพนธและฉดเขาเลอดหนอนไหม และพบวาม 3 สายพนธทใหผลการกอโรค

ลดลง โดยสายพนธอนๆสามารถท าใหหนอนไหมตายไดครงหนงภายใน 36 ชวโมงแตในสามสายพนธ

ดงกลาวตองใชเวลามากกวา 80 ชวโมง(ตารางท 10) โดย Kaito ใหชอยนดงกลาววา cvfA, cvfB, cvfC

(Conserve virulence factor A,B,C) ซงเมอน ามาทดสอบกบหนทดลอง ผลการทดสอบพบวาสายพนธทม

การลบล าดบยน cvfA, cvfB, cvfC ออกจะใหผลกอโรคนอยลง จงชใหเหนวายนสามตวนเกยวของกบการกอ

โรคในสตวเลยงลกดวยนม

จากการทดสอบการหลง exotoxin ของสายพนธ wild-type, cvfA, cvfB, cvfC พบวาสามสายพนธท

มการกลายพนธสราง exotoxin นอยกวา wild type strain โดยใน agar plate assay ทม เลอด erythrocyte ของ

แกะ (ซบเสตรทของ beta-toxin) จะเหนวาในสามสายพนธทกลายพนธม lysis zone นอยกวา wild type

strain และ cvfA mutant มปรมาณของ protease และ nuclease หลงจากเซลลนอยกวา wild-type strain ซง

จากผลดงกลาวนกวจยจงเชอวายน cvfA, cvfB, cvfC นาจะมสวนเกยวของกบ exotoxin genes

Agr locus เปนสวนทเกยวของกบการแสดงออกของ exotoxin ใน S. aureus ทาง Kaito จง

ท าการศกษาวาหากน ายน cvfA ออกจะสงผลตอการแสดงออกของ agr locus หรอไม ซงผลการทดลองโดย

วธ Northern blot analysis แสดงใหเหนวาระดบการแสดงออกของ RNAII ซงเปนผลจาก agr locus และ

RNAIII ทเกดจากการกระตนของ RNAII มระดบทลดลงในสายพนธทกลายพนธ cvfA จากผลดงกลาวจง

ชวยสนบสนนหลกฐานวายน cvfA ควบคมการแสดงออกของ agr locus ซงเกยวของกบการแสดงออกของ

ยน exotoxin ทเกยวกบ hemolysins, protease และ nuclease

ห น า | 32

ตารางท 10 Killing ability ของสายพนธตางๆตอหนอนไหม

รปท 31 ภาพแสดงการสราง exotoxin ของสายพนธ wild-type, cvfA, cvfB, cvfC

6. การน าหนอนไหมมาใชเปนโฮสตในการสรางโปรตน

มการทดลองมากมายทน าหนอนไหมมาใชในการเปนโฮสตส าหรบสรางโปรตน ซงโดยปกตโฮสต

ทมการน ามาใชคอ E. coli เพราะสามารถท าไดงาย อยางไรกตามมนยงคงมขอจ ากดบางอยาง เชน ไม

สามารถดดแปลงในชวง cotranslation หรอ posttranslation ได เมอไมนานมานนกวจยบางกลมเรมนยมและ

สนใจหนมาใชแมลง เชน หนอนไหม ในการสรางโปรตนเพราะมกลไกทคลายกนและมความสามารถใน

การดดแปลงชวง cotranslation และ posttranslation ได เชนการ glycosylation, phosphorylation และ protein

processing เปนตน (Kato และคณะ, 2010)

AcNPV (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) Bacmid เปน bacmic ทมการใชกน

กวางขวาง อยางไรกตาม AcNPV ไมมความสามารถในการ infect เขาหนอนไหมทางการศกษาของ

Motohashi และคณะ (2005) จงพฒนา Bombyx mori nuclear polyhedrosis virud bacmic system และทดลอง

ห น า | 33

ใหหนอนไหมสรางโปรตนทเรองแสงสเขยว ซงกประสบความส าเรจไมวาจะท งใหการตดเชอโดย

recombinant virus หรอการฉด bacmid DNA เขาโดยตรงทตวหนอนไหม ซงจากการศกษาดงกลาวแสดงให

เหนถงความสามารถในการสรางโปรตนอยางรวดเรวในหนอนไหม และมความปลอดภย จงเชอวาจะ

สามารถน ามาใชเปนเครองมอในการสราง recombinant eukaryotic protein ทด

ห น า | 34

บทท 3

การประยกตน าโมเดลหนอนไหมมาใชในการทดสอบสารใหมหรอสารจากธรรมชาต

1. การประเมนฤทธทางเภสชวทยาของยา Oseltamivir ในระบบประสาท

การทดลองอนๆทมการน าหนอนไหมมาใชเปนโมเดลในการทดลองนอกเหนอจากการทดสอบการตาน

เชอจลชพและการทดสอบดการดดซมของยา เชน การน าหนอนไหมมาทดสอบดเรองของผลตอการกระตน

ท Glutamate receptor ของยา Oseltamivir เนองจากการศกษาของ Sekimizu และคณะ (2005) พบวา D-

glutamic acid และ Kainic acid สามารถกระตน glutamate receptor ชนด Kainic acid ทกลามเนอลายของ

หนอนไหมได สงผลใหเกดกลามเนอหดตว แตหากไดรบ L-glutamic acid จะใหฤทธในทางตรงกนขามคอ

สามารถตานการหดตวของกลามเนอได

Ishii และคณะ (2008) จงสนใจศกษาและไดทดลองน า Oseltamivir ซงมโครงสรางคลายกบ L-

glutamic acid ซงเปนสารสอประสาททหากมปรมาณมากเกนไปสามารถกอใหเกดภาวะตางๆทางสมองได

เชน ภาวะลมชก เปนตน จงเชอวาหาก Oseltamivir สามารถจบท glutamic receptor ไดกอาจมฤทธเหมอน

L-glutamic acid และเปนสาเหตหนงของภาวะชกได ดงนนทางนกวจยจงไดท าการทดลองกบหนอนไหม

โดยศกษาดการหดตวของหนอนไหมโดยการฉด Oseltamivir (2.5 mg) เขาทเลอด hemolymph ของหนอน

ไหม ผลการทดลองพบวาหนอนไหมเกดการคลายตวของกลามเนอ จงเชอวายา Oseltamivir นาจะมกลไก

การออกฤทธคลายกบ L-glutamic acid ซงมผลตอระบบประสาทได ทางIshii และคณะกไดท าการทดสอบ

ในโมเดลอนๆ คอ ท าการทดสอบฉดยาเขาท intracerebellar ของหน mice และสงเกตดพฤตกรรมท

เปลยนแปลงไป และดคา Electrophysiology ของ hippocampal slice ในหน rat ซงผลจากการทดลองทง 3

การทดลองใหผลเหมอนกบการกระตนโดย L-glutamic acid ดงนน Ishii และคณะจงชแนะถงการดดแปลง

โครงสรางของ Oseltamivir เพอพฒนาลดอาการขางเคยงใหไมมผลตอ glutamic receptor

ห น า | 35

รปท 32 โครงสรางของ Oseltamivir (ซาย) และ L-glutamic acid (ขวา)

รปท 33 ภาพหนอนไหมในกลมควบคม (ซาย) และ ทไดรบ Oseltamivir (ขวา)

2. การใชหนอนไหมในการศกษาสารจากธรรมชาตทมความเหมาะสมในเรองเภสชจนศาสตร จากการศกษาถงการน าหนอนไหมมาใชในการทดลองทหลากหลาย ผลการทดลองพบวาหนอน

ไหมมเอนไซมไซโตโครม P450 (CYP450) ในกระบวนการเมตาบอลซมทคลายในมนษย, มลกษณะการดด

ซมยาผานล าไสทคลายกบในมนษยเชนกน และผลการทดสอบฤทธตานเชอจลชพกใหผลไปในทางเดยวกบ

ในการทดสอบดวยวธมาตรฐาน Asami และคณะ (2010) จงไดศกษาทดสอบถงความคงตวของยาสมนไพร

Seihi และความสามารถในการดดซมของยาดงกลาว โดยฉดสาร Seihi เขาสล าไสของหนอนไหม และวดด

ความคงตวของสารทซมผานล าไสเขามาส hemolymph ทเวลาตางๆ ซงจากการศกษาสาร Seihi เมอดดซม

เขาสกระแสเลอด hemolymph จากการวเคราะหดวย HPLC พบสาร 3 ชนดในเลอดของหนอนไหมไดแก

Nobiletin, Heptamethoxyflavone, Tangeretin ซงมคาครงชวตทเวลา 18, 26, 34 ชวโมงตามล าดบ เมอ

เปรยบเทยบ Nobiletin กบคาครงชวตของสารดงกลาวในหนทดลอง (> 24hr) พบวามความใกลเคยงกน

แสดงใหเหนวาสารทงสามชนดมความคงตวทดเมอดดซมเขาสเลอดของหนอนไหม และเชอวาสารทมเภสช

จลนศาสตรทเหมาะสมในหนอนไหม กนาจะมเภสชจลนศาสตรทเหมาะสมในสตวเลยงลกดวยนมเชนกน

3. การศกษายาสมนไพรจนตอฤทธตานไวรส Orihara และคณะ (2008) ไดน ายาสมนไพรจน (Kampo medicine) 3 ชนดไดแก Maoto, Kakkon-to,

Shosaiko-to มาศกษาดผลตอการตานไวรส โดยฉดสารเขาไปในหนอนไหมทไดรบเชอไวรส baculovirus

(BmNPV ) ซงผลการทดสอบพบวา Maoto มฤทธตานไวรส baculovirus ทดทสด (รปท 34 ) ใน Maoto

ประกอบไปดวยสารจากธรรมชาตสชนด ไดแก ephedra herb, apricot kernel, licorice root และ cinnamon

bark ทาง Orihara และคณะจงน าสารดงกลาวมาสกดแยก และทดสอบพบวาสารทออกฤทธตานไวรสคอ

สาร Cinnzeylanine ใน Cinnamon bark ซงกถอเปนการศกษาแรกทพบวาสาร cinnzeylanine มฤทธตาน

ห น า | 36

ไวรสในโมเดลหนอนไหมได และเมอทดสอบ Plaque-forming assay ดความสามารถในการตานการ

เจรญเตบโตของจ านวนไวรส BmNPV พบวามความสามารถใกลเคยงกบ Ganciclovir และมฤทธลดการ

แบงตวของไวรส HSV-1 ใน vero-cell เชนกน

รปท 34 กราฟความสมพนธระหวาง %การรอดชวตของหนอนไหมกบเวลา ของ [] Control,

[] BmNPV+Saline, [] BmNPV+Maoto(100mg),

[] BmNPV+ Kakkon-to(200mg), []BmNPV +Shosaiko-to(200mg)

รปท 35 กราฟความสมพนธระหวาง % Plaque reduction และความเขมขนของสาร Cinnzeylanine

และ Ganciclovir

ห น า | 37

รปท 36 กราฟความสมพนธระหวาง %จ านวน Plaque กบ Cinnzeylanine ทความเขมขนตางๆ

4. Nokomycin, ยาตานเชอแบคทเรย Uchida และคณะ (2010) ไดน าโมเดลหนอนไหมมาใชศกษาหาสารทมฤทธตานเชอ methicillin-

resistant Staphylococcus aureus (MRSA) เบองตน โดยมขอก าหนดวาหากสารใดสามารถท าใหหนอนไหม

ทตดเชอ MRSA มชวตรอดตอไปไดอยางนอย 3 วนหลงไดรบเชอ จะถกพจารณาคดเลอดเพอน ามาศกษาตอ

ในวธมาตรฐาน liquid microdilution method ตอไป ซงจากการทดสอบเบองตนดงกลาว ท าใหพบสารตาน

เชอ MRSA ตวใหมคอ Nokomycin (A-D) (รปท 37) ซงขนาดประมาณ 50 µg/larvae สามารถท าใหหนอน

ไหมรอดชวตจากการตดเชอ MRSA ไดและมคา MIC 0.125 µg/ml จากการทดสอบดวย liquid

microdilution method (ตารางท 11) ในขณะท imipenem และ vancomycin มคา MIC เทากบ 16 และ 0.5

µg/ml ตามล าดบ แสดงใหเหนวาสาร Nokomycin มฤทธในการตานเชอ MRSA ทดเมอทดสอบในหนอน

ไหม ซงผลจากการทดลองในหลอดทดลองกแสดงใหเหนวาสารดงกลาวมฤทธทด จงอาจกลาวไดวาโมเดล

หนอนไหมมประโยชนและสามารถน ามาคดเลอกสารทมฤทธตานเชอ MRSA กอนในเบองตน เพอทจะ

ด าเนนการทดสอบขนตอไป

รปท 37 โครงสรางของ Nokomycin A-D

ตารางท 11 คา MIC ของ Nokomycin A-D , Imipenem และ vancomycin จากการทดสอบฤทธตานเชอ

MRSA ดวย liquid microdilution method

ห น า | 38

5. การน าหนอนไหมมาเปนโมเดลในการศกษาฤทธตานเชอ MRSA ของสารกลม

oxazolidinones

การทดลองของ Barman และคณะ (2008) ในการทดสอบฤทธยา vancomycin, linezolid และสาร

ใหมกลม oxazolidinones (RBx 7644, RBx 8700, RBx 2006171) ถงการออกฤทธตานเชอ S. aureus (MRSA

562) โดยทดสอบในหนอนไหมสายพนธ CSR-2 x CSR-4 จากผลการทดลองพบวา vancomycin, linezolid,

RBx 7644, RBx 8700 มคา ED50 เทากบ 30.72, 13.38, 37.89, 24.96 ตามล าดบในขณะท RBx 2006171

(6.25-200 mg/kg body weight)ไมสามารถหาคา ED50 ไดในการทดลองดวยหนอนไหมรวมถงในหนดวย

เชนกน ซงแสดงใหเหนถงความแตกตางของผลจากการทดสอบดวยหนอนไหม,หน และAgar plate

เนองจากในการทดลองดวย Agar plate จะเหนไดวาไดคา ED50 ทคอนขางดมาก แตเมอมาท าการทดสอบใน

หนอนไหมหรอหนทดลองพบวาไมมฤทธการรกษา ซงทงสองการทดลองใหผลทสอดคลองเปนไปในทาง

เดยวกน (ตารางท 21) จงเชอวาหนอนไหมจะเปนโมเดลทดและเอามาใชในการทดสอบเบองตนได ทงยงม

ขอดในเรองของปรมาณสารทใชฉดกใชเพยงเลกนอย คอใชเพยงประมาณ 1 mg ในขณะทหน mice , rat ใช

10, 30mg ตามล าดบ

ตารางท 12 คา MIC และED50จากการทดลองในหนอนไหมและหน Mice

6. การศกษาฤทธตานเชอแบคทเรยในสารสยอม

Fujiyuki และคณะ (2010) ไดท าการศกษาฤทธตานเชอแบคทเรย S. aureus ในโมเดลหนอนไหม

ในสารสยอมและมฤทธตานเชอแบคทเรยจ านวน 13 สาร ผลการศกษาพบวามเพยง Rifampicin ทมฤทธ

รกษาในหนอนไหมและมคา ED50 และคาครงชวตทคลายในสตวเลยงลกดวยนม สวนอก 12 สาร พบวาไมม

ฤทธตานเชอแบคทเรยเมอทดสอบในหนอนไหม ดงนนทางFujiyuki และคณะจงท าการศกษาหาสาเหต

ดงกลาว และพบวาเกดจากปญหาของความเปนพษและเรองของเภสชจลนศาสตร เชน Amidol, Pyronin G

และ Safranin ยงไมแสดงฤทธในหนอนไหมเนองจากมความเปนพษตอหนอนไหม, Fuchsin basic และ

ห น า | 39

methyl green พบวาปรมาณสารในเลอดของหนอนไหมลดลงอยางรวดเรว ซงคาดวาเปนเพราะไมคงตวใน

เลอด hemolymph นอกจากนสาร CBB R250, CBB G250, cresyl blue และ nigrosin ไมมฤทธในหนอน

ไหม ถงแมเมอวดปรมาณสารในกระแสเลอดพบวามปรมาณสงกวาคา MIC กตาม ซงคาดวาเปนผล

เนองมาจากสารดงกลาวจบกบพลาสมาโปรตนในหนอนไหม และปรมาณของสารในรปอสระ (Free

compound) มปรมาณนอยมากเกนจะสามารถมฤทธตานเชอจลชพได ซงแสดงใหเหนถงผลของพลาสมา

โปรตนของหนอนไหมตอการกระจายของยาในหนอนไหมมผลลดประสทธผลของยาได ซงมลกษณะท

คลายคลงกบในสตวมกระดกสนหลงเชนกน

ดงนนสารทมฤทธตานเชอทด แตไมมฤทธหากมการจบกบพลาสมาโปรตน จงสามารถตรวจพบ

เจอไดในชวงตนของการคดสรรยา จงคาดวาหนอนไหมจะสามารถน ามาเปนโมเดลทดไดเนองจากสามารถ

ดเรองของเภสชจลนศาสตรไดตงแตชวงแรกของการคดสรรหายาใหม ซงนอกจากจะมคาใชจายทต าแลว ยง

ไมมปญหาเรองจรรยาบรรณสตวทดลองเชนกน

ตารางท 13 แสดงคาจากการทดสอบในสารทง 13 ชนดและ vancomycin

ตารางท 14 คา MIC และความเขมขนของสารยอมสในเลอดหนอนไหมหลงให 25% plasma

และ BSA 25 mg/ml

ห น า | 40

ตารางท 15 ความเขมขนของสารตางๆ (µg/larvae) ในเลอดหนอนไหมหลงการฉด Plasma, BSA

ขอมลแสดงคา MIC และ ความเขมขนของสารในเลอดหนอนไหม โดยวด

หลงจากฉดส( 250 µg/larvae fuchsin basic, 750 µg/larvae methyl green, 185

µg/larvae CCB R250, 250 µg/larvae CCB G250, 400 µg/larvae cresyl blue,

450 µg/larvae nigrosin )ไปแลวสองวน

ห น า | 41

บทท 4

บทสรป จากการศกษาเกยวกบหนอนไหมในการน ามาใชเปนโมเดลในการทดสอบเบองตน ซงมขอดคอ

สามารถลดตนทนคาใชจายได และไมมปญหาในเรองของจรรยาบรรณสตวทดลอง นอกจากนยงเปนสตว

ไมมกระดกสนหลงทมขนาดคอนขางใหญ จงสามารถจะฉดปรมาณสารทแมนย าเขาสตวหนอนไหมได

โดยตรง ซงเปนขอไดเปรยบกวาแมลงหวหรอนมาโทดซงมขนาดเลกมาก นอกจากนยงมขอดเนองจาก

สามารถใหไดทงทางเลอดและทางล าไส

โดยโมเดลทเรมมการน ามาศกษาน าหนอนไหมมาใช ยกตวอยางเชน การน ามาใชในการทดสอบ

ฤทธตานเชอจลชพ, การศกษาเรองของเภสชจลนศาสตรดานการดดซมของยา, การดความเปนพษของสาร,

การศกษากลไกการออกฤทธของยาตอ Glutamic receptor, ศกษา bacterial virulence genes, การศกษาถง

ความสามารถในการกระตนภมคมกน และการน าหนอนไหมมาใชเปนโฮสตในการสรางโปรตน เปนตน ซง

ผลทไดจากการทดลองสวนมากมความสอดคลอยและคลายคลงกบผลการทดลองในสตวเลยงลกดวยนม

ดงนนจงมความเชอวาหนอนไหมจะสามารถน ามาใชในการทดลองเบองตนกอนทจะลงลกไปศกษาใน

สตวทดลอง เพอเปนการจ ากดคาใชจาย คดแยกสารทไมมฤทธออกไปกอนทจะไปศกษาตอในขนตอน

ตอไป รวมถงลดปรมาณของสตวทดลองทตองน ามาใชศกษาทดลองในขนถดไป

อยางไรกตามขอมลผลการทดลองของหนอนไหมยงคงตองท าการศกษาเพมเตมอกมาก เนองจาก

ยงคงมการศกษานอย และยงตองการขอมลในการยนยนสนบสนนผลทไดจากการทดลองในหนอนไหมอก

มาก ซงหากเมอมการศกษาหาขอมลทมากพอวาผลการทดลองทไดมความคลายคลงกบในมนษย ในอนาคต

หนอนไหมกอาจจะสามารถน ามาใชเปนโมเดลทมประสทธภาพอกโมเดลหนงในการทดสอบเบองตน

กอนทจะกาวขามไปท าการศกษาในสตวเลยงลกดวยนมตอไป

ห น า | 42

เอกสารอางอง

Asami Y, Horie R, Hamamoto H and Kazuhisa S. Use of silkworms for identification of drug candidates having appropriate pharmacokinetics from plant sources. BMC Pharmacology. 2010;10(7):1-6.

Barman T.K, Arora P, Rao M, Bhadauriya T and Upadhyay D.J. Utilization of Bombyx mori larvae as a surrogate animal model for evaluation of the anti-infective potential of oxazolidinones. Japanese Society of Chemotherapy and The Japanese Association for Infectious Diseases. 2008;14:166–169.

Fujiyuki T, Imamura K, Hamamoto H and Sekimizu K. Evaluation of therapeutic effects and pharmacokinetics of antibacterial chromogenic agents in a silkworm model of Staphylococcus aureus infection. Drug Discoveries & Therapeutics. 2010; 4(5):349-354.

Hamamoto H, Kurokawa K, Kaito C, Kamura K, Razanajatovo I.M, Kusuhara H, et al. Quantitative Evaluation of the Therapeutic Effects of Antibiotics Using Silkworms Infected with Human Pathogenic Microorganisms. Antimicrobial agents and Chemotherapy. 2004; 774–779.

Hamamoto H, Kamura K, Razanajatovo IM, Murakami K, Santa T, Sekimizu K. Effects of molecular mass and hydrophobicity on transport rates through non-specific pathways of the silkworm larvae midgut. International Journal of Antimicrobial Agents. 2005; 26:38-42.

Hamaoto H, Narushia K, Horie R, Sekimizu K. Silkworm as a model animal to evaluate drug candidate toxicity and metabolism. Comparative Biochemistry and Physiology. 2009; 149:334–339.

Ishii K, Hamamoto H, Sasaki T, Ikegaya Y, Yamatsugu K, Kanai M, et al. Pharmacologic action of Oseltamivir on the nervous system. Drug Discov Ther. 2008;2(1):24-34.

Ishii K, Hamamoto H, Kamimura M and Sekimizu K. Activation of the Silkworm Cytokine by Bacterial and Fungal Cell Wall Components via a Reactive Oxygen Species-triggered Mechanism. The Journal of Biological Chemistry. 2008; 283(4):2185-2191.

Kaito C, Akimitsua N, Watanabe H and Sekimizua K. Silkworm larvae as an animal model of bacterial infection pathogenic to humans. Microbial Pathogenesis. 2002;32:183–190.

Kaito C, Kurokawa K, Matsumoto Y, Terao Yutaka, Kawabata S, Hamada S, et al. Silkworm pathogenic bacterial infection model for identification of novel virulence genes. Molecular Microbiology. 2005; 56(4):934-944.

ห น า | 43

Kaito C and Sekimizu K. A silkworm model of pathogenic bacterial infection. Drug Discov Ther. 2007;1(2):89-93.

Kato T, Kajikawa M, Maenaka K, Park EY. Silkworm expression system as a platform technology in life sciencs. Appl Microbiol Biotechnol. 2010; 85:459-470.

Motohashi T, Shimojima T, Fukagawa T, Maenaka K, Park EY. Efficient large-scale protein production of larvae and pupae virus bacmid system. Biochemical and Biophysical Research Communication. 2005;326:564-569.

Niwa R, Matsuda T, Yoshiyama T, Namiki T, Mita K, Fujimoto Y, et al. CYP306A1,a Cytochrome P450 Enzyme, Is Essential for Ecdysteroid Biosynthesis in the Prothoracic Glands of Bombyx and Drosophila. The Journal of Biological Chemistry. 2004; 279(34): 35942-35949.

Orihara Y, Hamamoto H, Kasuga H, Shimada T, Kawaguchi Y and Sekimizu K. A silkworm–baculovirus model for assessing the therapeutic effects of antiviral compounds: characterization and application to the isolation of antivirals from traditional medicines. Journal of General Virology. 2008;89:188–194.

Sekimizu K, Larranaga J, Hamamoto H, Sekine M, Furuchi T, Katane M, et al. D-Glutamic Acid-Induced Muscle Contraction in the Silkworm, Bombyx mori. J. Biochem. 2005; 137: 199-203.

Sekimizu N and Ogata Y. Intellectual property strategies for university spinoffs in the development of new drugs. Drug Discov Ther. 2009; 3(5):193-199.

Tan M, Miklos SM, Ausubel FM. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Microbiology. 1999;96:715-720.

Uchida R, Iwatsuki M, Kim YP, Ohte S, Omura S and Tomoda H. Nokomycin, new antibiotics discovered in an in vivo-mimic model using silkworm larvae. l:Fermentation, isolation and biological properties. The Journal of Antibiotics. 2010; 63: 151-155.

Uchida R, Iwatsuki M, Kim YP, Ohte S, Omura S and Tomoda H. Nokomycin, new antibiotics discovered in an in vivo-mimic model using silkworm larvae. ll: Structure elucidation. The Journal of Antibiotics. 2010; 63: 157-163.