Yersinia ViraBlot ® Диагностический набор для определения lgG, IgAМетодика вестерн-блоттинга для обнаружения IgG-или IgA-антител против плазмид-кодированных секреторных белков патогенных штаммовYersinia в человеческой сыворотке для диагностики артрита.Yersinia ViraBlot9 использует клиническую чистую культуру, изолированную из штаммов Yersinia enterocolitica. Этот антиген гарантируетоптимальную чувствительность и специфичность метода. Каждая мембранная полоска имеет интегрированную систему контроля с контролями дляфункциональной и конъюгированной специфичности. Каждый набор содержит одну полоску положительного контроля (маркировка PC YS).

I Yersinia ViraBlot ® ® IgG диагностический набор 50 испытаний Номер изделия: V-YSBGOKYersinia ViraBlot ® ® IgA диагностический набор 50 испытаний Номер изделия: V-YSBAOKИсследуемый образец 20 мкл сывороткиВремя проведения теста 90 минутХранение/Стабильность около 12 месяцев при 2-8 °C

Компоненты Комплекта50 полосок Полоски с антигеном, полоски нитроцеллюлозы с системой контроля и Yersinia специфическими антигенами в

аналитической секции;код полоски: YS, пронумерованы от 1 до 50

9 мл Конъюгат щелочной фосфатазы с антителами против человеческого IgG или IgM, 10-кратный концентрат100 мл Буфер для разведения/промывки, 10-кратный концентрат1 упаковка Порошок для разведения/промывки (5 г)90 мл Хромоген/субстрат, раствор готовый к использованию1 экз. Инструкции по использованию Yersinia ViraBlot ® диагностического набора для определения lgG, IgM2 экз. Yersinia ViraBlot ® протокол оценки lgG, IgA1 экз. Набор темплат, комплект-специфический, с полоской положительного (IgG) контроля(PC YS) для локализации полосы.

Буфер для разведения/промывки, порошок для разведения/промывки и хромоген/субстрат раствор взаимозаменяемы между различнымитестами ViraStrip и Virablot.Дополнительно в наличии:

0,55 мл Yersinia lgG положительный контроль человеческая сыворотка, готовая к использованию (Номер изделия: V-YSBGPK)

0,55 мл Yersinia lgG, пороговый контроль человеческая сыворотка, готовая к использованию (Номер изделия V-YSBGCO)

0,55 мл Yersinia IgA положительный контроль человеческая сыворотка, готовая к использованию (Номер изделия: V-YSBAPK)

0,55 мл Yersinia IgA пороговый контроль человеческая сыворотка, готовая к использованию (Номер изделия: V-YSBACO)

0,55 мл Yersinia lgG, IgM, IgA отрицательныйконтроль

человеческая сыворотка, готовая к использованию (Номер изделия:VYSBPNK)

9 мл Конъюгат щелочной фосфатазы сантителами козы против человеческогоlgM, 10-кратный концентрат, жидкий

(Номер изделия: V-UVNMKI)

Хранение и стабильность реактивовПолоски с антигенами: Полоски в закрытых пакетах устойчивы доистечения срока годности, если хранятся при 2 - 8°C. Плотнозакрывать пакеты с неиспользованными полосками.Конъюгат 10-кратный концентрат: устойчив до даты истечениясрока годности, если хранится при 2-8°C.Рабочие растворы: использовать немедленно.Буфер для разведения/промывки: концентрат и порошок:устойчивый до даты истечения срока годности, если хранится при2 - 8°C.

Рабочий раствор буфера: в течение 2 недель пригоден киспользованию, если хранится при 2 - 8°C. Рабочий раствор буфераможет быть сохранен в течение более длительного времени взамороженном состоянии.Хромоген/субстрат раствор: устойчив до истечения срокагодности, если хранится при 2 - 8°C. Хранить в темноте!

Подготовка реактивов и образцовАдаптировать все компоненты к комнатной температуре (20-25°C)перед использованием.Полоски с антигеном:Тщательно отделите требуемое число полос при помощи пинцета.Касайтесь полос с пинцетом только в месте метки.Буфер для разведения/промывки рабочий раствор:Чтобы подготовить рабочий раствор буфера, растворите 10-кратныйконцентрат 1:10 дистиллированной водой (концентрат 100 мл + 900мл дистиллированная. вода), и добавьте порошок дляразведения/промывки полностью до растворения. Поместитерабочий раствор буфера на 10 - 15 минут на магнитную мешалку, pH= 7,5 + 0,1.

Рабочий раствор конъюгата:Растворите необходимое количество 10-кратного концентратасогласно таблице 1 в течение первой промывки ( шаг 7 проведениетеста).Другие реактивы: готовы к использованию.Образцы пациента:Используйте 20 мкл неразведеной сыворотки на один тест.Дополнительно доступные контроли:Используется 100 мкл каждого из контролей :порогового,положительного и отрицательного на одну серию испытаний внеразведенном виде.

Таблица 1:Приготовление рабочего раствора конъюгатаКолич.полос

Разбавитель/промывнойРабочий раствор

Конъюгатконцентрат

Конечныйобъем

1 1,35 мл + 0,15 мл 1,5 мл2 2,70 мл + 0,30 мл 3,0 мл3 3 4,05 мл + 0,45 мл 4,5 мл4 5,40 мл + 0,60 мл 6,0 мл5 6.75 мл + 0.75 мл 7,5 мл6 8,10 мл + 0,90 мл 9,0 мл7 9,45 мл + 1,05 мл 10,5 мл8 10,80 мл + 1.20 мл 12,0 мл9 12,15 мл + 1,35 мл 13,5 мл

10 13,50 мл + 1,50 мл 15,0 мл11 14,85 мл + 1,65 мл 16,5 мл12 16,20 мл + 1,80 мл 18,0 мл13 17,55 мл + 1,95 мл 19.5 мл14 18,90 мл + 2,10 мл 21,0 мл15 20,25 мл + 2,25 мл 22,5 мл16 21,60 мл + 2,40 мл 24,0 мл17 22,95 мл + 2.55 мл 25,5 мл18 24,30 мл + 2,70 мл 27,0 мл19 25.65 мл + 2,85 мл 28,5 мл20 27,00 мл + 3,00 мл 30.0 мл21 28,35 мл + 3,15 мл 31,5 мл22 29,70 мл + 3,30 мл 33,0 мл23 31,05 мл + 3,45 мл 34,5 мл24 32,40 мл + 3,60 мл 36,0 мл25 33,75 мл + 3,75 мл 37,5 мл26 35,10 мл + 3,90 мл 39,0 мл27 36,45 мл + 4,05 мл 40,5 мл28 37,80 мл + 4,20 мл 42,0 мл29 39,15 мл + 4,35 мл 43,5 мл30 40,50 мл + 4,50 мл 45,0 мл31 41.85 мл + 4,65 мл 46,5 мл32 43,20 мл + 4,80 мл 48,0 мл33 44,55 мл + 4,95 мл 49,5 мл34 45,90 мл + 5,10 мл 51,0 мл35 47,25 мл + 5,25 мл 52,5 мл36 48,60 мл + 5,40 мл 54,0 мл37 49,95 мл + 5,55 мл 55,5 мл38 51,30 мл + 5,70 мл 57,0 мл39 52,65 мл + 5,85 мл 58,5 мл40 54,00 мл + 6,00 мл 60,0 мл41 55,35 мл + 6,15 мл 61,5 мл42 56,70 мл + 6,30 мл 63,0 мл43 58,05 мл + 6,45 мл 64,5 мл44 59,40 мл + 6,60 мл 66,0 мл45 60,75 мл + 6,75 мл 67,5 мл46 62,10 мл + 6,90 мл 69,0 мл47 63,45 мл + 7,05 мл 70,5 мл48 64,80 мл + 7,20 мл 72,0 мл49 66,15 мл + 7,35 мл 73,5 мл

Проведение теста.1. Ополоснуть инкубационный поднос буфером дляразведения/промывки и декантировать раствор.

Маркировать подносы несмываемым маркером. Удалятьзагрязнения кратким ополаскиванием буфером.

2. Разместить по одной полоске на каждый тест в каналы Разместить полоски в каналы подноса инкубации, одна полоска длякаждого образца, соответственно для контроля, номером вверх.Используйте тупой пинцет.

3. Заполнить, каждый канал буфером 1,5 мл; выдержать 5 минут прикомнатной температуре на платформе шейкера.

Визуально удостоверьтесь, что полоски полностью смочены и неплавают частично на поверхности буфера. Используйте платформушейкера с частотой колебаний 40 циклов/мин.

4. Добавить 20 мкл образца пациента, соотв. 100 мкл каждогоконтроля.

Пипеткой наносите контроль и образцы непосредственно на номерполос, в то время как происходят колебания платформы.

5. Выдержать при колебаниях в течение 30 минут при комнатнойтемпературе.6. Декантировать жидкость Полосы прилипают к подносу инкубации. Удалите оставшуюся

жидкость тщательным осушением подноса инкубациифильтровальной бумагой

7.Промывка 3раз по 5 минут: добавьте 1,5 мл буфера дляразведения/промывки, выдержите 5 мин., декантируйте жидкостьполностью.

Промойте платформу шейкера. Во время промывки готовят рабочийраствор конъюгата согласно таблице растворения конъюгата.Осушите инкубационный поднос на фильтровальной бумаге, чтобыудалить оставшуюся жидкость.

8. Пипеткой нанести 1,5 мл рабочего раствора конъюгата в каждыйканал.

Визуально удостоверьтесь, что полоски полностью смочены ичастично не плавают на поверхности буфера.

9. Выдержать в течение 15 минут, при колебаниях, при комнатнойтемпературе.10.Декантировать жидкость. Удалите оставшуюся жидкость, тщательно осушая поднос

инкубации на фильтровальной бумаге.11. 3 x кратная промывка, как описано в пункте 7.12. Добавить дистиллированную воду 1,5 мл.13. Выдержать в течение 1 минуты, при колебаниях при комнатнойтемпературе.14. Декантировать жидкость. Удалите оставшуюся жидкость, тщательно осушая поднос

инкубации на фильтровальной бумаге.15. Добавить 1,5 мл раствора хромоген/субстрат. Визуально удостоверьтесь, что полоски полностью смочены и не

плавают частично на поверхности хромоген/раствора субстрата.16. Инкубировать на платформе шейкера: Yersinia lgG: 5-15 минут,Yersenia IgA: 5-15 минут.

Остановите реакцию, когда пороговый контроль (cut off) полоскистановится видим. Внимание:Превышение срока инкубации приводит к появлению фоновыхпятен.Пороговый контроль полосы lgG: 35 kD / аналитическая секцияПороговый контроль полосы IgM: 35 kD / аналитическая секция.

17.Остановить реакцию, декантируя жидкость. Удалите оставшуюся жидкость, тщательно осушая подносинкубации на фильтровальной бумаге.

18. Трехкратная промывка дистиллированной водой 1,5 мл. Вне времени инкубации.19. Высушить полоски для интерпретации результатов Удалите влажные полоски из каналов, используя пинцет. Разместите

влажные полоски на полотенце из фильтровальной бумаги ивысушите на воздухе перед интерпретацией данных.

Принцип теста.При помощи Yersinia ViraBlot ® Yersinia-специфические антителамогут быть определены в человеческой сыворотке.Специфические антитела связываются с фиксированным антигеномна полоске в течение инкубации сыворотки. Конъюгат щелочнойфосфатазы связывается с этим комплексом антител -антиген втечение инкубации конъюгата. Щелочная фосфатаза реагирует схромоген/субстратом и окрашивает комплекс антиген-антитело наполоске в фиолетовый цвет.

Процедуры промывки между инкубацией с сывороткой, конъюгатоми хромоген/субстратом удаляют непрореагировавшие реактивы.Иммуноблот с интегрированной системой контроля:Зеленая линия разделения делит полосу на контрольную секцию ианалитическую секцию. Контрольная секция включает контрольсыворотки, три конъюгат-контроля (lgG, IgA, IgM) и пороговыйконтроль. Аналитический раздел включает электрофоретическиотделенные антигены Yersinia.

Оценка1. Подготовить протоколоценки:

Регистрируйте данные в протоколе оценки. Приклейте или закрепите пленкой полоски на протокол. Разместитезеленую линию разделения точно на напечатанную линию разделения в протоколе.

2.Действительностьтеста:

Тест считается действительным, если полосы функционального контроля, конъюгат контроля и пороговогоконтроля становятся ясно видимыми на каждой полоске. Если нет реакции по крайней мере одного из этихконтролей, тест недействителен и должен быть проведен повторно при точном соблюдении инструкций.Не оценивайте не отвечающие требованиям методики полоски.

3. Проверка комплектатемплат (матриц)

Каждый Yersinia ViraBlot ® комплект включает комплект-специфический набор матриц (темплат) свыраженной полоской положительного контроля (маркировка PC YS). Этот шаблон показывает локализациюполосы. Номера набора матриц (темплат) и полосок с антигенами должны быть идентичны

4. Оценка образцовпациента.

Выровняйте линии разделения полоски пациента и полоски положительного контроля. Позиция полосыпоказана на полоске положительного контроля. Оцените полосы на полосках пациента и отметьте их впротоколе. Не определенные полосы не должны оцениваться.

5.Оценка полос спомощью пороговогоконтроля:

В соответствии с лабораторных качественными методиками, пороговый контроль должен использоваться длякаждой серии испытаний (11). Пороговый контроль для Yersina kgG и IgA-Virablot ® - полоса 35 kD (YopD).Интенсивность полосы порогового контроля указывает границу для оценки полосы.Полосу считают четкой, если ее интенсивность равна или выше чем интенсивность порогового контроля.Четкие полосы отмечены знаком X в протоколе.Полосу считают нечеткой, если ее интенсивность меньше чем интенсивность полосы порогового контроля.Нечеткие полосы отмечены знаком (X) в протоколе.Только четкие полосы должны оцениваться.Полосы с более низкой интенсивностью, чем полоса порогового контроля, не должны оцениваться. Нечеткиеполосы могут указывать на низкие титры антител.

Интерпретация результатовПолосы нужно рассмативать как симптомы заболевания. Для заключительного клинического диагноза все результаты этого и других испытанийдолжны быть коррелированы с клинической историей, эпидемиологическими данными и другими данными, доступными лечащему врачу. Антигены51 kD (YopH), 44 kD (YopM), 41 kD (YopB), 37 kD (LcrV), 35 kD (YopD), 33 kD (YopN), 23 kD (YopE) характеризованы как специфические дляYersinia. Дополнительные полосы, не характерные, могут появиться, но они не оцениваются lgG Yersinia ViraBlotИдентифицированные полосы / kD Результат ИнтерпретацияНет полос или нет специфических полос Отрицательный Не обнаружены IgG-антитела против

разновидностей Yersinia. В случаеклинически обоснованного подозрения наинфекцию, вызванную Yersinia: проверьтедополнительно для IgM-и IgA-антитела ивторой образец на IgM-и IgA-антитела через3-4 недели.

Одна четкая полоса от: 51,44,41,37,35, 33или 23 kD.

Сомнительный Специфические антитела против Yersiniaобнаружены. Признак инфекции Yersinia.Следует произвести дополнительноеиспытание на IgM-и IgA.

По крайней мере две четких полосы от:51,44,41,37,35, 33 или 23 kD.

Положительный Обнаружены IgG-антитела противразновидностей Yersinia. Инфекция Yersiniaвесьма вероятна. IgG-антитела могутсохраняться в течение многих лет.

IgA Yersinia ViraBlot"Идентифицированные полосы / kD Результат ИнтерпретацияНе обнаружено полос или естьнеспецифические полосы.

отрицательный IgA-антитела против разновидностей Yersinia не обнаружены.

Одна четкая полоса от 51,44,41,37,33 или 23 kD.

сомнительный Специфические антитела против Yersinia обнаружены. Признакинфекции Yersinia.Испытание повторного образца дополнительно для IgM-антителчерез 3-4 недели.

Изолированная явная полоса от 35kD или не менее двух полос от 51,44,41,37,35, 33 или 23 kD.

положительный Обнаружены IgA-антитела против разновидностей Yersinia.Инфекция Yersinia весьма вероятна. Около 90% пациентов сYersinia-артритом имеют антитела к 35 kD протеину.

Характеристики Yersinia ViraBlot ® полосМолекулярный вес Антиген Замечания / Специфика Антител51 kD YopH Протеин-тирозин-фосфатаза, вовлеченный в трансдукцию сигнала, в комбинации с YopE

блокирующий фагоцитарную-способность макрофагов; цитотоксин (8).44 kD YopM Связан с человеческим a-тромбином (9).41 kD YopB Трансмембранный белок, поро-формирующий, транспортировка YopE и YopH (16), TNF-а-

подавляющий (10).37 kD LcrV Регулирование yop-генов, важная роль в транспортировке, активная и пассивная защита

вакцинацией против инфекции (11).35 kD YopD Трансмембранный белок, транспортирование YopE и YopH (12).33 kD YopN Ca2 +-сенсор, Yop-регулирование (13).23 kD YopE Ингибирование фагоцитоза путем деполимеризации нитей актина. (10).

Клинические проявления Yersinia антител1. IgG-антитела появляются в случае Yersinia- артрита ихронического энтерита на высоком уровне (1,14). В ранней стадиийерсиниоза они часто обнаруживаются только на низком уровне (1,14). В случае подозреваемой недавней инфекции должно бытьпроверено наличие IgM-и IgA-антител, повторный образец долженбыть проверен некоторое время спустя. IgG-антитела сохраняютсячасто более пяти лет, но по меньшей мере пять месяцев с началаболезни (6, 15). IgG-антитела продуцируются против всехсекреторных белков Yersinia, но наиболее часто против YopE (23kD), YopD (35 kD), YopD (41 kD) и YopH (51 kD) (1, 14).2. IgM-антитела появляются в случае острого йерсиниоза навысоком уровне и сохраняются в течение 1-3 месяцев с началаболезни (6, 15). В случае йерсиниоза с последующимиосложнениями (реактивный артрит и хронический энтерит) IgMобнаруживается редко (6, 15). В некоторых редких случаях IgMможет быть обнаружен на низком уровне, в более поздний период,или не обнаруживаться вообще.

3. IgA-антитела появляются в ранней стадии йерсениоза на высокомуровне (1,14) . IgA-реакция направлена на YopD (35 kD) в 90 %случаев реактивного артрита, связанного с Yersinia (1, 2, 14). IgA-антитела против YopE (23 kD), YopD (35 kD) и YopB (41 kD)обнаруживаются в случае связанного с Yersinia хроническогоэнтерита. IgA-антитела сохраняются в случае йерсениоза споследующими осложнениями обычно годы, в случае йерсениозабез последующих осложнений- обычно в течение несколькихмесяцев (3, 6, 15). Лечение антибиотиками приводит к сильномуснижению IgA-уровня (5).4. Антитела против патогенных штаммов Yersinia (Y. enterocolitica,Y. pseudotuberculosis и Y. pestis) обнаруживаются с Yersinia ViraBlot® (1).5. Лечение медикаментами и иммуноглобулинами может привестик неопределенным реакциям антител (7).

Параметры выполненияВсесторонняя совокупность данных по аналитической и диагностической чувствительности и специфичности, воспроизводимости испытанияпредоставляется при запросеПредупреждения и предосторожности

1. Все человеческие компоненты сыворотки в наших изделиях былипроверены на, отрицательность для ВИЧ - и HCV-антител и Hbs-Antigene. Однако все человеческие компоненты комплекта и такжеобразцы пациентов нужно считать потенциально инфекционными иобращаться с соответственными проедосторожностями..2. Не набирать пипетку ртом.3. Носить одноразовые перчатки при работе.4. Не есть, не пить и не курить в рабочей зоне.5. Конъюгат содержит азид натрия 0,1 %, контроли и буфер дляразведения/промывки содержит 0,02 % тимеросал: Внимание:вреден для здоровья. Промыть большим количеством

воды после контакта с кожей или глазами. Ядовит при попаданиивнутрь! (см. листы данных о безопасности).6. Раствор хромоген/субстрата содержит BCIP и нитросинийтетразолий. Избегайте контакта с кожей и глазами. В случаеконтакта с кожей и глазами промыть большим количеством воды.7. Образцы и все потенциально загрязненные материалы должныбыть дезактивированы, используя установленные лабораторныеметоды, например 20 минут автоклавирования при 121,5°C. Жидкиеотходы смешать с гипохлоритом натрия в окончательнойконцентрации 1%-гипохлорита натрия. Выдержать 30 минут дляокончательной дезинфекции.

Литература:1 CREMER, J., и. ал., Electrophoresis (1993). 2. STAHLBERG, T, и. др., Ann Rheum. Dis. (1989). 3. DE KONING, и другие., J. Infect.Dis. (1989). 4.BOTTONE, Clin. Microbiol. Rev. (1997). 5. HOOGKAMP-KORSTANJE, и другие., Инфекция (1992). 6. GRANSFORS, и другие., J. Infect.Dis. (1980). 7.ТОМАС, L, Labour und Diagnostica, Med. Verlagsgesellschaft Марбург (1995). 8. ZHANG, Z.Y., и другие., J. Biol. Chem. 267 (33):23759-23766 (1992). 9.REISNER, B.S., и другие., Infect. Immun. 60:5252-5262 (1992). 10. BEUSCHER, H.U., и другие., Infect. Immun. 63 (4): 1270-1277 (1995). 11.ROGGENKAMP, A., и другие., Infect. Immun. 65 (2):446-451 (1997). 12. ROSQUIST, R., и другие., Mol. Microbiol. 1:657667 (1990). 13. VIITANEN, A.-M, и другие., Mol. Microbiol. 172:3152-3162 (1990). 14. STAHLBERG, T, и другие., J. Med. Microbiol., 24 (2), J. Infect/Dis. 163:409-412 (1991). 16.FOSBERG.A и другие., Тенденции в Микробиологии 2 (1): 14-19 (1994). 17. WILSKE, и другие., MIQ, Urban и Fischer, 2000. 18. RILI-BAK: Bak-Richtlinie zur Qualitatssicherung quantitativer laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen, (1.1.2002), www.bundesaerztekammer.de <http: //www.bundesaerztekammer.de>YSALEN.doc/Eng/12.12.03© декабрь 2003 Copyright Viramed Biotech AG