Глобулист - -Отличительное качество ученого — энтузиазм.

У.Л.Брэгг Лауреаты Нобелевских премий 1962 года после церемонии награждения. Слева направо: Морис

олекулярная биология ПОКОИТ- Уилкинс, Макс Перуц, Фрэнсис Крик, Джон Стейнбек ся на двух китах - нуклеино- (по литературе), Джеймс Уотсон, Джон Кендрю. вых кислотах и белках. Поэто- (Л.Д.Ландау, которому присудили премию по физике,

му кажется справедливым, что в 1962 находился в то время в московской больнице, году Нобелевская премия была вручена где награду ему вручил посол Швеции в СССР.) и открывателям ДВОЙНОЙ спиралиДжей-

К А0

I V \в MV каже

мсуУотсону Фрэнсису Крику и Морису Уилкинсу(по медицине), и впервые оп­ределившим на атомном уровне строе- жизнь изучению сложного олигомерно- И он счел возможным — без ведома ние глобулярных белков МаксуПеруцуи го белка гемоглобина. Любопытно, что Фрэнклин - ознакомить с веданными Джону Кендрю (по химии). главное достижение Перуца в кристал- Фрэнсиса Крика, писавшего в то время

Уотсон и Крик занимались исследо- лографии, ставшее залогом будущих под руководством Перуца диссертацию ваниемДНКв английском Кембридже, успехов (метод изоморфного замещения о гемоглобине и попутно занимавшего-в Кавендишскойлаборатории, где еще для белков), приходится на 1953 год, ся ДНК. Крик уже достаточно хорошо ранее начали трудиться Перуц с Кенд- когда была предложена и модель ДНК; разбирался в рентгенографии, чтобы рю. Через эту лабораторию в те же Перуц называл его годом чудес. суметь извлечь из них важную инфор-годы прошли еще несколько ученых, Этот ученый не только определил трех- мацию о строении остова ДНК. Впослед-получивших впоследствии высшую на- мерную структуру гемоглобина, но и рас- ствии он признал, что отчет Фрэнклин граду: Фредерик Сенгер (он быллау- крыл происходящие в нем электронные позволил ему с Уотсоном существенно реатомдважды - в 1958 году за рас- и конформационные изменения, разоб- продвинуться в решении проблемы, од-крытие структуры инсулина и в 1980-м рался в его внутримолекулярной дина- нако Розалинда, видимо, так до конца за метод секвенирования ДНК); Аарон мике. Он высказал гипотезу, что ивдру- своих дней (она умерла в 1958 году в Клуг(1982) - за электронную микро- гих белках при связывании лигандов идут возрасте 37лет) и не узнала, какую роль скопию кристаллов и изучение нуклео- аналогичные процессы и что они могут сыграла ее блестящая работа. протеиновых комплексов; Сидней Брен- лежать в основе ферментативного ката- В настоящее время рентгенострук-нер (в прошлом году) - за работы по лиза. (Нужно отметить, что некоторые турный анализ макромолекул постав-генетике развития нематоды. выводы Перуца относительно конформа- лен на поток, и уже известно строение

В своей нобелевской лекции Перуц на- ционных перестроек гемоглобина пред- многих тысяч разных белков. Однако в помнил, что сорок лет назад в Стокгольм восхитил наш биофизик Л.А. Блюмен- 50-е годы, когда методики еще не были приезжал его учитель сэр Уильям Лоу- фельд, который в 1954 году защитил док- отработаны, оборудование оставалось ренсБрэгг, чтобы поблагодарить Швед- горскуюдиссертацию «Структура гемо- несовершенным, а компьютеры ипро-скую академию за высокую честь, ока- глобина и механизм обратимого присо- граммы к ним делали первые шаги, рас-занную ему, Лоуренсу, и его отцуУилья- единения кислорода.) шифровка крупной молекулы представ-му Генри -в 1915 году премией были А коллега Перуца Кендрю в 1957 году ляла собой очень сложную и трудоем-отмечены их заслуги в становлении рент- установил пространственное строение кую проблему, решить которую удава-геновской кристаллографии. Работы более простого (не имеющего четвер- лось немногим. Как писала Ходжкин, Брэггов открыли путь к изучению строе- тичной структуры, то есть состоящего из «всякая расшифровка и интересна, и ния молекул с помощьюХ-лучей одной субъединицы) родственника ге- скучна: интересно искать ключ шифра,

Правда, до сороковых годов метод моглобина - белка миоглобина, опре- еще более волнующ конечныйрезуль-рентгеноструктурного анализа применя- делив положения примерно 2500 его ато- тат, а в промежутке между ними — ог-ли только к достаточно простым, низко- мов. В нобелевской лекции Кендрю ска- ромная техническая работа, цифры, молекулярным соединениям, причем зал, что это только начало — «переднами цифры, цифры...». обычно лишь для подтверждения иуточ- возник берег огромного континента, Перуц в одном из своих эссе (недав­ней ия их структуры, уже установленной ожидающего своих первопроходцев». но издан сборник его статей «I Wish I У химическим путем. Но в 1944 году До- Косвенно Перуц повлиял и на собы- Made You Angry Earlier», повествующих роти Ходжкин в Оксфорде расшифрова- тия, приведшие к открытию двойной спи- о его коллегах и эпизодах из истории ла состоящий из 23 атомов пенициллин, рали ДНК. Дело в том, что в 1952 году науки) сочувственно процитировал сло-который химикам не поддавался; затем Розалинда Фрэнклин представила в Со- ва английского деятеля театра и кино она же справилась с витамином В12 со- вет медицинских исследований отчет о Н.Кауарда: «Работа - это удоволь-держащим 93 атома. своей работе, где содержались получен- ствие. Ничто так не увлекательно, как

После этого ученые стали пытаться оп- ные ею высококачественные рентгено- работа». Видимо, в таком отношении к ределять трехмерные структуры глобу- граммы волокон ДНК. Как член комис- своему делу и заключалась одна из лярных белков, и фундамент тут зало- сии по проверке научной деятельности причин его успехов. жил Джон Бернал (см. статью о нем в лаборатории, сотрудником которой была Ранее «Химия и жизнь» (1990, № 9) «Химии и жизни», 2002, № 1). Перуц Фрэнклин, Перуц имел доступ к этому опубликовала воспоминания Перуца продолжил его дело и посвятил свою документу. «Здесь было столько одаренных лю-

28

дей...». В них он кратко рассказал о первой половине своей долгой жизни в науке -до середины 60-хгодов. Уче-ный скончался 6 февраля прошлого года, и его старый друг и коллега Клуг написал посвященную Перуцу статью, опубликованную в «Science» 29марта 2002 года.

I ) Е

пийскпм

дин из основателей рентгено-вской кристаллографии белков Макс Перуц проработал в анг-

лийском Кембридже 65 лет, лишь с одним перерывом во время Второй мировой войны. Его исследования при­вели к первым в истории расшифров­кам трехмерной структуры глобулярных белков — миоглобина (Джон Кендрю), а затем и состоящего из четырех субъ-единиц гемоглобина (это сделал сам Перуц).

Сейчас каждый день в мире расшиф-ровывают два или три белка, и совре­менные рентгеноструктурные методы настолько мощны, что приложимы к сложным молекулярным комплексам и даже органеллам. Фундамент этих ус­пехов заложил Перуц, и его обычно считают классиком кристаллографии, однако определение координат атомов было для него не самоцелью, а лишь средством, позволяющим понять меха-низм работы белка. Поэтому прежде всего Перуц был химиком.

Макс Фердинанд Перуц родился в 1914 году в Вене, изучал химию в мест-ном университете. В 1936 году он при­ехал в Кембридж, чтобы готовить дис­сертацию под руководством Джона Бернала, который двумя годами ранее показал, что можно получать хорошие рентгеновские снимки кристаллов бел­ков, не высушивая их, то есть прямо в маточном растворе. Перуц непремен­но хотел решить какую-нибудь важную биохимическую проблему и выбрал ге-моглобин, который ответствен зады­хание. Хотя это большой и сложный

белок, но его можно было иметь в нуж-ном количестве, и он хорошо кристал­лизовался.

Вскоре Перуц получил прекрасные дифракционные картины гемоглобина, содержащие тысячи рефлексов, и это позволило руководителю Кавендишской лаборатории сэру Лоуренсу Брэггу до­быть для молодого исследователя грант Рокфеллеровского фонда. В 1940 году Перуц получил докторскую степень.

В то время, когда расшифровывали молекулы, содержащие примерно сто атомов, перспектива определить струк-туру белка, состоящего из нескольких субъединиц, каждая из которых имеет молекулярную массу 17 000 дальтон, казалась нереальной. Однако Брэгг понимал, что если Перуц справится с задачей, то это будет иметь огромное значение — по выражению Бернала, «приоткроет секрет жизни». Перуц одо­лел ее за двадцать два года напряжен­ной работы, в которой было все — и периоды, когда руки опускались от, ка-залось, непреодолимых технических трудностей, и вдохновенные идеи.

Его деятельность в Кембридже была прервана войной, когда Перуц как граж-данин Австрии был интернирован. Его отправили в Канаду и привлекли к рабо-те над секретным проектом создания плавучих ледяных полей, которые долж-ны были служить аэродромами для са­молетов, пересекающих Атлантику или охотящихся на вражеские субмарины. Задача Перуца состояла в разработке способа упрочнения льда путем напол­нения его древесной пульпой. Квалифи­кация Перуца в этом вопросе основыва-лась на том, что он увлекался альпиниз-мом и в 1938 году провел несколько месяцев высоко в горах, изучая строе­ние и рост ледяных кристаллов.

Однако проект был вскоре отменен, и Перуц вернулся к научной работе в Кембридже, к изучению гемоглобина. Кендрю стал его сотрудником в 1945

ПОРТРЕТЫ

году и занялся миоглобином, который похож на одну субъединицу гемоглоби­на (но не тождествен ей).

В классической работе 1946 года Пе-руцдоказал, что белковые молекулы ок-ружены слоем «связанной воды» —факт, который теперь кажется очевидным. А 1951 год принес ему огорчение —он про-пустил альфа-спираль, когда вместе с Кендрю рассматривал возможные кон-формации полипептидных цепей. Но как только статья Лайнуса Полинга об этом появилась, Перуц сразу проанализиро­вал соответствующие рентгенограммы и подтвердил наличие таких спиралей в белках.

В 1947 году в Кембридже было со­здано подразделение для изучения мо­лекулярной структуры биологических си­стем (позднее ставшее лабораторией молекулярной биологии), и Перуц воз­главил его, а Кендрю стал его членом. Вскоре к ним присоединился Фрэнсис Крик, в 1948 году—Хью Хаксли, в 51-м — Джим Уотсон, в 57-м —Сидней Бреннер; затем там начали работать Фред Сен-гер и автор этих строк. Лаборатория со­стояла из трех секторов: клеточной био-логии, структурных исследований, химии белков и нуклеиновых кислот; ими руко­водили соответственно Крик, Кендрю и Сенгер.

1953 году Перуц сделал свое глав-ное открытие в кристаллографии белков — решил для них «фазо­

вую проблему». В своей лекции 1939 года Бернал указал, что в принципе структура белка может быть раскрыта методом изоморфного замещения (вве-дения в него тяжелых атомов), который уже применяли для расшифровки ма­леньких органических молекул. Однако для белков этот подход все еще оста­вался нереализованным.

Суть проблемы заключалась вот в чем. Максимумы дифракционной кар­тины обладают различными интенсив-ностями, и их анализ позволяет найти распределение электронной плотности в кристалле; она выражается через так называемые структурные амплитуды, зависящие от числа электронов в ато­мах. Важно, что такие амплитуды — величины комплексные, то есть они характеризуются модулями и фазами. Чтобы определить строение молекулы, нужно знать и модули, и фазы, но диф-

29

ракционная картина непосредственно I о для Перуца это было только на- растворе изображается гиперболической дает лишь значения амплитуд. I 1 чало, поскольку построенная кривой, которая плавно растет, асимп-

Все же есть способ получить инфор- I I модель белка мало что говори- тотически приближаясь к пределу. мацию и о фазах. Если заменить в мо- ла о том, как он функционирует. Уче- А вот график подобной зависимости лекуле легкий атом на более тяжелый ному потребовались еще десять лет для гемоглобина S-образен, то есть (обычно металла), то он будет сильнее труда, чтобы достичь главной цели — имеет крутой участок и перегиб, что рассеивать Х-лучи, что скажется на понимания физического механизмаак- объясняется наличием четвертичной интенсивности пятен дифракционной тивности гемоглобина. структуры и взаимодействием субъеди-картины. И по их разности (для исход- Было известно, что функции миогло- ниц — в гемоглобине проявляют себя ного и измененного кристалла) можно бина и гемоглобина —обратимо связы- кооперативные свойства, так называе-определить фазы дифрагирующих волн. вать молекулярный кислород. Первый из мые «гем—гем-взаимодействия» (хотя В результате удается вычислить коор- них служит депо 02 в мышцах, запасая это нельзя понимать буквально, по-динаты тяжелого атома, а это шаг к его для последующего потребления скольку гемы сильно удалены друг от раскрытию всей структуры. Однако не- организмом; большие количества этого друга). Иначе говоря, поведение каж-обходимое условие применимости та- белка имеются у китообразных, прово- дой субъединицы зависит от того, в ка­кого подхода — полное сохранение дящих длительное время под водой. ких состояниях находятся другие гемы структуры кристалла при замещении Гемоглобин —белок эритроцитов, пе- белка —связали они кислород или нет. легких атомов на тяжелые. Многие эн- реносящий кислород от легких ко всем Сродство гема к 02 возрастает по мере зимологи полагали, что подобная за- тканям и органам, а также участвующий того, какдругие гемы присоединяют его мена исказит их нормальную форму; в обратном транспорте углекислоты. (положительная кооперативность). кроме того, по их мнению, вклад атома По форме гемоглобин похож на ша- Этот факт имеет глубокий физиоло-металла в общее рассеивание белком рик диаметром около 5,5 нм. Он со- гический смысл: если бы у гемоглоби-Х-лучей будет слишком слабым, чтобы стоит из четырех свернутых в глобулы на зависимость была такой же, как у его можно было наблюдать. цепей—двух альфа- (у человека по 141 миоглобина (гиперболической), то

Требовалось доказать, что метод бу- аминокислотному остатку в каждой) и лишь малая часть связанного им кис-дет работать и в случае белков. Присое- двух бета-цепей (по 146). Каждая из лорода отщеплялась бы в тканях —ведь динив атом ртути к цистеиновой группе субъединиц содержит простетическую изменение парциального давления 02 в гемоглобине и проведя сравнительный группу гема — полициклическую струк- в тканях относительно легких невели-анализ рентгенограмм, Перуцобнаружил туру, называемую протопорфирином, с ко. В результате организм задыхался изменения интенсивности пятен, но не которой координационно связан атом бы даже в атмосфере чистого кисло-их координат. Это говорило о том, что, железа (см. рис.). рода. А крутая часть S-образной кри-какон и надеялся, никаких деформаций Атомы Fe способны окисляться, от вой делает сродство гемоглобина к белка не происходит —ртутные произ- чего их предохраняет белковая часть кислороду чувствительным к малым водные кристаллизуются изоморфно с молекулы (глобин) — гемы упрятаны изменениям его концентрации. исходным белком. Значит, фазовая про- внутри глобул, они расположены как бы Вклад в этот процесс вносит также блема для белков может быть решена! в карманах. Тем не менее в легких мо- эффект Бора (его открыл датский фи-

Перуцполучил ряд кристаллов гемо- лекулярный кислород проникаете щели зиолог Христиан Бор, отец Нильса глобина, в которых атом тяжелого ме- глобул и связывается с темами (с каж- Бора), который проявляет себя в гемо-талла находился в разных местах мо- дым из четырех гемов по одной моле- глобине, но не в миоглобине. А заклю-лекулы. За четыре последующих года куле 02). Хотя молекулы кислорода не чается он в том, что на степень срод-он собрал и обработал тысячи фото- подвергаются там химическим превра- ства к кислороду влияют концентрации графических пластинок, что позволило щениям, теперь мы знаем, что проис- водородных ионов и углекислого газа. раскрыть полную трехмерную структу- ходящие в гемоглобине процессы сход- Они тоже могут присоединяться к ге-ру белка с разрешением 0,55 нм (см. ны с теми, что протекают в обычных и моглобину, причем между связывани-рис). А Кендрю тем временем добил- аллостерических ферментах с их элек- ем кислорода и этих лигандов суще-ся больших успехов в работе с мио- тронно-конформационными взаимодей- ствует обратная зависимость. В резуль-глобином —достиг разрешения 0,2 нм. ствиями (потому этот белок иногда на- тате в тканях, где повышена концент-

В феврале 1960 года Перуц и Кенд- зывают «почетным ферментом»). рация Н+ и С02, кислород легче высво-рю опубликовали в «Nature» свои ре- Какже происходит связывание кисло- бождается, тогда как в легких, где по-зультаты, и ученый мир наконец узнал, рода в легких и его высвобождение в вышено содержание 02, выделяется как выглядят эти важнейшие белки. В тканях? В случае миоглобина зависи- углекислота. 1962 году их достижения были отмече- мость степени насыщения белка кисло- Теперь все это хорошо известно, хотя ны Нобелевской премией. родом от парциального давления 02 в особенности работы гемоглобина про-

30

должают изучать, используя самые раз­ные биофизические методы, и в наши дни. Но Перуцу еще предстояло во всем этом разобраться.

А т 1x1 к V I т

4VRCTR

так, он понял, что связывание кислорода происходит коопера­тивно. Но как один гем может

чувствовать состояние других гемов, если они, согласно полученным Перу-цем данным, удалены друг от друга на 2,5 нм? Чтобы ответить на этот воп­рос, нужно было в первую очередь рас­шифровать с достаточно большим раз­решением обе основные информации гемоглобина — с присоединенными кислородами и без них— и провести их сравнительный анализ.

В 1970 году Перуц в основном спра­вился с этой задачей, еще несколько лет заняли доведение разрешения до 0,2 нм, а также устранение многих воз­никших противоречий. Изменения в четвертичной структуре при оксигена-ции оказались довольно большими, что дало основание Перуцу назвать гемо­глобин «молекулярными легкими» —бе­лок как бы дышит.

Далее он выяснил, что в дезоксиге-моглобине вся структура стабилизиру­ется четырьмя солевыми мостиками (электростатические взаимодействия), которые разрываются при образовании оксиформы. Это объясняет, почему дезоксиформа имеет более низкое сродство к кислороду по сравнению с миоглобином или изолированными субъединицами гемоглобина: связыва­ние кислорода требует дополнительной энергии для разрыва мостиков.

Однако оставался открытым принци­пиальный вопрос: как присоединение кислорода к первому гему вызывает перестройку всей четвертичной струк­туры? По словам Перуца, «это как если бы блоха заставила прыгать слона». Ключ к ответу на него был найден пос­ле того, как ученый заметил, что в де-зоксисостоянии атом железа слегка выдвинут из плоскости гемовой груп­пы (примерно на 0,05 нм), тогда как в оксиформе он лежит в плоскости гема. Перуц догадался, что этот сдвиг выз­ван изменением спинового состояния атома железа при его окислении — в нем перестраиваются электронные обо­лочки, из-за чего радиус атома умень­шается. Тут Перуц воспользовался сво­ими познаниями в квантовой химии и теории поля лигандов.

Уменьшенный в размере атом Fe сме­щается к плоскости гема и тянет за собой полипептидную цепь, к которой он присоединен. Гемовая группа уси­ливает эти конформационные измене­ния (с гемом непосредственно контак­тируют 60 атомов белка) — можно ска­зать, что она переключает триггер, ко­торый приводит в движение набор мо­лекулярных рычагов, и скрепляющие конструкцию солевые мостики разры­

ваются. Одна половина белка(димер, состоящий из альфа- и бета-субъеди-ницы) поворачивается относительно другой, и вся молекула обретает бо­лее компактную форму.

Перуцу стало ясно, как в результате всех этих электронно-конформацион-ных перестроек реализуются взаимо­действия между темами; затем он на­шел молекулярное объяснение и эф­фекту Бора. Хотя его схему еще тре­бовалось подтвердить и детализиро­вать, предложенная Перуцем картина в целом была принята.

I | а I с

I I T СО CTDV

араллельноэтим исследованиям он занимался молекулярной па­тологией, связывающей болезни

со структурными аномалиями молекул, — анализировал мутантные формы гемо­глобина. Ранее Полинг и другие авто­ры установили,что ряд наследствен­ных заболеваний крови обусловлен му­тациями гена этого белка. Так, серпо-видноклеточная анемия вызывается заменой двух аминокислот в белке, из-за чего молекулы обретают склонность образовывать агрегаты, а возникающие из них нитевидные структуры приводят к ненормальной, серповидной форме эритроцитов.

Вместе с сотрудниками Перуц искал способы лечения этой патологии. Кро­ме того, он показал, как эволюция ге­моглобина отразилась на адаптации раз­ных видов живых организмов — от гу­сей, перелетающих на большие рассто­яния, до лягушек, живущих на разных высотах, — ктем или иным условиям.

Приближаясь к своему 80-летию, Пе­руц сменил область медицинских инте­ресов — обратился к болезни Хантинг­тона (нейродегенеративному расстрой­ству, которое вызывается мутантным белком, позже названным «хантингти-ном»). Перуц пришел к этой проблеме через старую свою работу, в которой он заметил, что последовательность нескольких глутаминов в полипептидной цепи приводит к бета-складчатым лис­там, на одной стороне которых появля­ются положительные, а на другой —от­рицательные заряды, из-за чего отдель­ные белки могут слипаться.

В 1994 году он показал, что полиглу-таминовый полимер образует агрегаты, приводящие к разрушению нейронов. В статье, отправленной в печать за день до его помещения в больницу в декабре 2001 года, он предложил модель строе­ния таких полимеров и связанных сними амилоидных филаментов.

PV уководимая Перуцем лаборатория молекулярной биологии (он воз­главлял ее до 1980 года) стала

одним из ведущих мировых центров в этой области знаний. Ее посещало мно­го гостей (обычно докторов наук из США), которые осваивали и увозили с собой новые методики.

ПОРТРЕТЫ

Главный принцип Перуца как завла­ба заключался в том, чтобы подобрать талантливых людей с разными научны­ми интересами и дать им возможность свободно развивать свои идеи, обес­печив непринужденный обмен мнения­ми на семинарах и за чаем. Его стиль руководства — воздействие личным примером, и молодые сотрудники чаще видели его за лабораторным столом или у рентгеновской установки, чем в своем кабинете. На нем висели и ад­министративные обязанности, которые он терпеливо и аккуратно исполнял. Пе­руц явно предпочитал общение с кол­легами заседаниям в разных комите­тах, но, если интересы лаборатории требовали того, он активно участвовал в обсуждениях научной политики и дру­гих общественно важных тем.

Перуц был плодовитым автором, на­писавшим несколько книг, а также мно­жество рецензий на научные моногра­фии и учебники. В них отразились его мудрость и богатый опыт исследова­теля, а также незаурядный литератур­ный дар — способность ясно и лако­нично излагать свои мысли.

Он закончил свою насыщенную тру­дами и признанием жизнь счастливым человеком — к восхищению всех, кто встречался с Перуцем в его последние месяцы. Он никогда не почивал на лав­рах и работал до конца, конечно, не ради новых почестей, а просто из-за любви к своему делу. О нем можно ска­зать то, что он написал о сэре Лоурен-се Брэгге: «Слава никогда не притуп­ляла его острое научное любопытство, возможно, потому, что у него не было тщеславия или амбициозности исполь­зовать ее для личной власти».

Макса Перуца будут помнить как од­ного из немногих избранных, совер­шивших революцию в той части наук о живой природе, которую мы теперь называем молекулярной биологией.

Предисловие и сокращенный перевод

с английского Л.Каховского

31