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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL
FCEyNFCEyN--INTIINTI
Materia de Especialización CEBI_E11
RECUPERACION Y PURIFICACION DE MACROMOLECULAS
Docente a cargo: Fernando Oliver ([email protected])
CEBI_E11_3 : Filtración
Filtración
•Es una operación unitaria por la cual se produce la separación de un sólido (o un soluto) de un fluido (liquido o gaseoso) por acción de un medio filtrante y una diferencia de presión.
•La fuerza impulsora a través del filtro es la diferencia de presión.
Filtración
• La fuerza impulsora en la filtración es la diferencia de presión.
• Como puedo generar esa presión:
• Presurizando un tanque (usada en producción)
• Filtrando con una bomba (usada en producción)
• Haciendo vacio (mas usada en escala laboratorio)
Clasificación por modo de operación
• Filtración Normal:• El flujo es perpendicular a la membrana
filtrante.
• Filtración Tangencial• El flujo es tangencial a la membrana
filtrante.
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Clasificación según producto
• Filtración con formación de torta (cake filtration)• Se recupera el material solido que se acumula
sobre el filtro (ej: levaduras)
• Clarificación• En esta filtración el producto es el filtrado que
atraviesa el filtro (ej: sobrenadante post lisis)
Clasificación según tiempos de operación
• Trabajo en batch• Filtro prensa
• Trabajo en continuo• Filtro rotatorio al vacio
Filtros prensa
Video filtro prensa: https://www.youtube.com/watch?v=g7vump_1zwA
Aplicación en biotecnología: producción de levaduras.
Tambor rotatorio
Video Tambor rotatorio: https://www.youtube.com/watch?v=29FGhBp7juQ
Aplicación en biotecnología: bioremediacion.
Armazón de tipo tambor, cubierta con tela de filtro . En el interior se divide en cámaras radiales a las cuales se les aplica el vacío (250 - 300 mm Hg) .
El tambor rota (0.1 - 2 rpm) parcialmente sumergido en un baño agitado
La aplicación del vacío a las cámaras sumergidas hace que el material pase a través de la tela filtrante acumulandose el solido sobre la membrana.
Cuando la superficie del tambor cubierta de sólidos sale fuera del baño, se produce un lavado y después se elimina la capa de sólidos depositada mediante una cuchilla raspante.
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Clasificación según el mecanismo
Filtración superficial (formación de torta)
Las partículas son retenidas en la superficie del filtro, no entran al medio de filtración.
Filtración de profundidad
Las partículas pueden penetrar en el filtro. Son retenidos en el filtro por tres mecanismos:
la interceptación directa, impacto inercial intercepción de difusión.
Determinación área filtrante
Método Vmax
Se basa en el modelo de taponamiento progresivo del filtro.
Este modelo asume que el taponamiento de los poros de la membrana es uniforme y progresivo en el tiempo.
Vmax es el volumen máximo que se podría filtrar con un sistema a tiempo infinito.
Determinación área filtrante
Método Vmax
La ecuación que se utiliza en este modelo es :
•Los valores Vmax y Qi se obtienen experimentalmente graficando t/V = f (t).
t
Vmax
t
V
1
Qi= +
t = tiempo de procesoV= volumen a filtrar (L)Vmax=volumen maximo filtrable a tiempo infinito (L)Qi = Flujo volumetrico inicial (L/min)
Determinación área filtrante
Determinación experimental de Vmax.
Se realiza la filtración del material a presión constante registrando como varia el flujo de permeado en el tiempo
Se realiza en un tiempo de aprox. 10 min y con una membrana pequeña (ej: 47 mm, Área = 17,35 cm2)
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Determinacion area filtrante
Ejemplo calculo de Vmax:
Tiempo (min) Volumen (L) t/V (min/L)
0,5 0,065 7,692
1,0 0,106 9,434
1,5 0,138 10,870
2,0 0,164 12,195
2,5 0,185 13,514
3,0 0,203 14,778
3,5 0,219 15,982
4,0 0,232 17,241
4,5 0,245 18,367
5,0 0,256 19,531
y = 2,4733x + 7,2715R² = 0,9993
0,000
5,000
10,000
15,000
20,000
25,000
0,0 2,0 4,0 6,0
t/V
(m
in/L
)
Tiempo (min)
Vmax
t/V (min/L)
Series2
Lineal (Series2)
Pendiente = 1/Vmax = 2,47 L-1 Ordenada = 1/Qi = 7,27 min L-1
Vmax= 1/Pendiente = 0,404 L Qi = 1/Ordenada = 0,138 L/min
Se uso filtro 47 mm diámetro. Área = 17,35cm2
Determinación área filtrante
Método Vmax
Si normalizo el Vmax y Qi por el área
V’max = Vmax/A y Qi’ = Qi /A
t
V’max A
t
V
1
Q’i A= +
t = tiempo de procesoV= volumen a filtrar (L)A = área filtrante (m2)V’max=volumen máximo filtrable a tiempo infinito (L/m2)Q’i = Flujo volumétrico inicial normalizado (L/m2 min)
Determinación área filtrante
Método Vmax
Reorganizando la ecuación anterior:
Esta es la ecuación que se utiliza para calcular el área filtrante.
1
V’max
A
V
1
Q’i t= +
t = tiempo de procesoV= volumen a filtrar (L)A = área filtrante (m2)V’max=volumen máximo filtrable a tiempo infinito (L/m2)Q’i = Flujo volumétrico inicial normalizado (L/m2 min)
Determinación área filtrante
Método Vmax
Calculo del Área filtrante:
1. Determine experimentalmente:
Vmax = 0,404L, V’max = 233L/m2
Qi = 0,138 L/min, Q’i = 79 L/min
2. Definir escala y tiempo de proceso
Volumen a filtrar (V) = 1000LTiempo de filtracion = 60 min
AREA CALCULADA = 4,5 m2
1
V’max
A V1
Q’i t= + V
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Determinación área filtrante
El Vmax también se puede utilizar para comparar performance de distintos filtros en una misma aplicación.
En este estudio se comparan tres filtros en la filtración de un mismo volumen de producto, en las mismas condiciones.
Determinación área filtrante
Otro ejemplo de comparación de performance de distintos filtros:
Determinación área filtrante
Limitaciones de Vmax:
• El proceso de filtración se debe ajustar al modelo de taponamiento progresivo.
• En algunos casos se ven desviaciones positivas o negativas del modelo. Para evitar subestimar el área de filtración se utilizan factores de seguridad:
Área = Área teórica x Factor de seguridad
Ejemplo:Área = 4,5 m2 x 1,25% = 5,3 m2
(Área calculada con un 25% de factor de seguridad)
Filtración Viral
•Un producto biotecnológico podría estar contaminado por virus adventicios (ambiente, materia prima, etc ) o endógenos (en la línea celular productora).
•Las autoridades regulatorias piden que cualquier producto que provenga de células (ej: mAbs) tenga durante su elaboración dos operaciones que reduzcan la posibilidad de que el producto final este contaminado con virus.
•Se utiliza procesos de filtración viral, inactivación por pH, procesos cromatograficos, etc.
•Cualquier paso deberá validarse haciendo un ensayo de desafío con virus. Luego se realiza el proceso y se evalúan cuantos log cae el recuento viral.
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Filtración Viral
Existen distintos tamaños de poros utilizados para la filtración viral:
50 nm20 nm (para retener parvovirus)
También se puede realizar en distintas modalidades:Filtración normal (es la masa utilizada)Filtración tangencial.
Filtración Viral
Las filtraciones virales son muy costosas (hay que optimizarlas!!):•Necesitan Área filtrante grandes para tiempos de procesos lógicos.•El costo por m2 es muy alto.
• Filtration Tangential
Filtración Tangencial(Tangential flow filtration, cross flow filtration)
• El flujo es paralelo a la superficie filtrante.
• El movimiento de la solución de alimentación a lo largo de la superficie de la membrana ayuda a remover la acumulación de material en la superficie.
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Filtracion Tangencial(Tangential flow filtration, cross flow filtration)
Existen distintas configuraciones de membranas:
Hollow Fiber
Spiral-wound
Flat Plate
Aplicaciones de TFF
•ClarificaciónEl producto pasa a través de la membrana y las partículas mas grandes quedan retenidas en el retenato.Ejemplo: clarificación de cosechas provenientes de un reactor.
• Concentración •El producto se retiene y el solvente pasa a través de la membrana.
•Diafiltración o cambio de bufferEl producto se retiene, el solvente pasa a través de la membrana y el nuevo solvente se agrega al producto
Filtración Tangencial(Tangential flow filtration, cross flow filtration)
Flujo de permeado, Flux(Permeate/Filtrate Flow)
Flujo alimentacion(cross flow)
Flujo de retenido(Retentate Flow)
Membrana
Presion de entrada(Feed pressure)
Presion de salida(Retentate Pressure)
Presion de Permeado(Permeate Pressure)
Permeado
Retenido
Presión transmembrana(TMP: Transmembrane Pressure )
Flujo de permeado(Permeate/Filtrate Flow)
25 psi 15 psi
Membrana
Presion de entrada(Feed pressure)
Presion de salida(Retentate Pressure)
Presion de Permeado(Permeate Pressure)
Permeado
Retenido
2 psi
TMP = (Pin + Pout) - Pperm
2
TMP = (25 + 15)/2 - 2 = 18 psi
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Variación de la presión a lo largo de la fibra en TFF
Flujo de permeado(FLUX)
Es el flujo al cual permea la solución que estoy filtrando.
Me da idea de la capacidad del filtro.
Se normaliza por la superficie del filtro.
Flux = Volumen/Area de la membrana/Tiempo)
Unidades = L / m2 / hr (LMH)
Otros parámetros importantes
Flujo de recirculación (Cross flow rate).
•Es el caudal al cual alimento del producto.
Rechazo ( rejection, R)•Mide la capacidad de la membrana de retener a un soluto.
RR= 1 - CC soluto en Permeado (Cp)
CC soluto en retenido (Cb)
Tambien se puede expresar como %R.
R = 0 para molécula NO retenida. Permea 100%
R = 1 para molécula retenida completamente. NO Permea.
Otros parámetros importantes
•Factor de concentración (VCF, volume concentration factor).
•Es grado de concentración que sufre el volumen inicial durante el proceso:
Volumen inicial20L
Volumen inicial2L
VCF = 20/2 = 10
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Otros parámetros importantes
Diavolumenes (DV o N):Es una medida de cuanto se diafiltro un material.
DV = Volumen de buffer de diafiltración/Volumen de material a diafiltrar
Volumen inicial10L
Volumen final10L
Volumen buffer diafiltración20L
DV = 20/10 = 2
Volumen inicial5L
Volumen final20L
Volumen buffer diafiltración15L
DV = 15/5 = 3
Volumen inicial20L
Volumen inicial5L
FOULING (taponamiento)
•Se refiere a la disminución del flujo de permeado debida a la interacción (adsorción o deposito) entre el soluto, partículas y la membrana.
•Es irrebersible durante el proceso. No se puede restablecer el flujo de permeado original cambiando condiciones en proceso.
•Solo se puede revertir limiando la membrana (post proceso)
Clasificacion TFF(basada en el tamaño de los componentes que separa)
Esquema basico de TFF
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Teoría Filtración tangencial
• La fuerza que impulsa al permeado es la presión transmembrana (TMP)
La relación entre el flujo de permeado y el TMP esta dada por la ecuación de Hagen Poiseuille, para solventes como el agua.
TMP d2p e
32 x µp
Flujo de permeado =
dp: Diametro del poroe: porosidad de la membranax : largo del poroΜp: viscocidad del liquido permeado
Teoría Filtración tangencial
La ecuación se cumple para solventes que no tienen solutos, dando una relación lineal del flujo de permeado con el TMP.
La ecuación no se cumple para fluidos que contienen componentes que son retenidos por la membrana.
La desviación se debe a la polarización de la concentración que se genera sobre la membrana por acumulación de solutos o partículas retenidas.
Aunque el crossflow barre la membrana, se genera sobre ella una capa donde se acumulan moléculas (concentrationpolarisation layer).
Ocurre normalmente en proceso.
Teoría Filtración tangencial
La capa de polarizacion de concentracion produce la desviacion asintotica de la curva de Permeado vs TMP ya que genera una resistencia extra al permeado.
Ademas la alta concentracion de solutos sobre la membrana genera una presion osmotica contraria al TMP que tambien disminuye el permeado.
En base a lo dicho anteriormente se puede definir (modelo resistencias en serie):
TMP - π
RM + RC
Flujo de permeado =
π : Presión osmóticaRM : Resistencia intrínseca de la membranaRC : Resistencia debida a la polarización de concentración
Teoría Filtración tangencial
El valor RM es constante en el proceso y depende de características de la membrana (tamaño de poro, densidad de poro, etc). Se puede calcular midiendo experimentalmente el flujo de permeado en función del TMP:
El valor RC depende de varios factores que afectan el espesor y la permeabilidad de la capa de polarización de concentración:
TMPVelocidad de recirculación (cross-flow)Viscosidad del fluidoTemperaturaConcentración de soluto.
TMP
Flujo permeado aguaRM =
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Teoria Filtracion tangencial
TMP - π
RM + RC
Flujo de permeado =
Resistencia al permeado
Resumiendo, la resistencia al permeado es funcion de:
Tamaño del poro.Cuanto menor es el poro, a igual TMP, menor el flujo de permeado
Grado de formación de la capa de gelCuanto mas importante sea la formación de la capa de gel, menor es el flujo de permeado
Fouling
El aumento en el crossflow como regla general reduce el espesor de la capa de gel incrementando el flux.
Factores importantes en TFF
Temperatura
• En el caso del agua, el flujo de permeado (Flux) aumente con el aumento de la temperatura.
• Para materiales biológicos es mas difícil de predecir el cambio en el Flux con la temperatura ya que el flujo de permeado también depende de la resistencia que ofrece la capa de gel y el grado de fouling en la membrana. Estos factores son característicos de cada material a filtrar.
• En general se ve que el flux aumenta con la temperatura.
Factores importantes en TFF
TMP (Presión transmembrana)
• El flujo de permeado (Flux) aumente con el aumento de la TMP.
• Para el agua la relación es línea.
• En proceso se observa que a partir de una determinada presión se hace asintoticadebido a la compactación de la capa de gel.
• La TMP optima de proceso es la presión en la cual se produce la inflexión en la curva.
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Factores importantes en TFF
Flujo de recirculación (Crossflow)
• El aumento del flujo de recirculación disminuye la capa de gel, disminuyendo la resistencia al flujo de permeado (aumenta Flux).
Factores importantes en TFF
Concentración del material
• El flujo de permeado esta muy influencia por la concentración de los componentes.
• El flujo de permeado disminuye con el aumento de la concentración de los componentes.
Desarrollo de TFF
Define tus objetivos (hay que tener métodos analíticos para poder evaluar si se cumplen):
1. Concentración final del producto.
2. Grado de diafiltración. (%buffer original, mS/cm, etc).
3. Rendimientos
Desarrollo del proceso:1. Elección del tipo membrana (poro, lumen, etc) y superficie
(afectan tiempos de proceso)
2. Crossflow (define el equipamiento)
3. Determinación del TMP de trabajo (afecta los tiempos de proceso)
4. En diafiltración, esquema de diafiltración (repercute en consumo de buffers)
Elección del tipo de membrana
Tamaño de poro, en base a la aplicación:Si quiero que se retenga: 3-5 veces mas chico que el MW proteína:
Ejemplos: hGH MW 22kDa, si quiero concentrarla usare MMWC = 5kDaIB (tamaño 0,22-0,45um, si quiero retenerlos poro = 0,1um)
Lumen del canalTengo que elegir un lumen que sea lo suficientemente grande para evitar taponamientos de la fibra.Ejemplos:
hGH (proteína en solución) lumen = 0,5mmIB (tamaño 0,22-0,45um), lumen mas grande, aprox 1mm)
MaterialElegir un material adecuado para la aplicación:Ejemplos:
Para proteínas, utilizar membranas con bajo binding
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Selección de la membrana en TFF
• Impacto en la adsorción del producto a la membrana
Low Protein case = 10g/m2 , High proteina case = 500g/m2
La celulosa regenerada se utiliza cuando el proceso no es a pH extremos y cuando la carga es baja ( < 20g/m2 ).
Desarrollo de TFF
R: 1 – ( Cp / Cb )
• Impacto del R en la selección de la membrana
Reglas:
•Si quiero retener la proteína usar poro 3-5 veces mas chico que su MW.
•Si quiero permear la proteína usar poro 10 veces mas chico que su MW.
Elección del crossflow
El permeado aumenta con el crossflow.
Elegir un crossflow bajo implicara que se tenga que compensar aumentando el área del filtro para tener un tiempo de proceso adecuado.
La elección de un crossflow alto:•puede repercutir en la estabilidad del producto. A mayor crossflow, el producto pasa mas veces por la bomba, aumentando las chances de que se dañe.•Aumenta el volumen muerto del equipo, porque necesito tubuladuras mas grandes y bombas mas grandes.•Aumenta el costo del equipamiento.
Como lo defino?•Recomendaciones del proveedor: tanto los cassettes como las fibras huecas tienen recomendaciones de flujo para cada aplicación. •Limitaciones técnicas y/o económicas (volumen muerto/costos).
Modo de recirculación total
PERMEATE
RETENTATE
Se mantien la concentracion constante
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Determinación de la TMP de trabajo
Se realiza con una configuración de recirculación total.
Se mide el Flux a distintos TMP y se grafica Flux = f ( TMP ).
Se selecciona la TMP optima del proceso. Va a corresponder a la TMP del punto de inflexión.
Si trabajo a TMP menor, voy a tener un permeado suboptimo que va a terminar repercutiendo en una área mayor de filtro.
Si trabajo en la zona donde el permeado es independiente del TMP puedo tener mayor riesgo de fouling y perdida de proteína (aumenta mucho la concentración de la prot. sobre la membrana).
Flux vs TMP
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50
TMP psig
LM
H
Pin Pout TMP ∆∆∆∆P
10 0 5 10
20 10 15 10
30 20 25 10
Esquema de diafiltración
Diafiltración discontinua:
Volumen CC15L, 8 mg/mL
Volumen DIAF120L, 2 mg/mL
Volumen inicial20L, 2 mg/mL
Volumen CC25L, 8 mg/mL
Volumen buffer diafiltracion15L
Volumen DIAF220L, 2 mg/mL
Volumen CC35L, 8 mg/mL
Volumen buffer diafiltracion15L
Consumo de buffer = 30L (6DV)Concentración proteína vario entre 2 y 8 mg/mLdurante la diafiltración.Volumen permeado = 45LComposición final:
94% buffer diafiltración6% buffer original
Esquema de diafiltración
Diafiltración continua:
Volumen CC15L, 8 mg/mL
Volumen inicial20L, 2 mg/mL
Volumen final5L, 8 mg/mL
Volumen buffer diafiltración15L
Consumo de buffer = 15L (3DV)Volumen permeado = 30LComposición final:
95% buffer diafiltración5% buffer original
Ejemplo escalado
Microfiltración cosecha de mAbs:
Volumen CC18L – 1g/L – 8g
Volumen inicial31,2L – 1g/L – 31,2g
Volumen final8L – 1,1g
Lavado con 16L de buffer
Cosecha23,2L – 1g/L – 23,2g
Lavado 16L – 6,9g
Rendimiento: Cosecha: 23,2g (74,3%)Lavado: 6,9g (22,1%)TOTAL: 30,1g (96,5%)
*Supongo R=0 para el monoclonal en microfiltración.
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Ejemplo escalado
Microfiltración cosecha de mAbs:
Importante
• Antes de un proceso:
– Test de integridad.
• Después del lavado:
– Medir NWP para comparar contra el NWP del cartucho sin uso. Si es < 80%, la limpieza no fue efectiva.
NWP, método para evaluar limpieza membrana
NWP: normal water permeability
• Es un procedimiento que se realiza para ver si se realizo bien la limpieza del filtro.
• Se debe realizar antes de usar el filtro.
• Luego de cada limpieza se determina el NWP. Se considera que la limpieza fue efectiva si el NWP calculado es mayor o igual al 80% del NWP inicial.
• Se mide el flux con agua a una dada TMP y se corrige por la temperatura.