03 p grammatico tecniche di nuova generazione
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Paola GrammaticoIrene Bottillo18-04-2015
Tecniche di nuovagenerazione nella diagnostica
molecolare di patologie cardiache
Thro
ugh
put
Kb
Gb
Mb
Lenght of Read (bp)
70030050
NGS
whole genome
whole transcriptome
whole exome
target seq
Sequence revolutions
Genome sequencing: intero genoma -> mutazioni puntiformi + riarrangiamenti cromosomici
Exome sequencing: solo le regioni codificanti di un genoma
Trascriptome sequencing: sequenziamento e quantificazione degli RNA, sia codificanti che non-codificanti -> fusioni intrageniche + mutazioni puntiformi + isoforme + profili di espressione
Target sequencing: diverse regioni/geni contemporaneamente
NGS, applicazioni
RNA RNA-Seq
studi di espressione
Small-RNA
Regolazione
metilazione
analisi interazioni DNA-proteine
DNA
resequencing geni/genomi noti
sequenziamento de novo
sequenziamento di regioni target
identificazione SNP/mutazioni
identificazione riarrangiamenti strutturali e CNV
transcriptome sequencing
whole genome sequencing
- target sequencing- exome sequencing
ChIP-Seq
Molecular analysis of sarcomeric and non-sarcomeric genes in patients with hypertrophic cardiomyopathy
Bottillo Irene1, D’Angelantonio Daniela, Caputo Viviana2, Paiardini Alessandro3 , Lipari Martina1, De Bernardo Carmelilia1, Giannarelli Diana4, Pizzuti Antonio2, Majore Silvia1, Castori Marco1, ZacharaElisabetta5, Re Federica5, Grammatico Paola1
1Medical Genetics, Department of Molecular Medicine, Sapienza University, San Camillo-Forlanini Hospital, Rome, Italy; 2Department of Experimental Medicine, Sapienza University of Rome, Rome, Italy; 3Department of Biochemical Sciences, Sapienza University of Rome, Rome, Italy; 4Biostatistic Unit, Regina Elena National Cancer Institute, Rome, Italy; 5Cardiomyopathies Unit, Division of Cardiology and Cardiac Arrhythmias, San Camillo-Forlanini Hospital, Rome, Italy
Scopo del lavoro
Il test genetico permette di confermare o escludere la HCM in casi atipici, e di identificare portatori in fase pre-clinica attraverso
screening familiare
Analisi genetiche medianteSanger si limitano a 4-5 geni e richiedono tempi/costiimpegnativi
Assenza di chiare correlazionigenotipo-fenotipo
NGS di 62 geni cardiomiopatia-associati per un test molecolare altamente sensibile e per determinare il contributo di ogni gene
nell’insorgenza ed espressione della HCM
Materiali e Metodi
44 pazienti HCM adulti, 23 ♂ e 21 ♀
NGS (Ion Torrent PGM) di 62 geni (CDS, ss, 5’UTR, 3’UTR)
ABCC9, ACTC1, ACTN2, ANKRD1, BAG3, CALR3, CASQ2, CAV3, CRYAB, CSRP3, CTF1, DES, DMD, DSC2, DSG2, DSP, DTNA, EMD, EYA4, FHL2, FXN, GATAD1, GLA, ILK, JPH2, JUP, LAMA4, LAMP2, LDB3, LMNA, MYBPC3, MYH6, MYH7, MYL2, MYL3, MYLK2, MYOM1, MYOZ2, MYPN, NEBL, NEXN, PDLIM3, PKP2, PLN, PRKAG2, PTPN11, RAF1, RBM20, RYR2, SCN5A, SGCD, TAZ, TCAP, TMEM43, TMPO, TNNC1, TNNI3, TNNT2, TPM1, TTR, TXNRD2 e VCL
Esperimento Ampliseq su Ion Torrent PGMABCC9, ACTC1, ACTN2, ANKRD1, BAG3, CALR3, CASQ2, CAV3, CRYAB, CSRP3, CTF1, DES, DMD, DSC2, DSG2, DSP, DTNA, EMD, EYA4, FHL2, FXN, GATAD1, GLA, ILK, JPH2, JUP, LAMA4, LAMP2, LDB3, LMNA, MYBPC3, MYH6, MYH7, MYL2, MYL3, MYLK2, MYOM1, MYOZ2, MYPN, NEBL, NEXN, PDLIM3, PKP2, PLN, PRKAG2, PTPN11, RAF1, RBM20, RYR2, SCN5A, SGCD, TAZ, TCAP,
TMEM43, TMPO, TNNC1, TNNI3, TNNT2, TPM1, TTR, TXNRD2 e VCL
Analisi dei dati (Torrent Suite 4.0) Alignment on hg19 Coverage/Read depth analyses varianti’ calling
Annotazione delle varianti (wAnnovar2 WEB SERVER)
Filtraggio delle varianti MAF < 0,01
Prioritizzazione delle varianti Exonic ±10bp from splicing junction
Validazione delle varianti (Sanger)
Materiali e Metodi
Predizioni funzionali in silico Molecular Modelling
Correlazioni genotipo-fenotipo
Risultati
18.810 varianti/44 pazienti~ 427 varianti/pazente
Validazione del test NGS: confermate tutte le varianti identificate precedentemente mediante Sanger di MYBPC3, MYH7, TNNT2, TNNI3 in 23/40 pazienti
155 varianti
SANGER VALIDATION
FILTERING
(MAF<0,01) +
PRIORITIZATION
(Ex ± 10bp)
18.810 varianti
Risultati
106 non-sinonime(nsSNV) 81 missense 15 intronic (±10 bp) 4 nonsense 4 frameshift 1 stop-loss 1 in frame deletion
49 sinonime in Htz
Risultati
35/44 (82%) dei pazienti portatori di una o più variantinon-sinonime
4 pazienti: solo varianti sinonime
4 pazienti negativi
24/62 geni negativiACTC1, ANKRD1, CASQ2, CRYAB, CTF1, DES, EMD, EYA4, FXN, LDB3, MYL3, MYLK2, MYOZ2, NEXN, PLN, PRKAG2, PTPN11, SGCD, TAZ, TCAP, TMEM43, TNNC1, TNNI3 and TTR
Risultati
Numero varianti non-sinonime identificate per ciascunacategoria genica funzionale
“Other” includes the loci coding for lysosomal, thioredoxin reductase, anti-apoptotic and membrane proteins
Molecular Modelling
Risultati
Structural comparison of wild-type and mutant forms for (a) FLH2 A37S; (b) LAMA4 E1646G; (c) MYH6 R23H; (d) MYH7 A226T; (e) MYH7 R143Q; (f) MYOM1 R711H; (g) PKP2 R767S; (h) RYR2 E1127G; (i) RYR2 R485Q. The mutation is indicated in white. The predicted structural effects of mutations are: (a, d) steric hindrance (red circles); (b) local misfolding of linker domain (orange); (c, e, f, g) loss of important inter-residues contacts; (h) loss of a π-anion interaction; (i) loss of a π-cation interaction.
Effects of nsSNVs for (a) the cadherin domain of DSC2; (b) the melibiase domain of GLA; (c) the FGF13 interaction domain of SCN5; (d) the Na Channel of SCN5 (the approximate position of the negatively charged Asp872 residue is shown in red, in each of the four protein subunits forming the channel).
Pt Gene Mutation NM Status TypedbSNP138
clin ass
Referenc
echr start end
Re
fVar UNIPROT Domain
PolyPh
en-2 SIFT
Conservation-
GERP scoreComment
1
MYBPC3 c.T1664C,
p.M555T000256 Htz missense -
Girolami
et al.
2006
chr11 47363668 47363668 A G Q14896Ig-like C2-
type 4B (0) T (1) 4.22
Mol Mod: No
predicted
deleterious
effect
RyR2 c.A3380G,
p.E1127G001035 Htz missense rs200525962 - chr1 237730032 237730032 A G Q92736
B30.2/SPR
Y 2
D
(0.979)DLT (0) 5.29
Mol Mod:
Probably
destructuring
the tertiary
structure (loss of
π-anion
interaction with
Trp1145)
3 TMPO c.A1037G,
p.H346R003276 Htz missense - - chr12 98927072 98927072 A G P42166
disordered
region
B
(0.001)T (0.32) -1.03
Mol Mod: No
possible
prediction
5 MYH6 c.643-5C>T 002471 Htz intronic rs199859986 - chr14 23873602 23873602 G A - - - - -1.15Branch-point
site broken
8
RBM20c.G3373A,
p.E1125K
001134
363Htz missense rs116908219 - chr10 112583294 112583294 G A Q5T481 -
PD
(0.911)T (0.34) 6.16
Probably not
pathogenic
MYH6c.2928+5G
>A002471 Htz intronic rs28730772 - chr14 23862870 23862870 C T - - 4.37
Donor splice site
broken
CSRP3c.T10C,
p.W4R003476 Htz missense rs45550635
Knoll et
al. 2002;
Geier et
al. 2008
chr11 19213986 19213986 A G P50461LIM zinc-
binding 1
PD
(0.888)DLT (0.01) 6.02
Previously
reported alone
in CMD1M
pazienti and in
conjunction with
a sarcomeric
mutation in
HCM pazienti
Risultati
… … …Dall’analisi della tipologia delle varianti, revisione della letteratura, analisi in silico e
molecular modeling, tutti i pazienti sono risultati portatori di almeno una nsSNV patogenetica, o già descritta come un modificatrice del fenotipo
Risultati Correlazioni genotipo-fenotipo Age at diagnosis
Family History
Heart Transplantation
NYHA
Maximal Wall Thickness
Left Ventricular Mass
Cardiac magnetic resonance areas of contrast
Left Ventricular Ejection Fraction
VS total number of nsSNVs
number of sarcomeric nsSNVs
number desmosomal nsSNVs
number of nsSNVs in genes for K+ and Na+ channels and interacting proteins
number of nsSNVs in mRNA splicing, cellular enzymes and nuclear genes
number of cytoskeletal nsSNVs
number of Z-disk nsSNVs
number of intracellular calcium homeostasis nsSNVs
↑ num. nsSNVs: ↓ età di esordio
nsSNVS in geni per Ca++ homeostasis, per canali K+ e Na+, e per proteine del citoscheletro possono modulare l’espressione di HCM
Sudden Cardiac Death
Obstructive Cardiomyopathy
Supraventricular Arrhythmias
Non-Sustained Ventricular Tachycardia
Syncope/Presyncope
VO2
Maximal oxygen uptake
Diastolic Dysfunction
Thoracic pains
ECG Hypertrophy criteria
Conduction abnormalities
Hypertension
Intracardiac Defibrillator
Pacemaker
Myectomy
Coronary-Ventriculography
AMI/NSTEMI
Coronary Bypass
Discussione
Ruolo di 62 geni nell’HCM
Percorso sperimentale/bioinformatico applicabile
in un contesto clinico
82% dei casi: almeno una nsSNV rara
Discussione
3/44 pazienti sindromici
Paz 24: ♀, 7 anni, sindrome di Cantù (AD, ipertricosi congenita,osteocondrodisplasia, cardiomegalia, HCM e dismorfismi)
ABCC9 c.C3460T,p.R1154W (Htz): descritta in 3 pazienti con S. di Cantù (vanBon et al 2012)
Paz 27: ♀, 23 anni, malattia di Danon o glicogenosi da deficit di LAMP2 (Lysosomal-Associated Membrane Protein 2), X-linkedrecessiva (cardiomiopatia , debolezza muscolare, ritardo mentale)
LAMP2 c.453delT,p.F151fs mai descritta prima
Paz 10: ♀, 65 anniGLA c.A644G,p.N215S (alfa-galattosidasi A, malattia di Fabry, X-linkedrecessiva, segni neurologici, angiocheratoma, insufficienza renale, cardiomiopatia)
p.N215S già associata a forma con coinvolgimento solo cardiaco (Davies et, al, Eng et al 1993)
Prospettive future …
Toward a prenatal non-invasive diagnosis of Congenital HeartDiseases (CHDs): identification of early plasmatic markers (miRNAs)
Non-Invasive Prenatal Diagnosis (NIPD) targets cell-free DNA andRNA (fetal + maternal) circulating in maternal plasma
miRNA vengono rilasciati dallaplacenta e poi esportati nellacircolazione materna, qualificandosicome BIOMARKER PRENATALI DI PATOLOGIA
miR-19b, miR-22, miR-29c, miR-375 sono up-regolati in gravidanze di fetiCHD
Identificare miRNA come biomarcatori di CHD fetale in uno stadio precoce di gravidanza
Scopo del progetto
Pazienti e Metodi
Gravidanze di feti non-cromosomici
Gravidanze di feti cromosomici (trisomia 13, 18, 21 e monosomia X)
Gravidanze di controllo (non crososomici, no CHD)
Studio del miRNoma sia da plasma materno che da liquid amniotico