1 基因组文库的构建
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第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术. 1 基因组文库的构建 基因组文库（ genomic library ） 将某种生物细胞的整个基因组 DNA 切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的 全部基因 ，称为基因文库。 1. 1 构建基因文库的载体选用 载体能够容载的 DNA 片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。. 第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
1 基因组文库的构建 基因组文库（ genomic library ）将某种生物细胞的整个基
因组 DNA 切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。1. 1 构建基因文库的载体选用 载体能够容载的 DNA 片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。
第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术
1.1.1 对载体的要求：载体容量越大，所要求的 DNA 片断数目越少，所需的重组子越少。 1.1.2 目前常用的载体 ：载体系列（ 容量为 24
kp ）、 cosmid 载体（容量为 50 kb ）、 YAC （ 容量为 1
Mb ）、 BAC （ 容量为 300 kb ）1.2 基因文库构建的一般步骤1.2.1 染色体 DNA 大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割法或不完全酶切法。1.2.2 载体与基因组 DNA 大片段的连接：直接连接、人工接头或同聚物加尾。
第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术
噬菌体载体构建基因组文库
2 cDNA 文库的构建 cDNA 克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，
使 poly(A) mRNA 转变成双链 cDNA 群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序列的 cDNA 基因文库。2.1 高质量 mRNA 的制备 应用 Promega PolyAT tract mRNA Isolation
System 分离 Poly(A)RNA 。将 Biotinylated Oligo(dT) 引物与细胞总 RNA 共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin ，用磁场吸附与 PMP 相连的 SA-
Biotinylated Oligo(dT)-mRNA 。
第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术
PolyAT tract mRNA的分离纯化过程
2.2 反转录成 cDNA
可同时在反转录系统中加入 Oligo(dT)12-18-mer 及随机引物 R6 ，以保证得到全长 cDNA ； 应选用活性较高的反转录酶 (Reverse transcriptas) ； 应选用甲基化 dCTP ； 应保证所获得双链 cDNA 的方向性。
cDNA 克隆时，必须考虑到目的基因 mRNA 在特定的生物体组织中的含量问题。根据 mRNA 分子含量的多寡（丰度），可将其划分为高丰度、中丰度和低丰度三种类型。
第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术
寡聚 (dT)12-18 随机 6 碱基引物R6
寡聚 (dT)12-18
随机 6 碱基引物R6
mRNA (A)n(T)12-18
(A)n(A)n(T)12-18 R6 R6 R6 R6 R6 R6
第二链合成
(A)n(T)12-18
(A)nR6 R6 R6 R6 R6 R6
(A)n(T)12-18
EcoRI EcoRI
加上 EcoRI 接头，磷酸化， cDNA 分级
cDNA 合成完毕，准备连接
第一链合成
cDNA 合成过程示意图
第四章 基因文库构建及酵母双杂交技术
cDNA 合成的分子修饰
接头及引物序列 无 RNaseH 活性的反转录酶， 5’ 甲基化的dNTP
RNaseH， DNA 聚合酶 I
EcoRI 接头， T4 连接酶
XhoI 酶切
完整有方向的 cDNA
XhoI
XhoI
EcoRI XhoI
XhoI
cDNA 文库的构建
cDNA 3′（ 3′RACE 法）
端的快速扩增法
(RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends)
3 RACE 技术
•3`-Full RACE 法
cDNA 5′（ 5′RACE 法）
端的快速扩增法
(RACE: Rapid Amplification of cDNA Ends)
●Self-Ligation 法
5 ’ RACE5 ’ RACE 原理原理5 ’ RACE5 ’ RACE 原理原理
1. 使用 RNA Ligase 的 5’ RACE 法 ● Self-Ligation Method
● Adaptor-Adding Method
2. 使用 TdT (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase) 的 5’ RACE 法
5’ RACE 法种类
Adaptor-Adding Adaptor-Adding
Method Method 原理原理Adaptor-Adding Adaptor-Adding
Method Method 原理原理
TdT TdT 法原理法原理TdT TdT 法原理法原理
几种 5’ RACE 法的比较
可否进行Nested PCR
TdT法 中 PolyG含 不可 低
Self-Ligation法
引物情况 扩增特异性
高
中
高可特异性高
低 特异性高 可
Method
Adaptor-Adding法
连接效率可否进行
Nested PCR
TdT法 中 PolyG含 不可 低
Self-Ligation法
引物情况 扩增特异性
高
中
高可特异性高
低 特异性高 可
Method
Adaptor-Adding法
连接效率
90 年代，纽约大学的 S. Field 等建立。有效地分离能与一种已知的靶蛋白相互作用的蛋白质
4.2 酵母双杂交系统的原理
许多真核生物的转录激活因子都是由两个在结构上可以分开的、功能上也相互独立的结构域组成。
4.2.1 结构域（ Domain ）合作
4.1 酵母双杂交系统的作用
4 酵母双杂交系统Yeast Two Hybrid System (Interaction trap)
例如： 啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子 GAL4:
DNA binding domain Active domainN C
1-147aa 768-881aa
上游激活序列（ UAS ） 转录机 GAL4 效应基因结合 结合 激活转录
只要 DNA binding domain（ DNA-BD ）与Active domain（ AD ）靠近就能够表现转录激活活性。
实验发现： 转录表达
4.2.2 拆开 Domain
DNA binding domain
Active domain
上游激活序列（ UAS ） 转录机 GAL4 效应基因结合
用重组 DNA 技术把 GAL4 的两个 Domain分开，就丧失了激活效应基因的能力。
不能转录
4.2.3 重组 Domain
用重组 DNA 技术把这两个 Domain 分别与两个不同的多肽连接。
Active domain
蛋白 A
蛋白 B
DNA binding domain
在体内，蛋白 A 与蛋白 B 是否能结合。通过效应基因是否被激活来检查：
4.2.4 观察报告基因表达
上游激活序列（ UAS ） 转录机 GAL4 效应基因
蛋白 ADNA binding domain
转录激活 domain蛋白 B
GAL4的 DB domain与 AD Domain也不能靠近，所以仍然不能启动效应基因的转录。
不能转录
（ 1 ）如果蛋白 A 与蛋白 B 不能相互结合
上游激活序列（ UAS ） 转录机 GAL4 效应基因
蛋白
ADNA binding domain 转录激活 domain
蛋白
B
激活转录
GAL4的 DB domain与 AD Domain也能靠近，所以能启动效应基因的转录。
转录表达
（ 2 ）如果蛋白 A 与蛋白 B 能相互结合
双杂交原理
XX 基因和基因和 YY 基基因产物的相互因产物的相互结合，导致结合，导致reporter genereporter gene表达。表达。
Reporter gene表达就可说明 X基因产物于 Y 基因产物能结合。
4.3 构建双杂交体系的宿主菌
删除基因组中的内源野生型 GAL4 基因使酵母菌只能利用载体表达的 GAL4 蛋白。
如： SFY526; HF7c 等菌株。
4.4 构建报告基因（ reporter gene ）
GAL4 激活组氨酸合成酶的表达，使酵母菌能生长在组氨酸缺乏培养基上。
GAL4 的效应基因是 his3/lacZ/URA3 。
此外还有其他营养缺陷。
4.5.1 穿梭质粒（ shuttle plasmid ）
4.5 构建双杂交体系的穿梭质粒
既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母菌中复制和表达的质粒。
4.5.2 双杂交体系需要两种穿梭质粒
分别携带已知的靶蛋白基因和携带未知基因序列。
靶基因按正确的读码结构和取向克隆在GAL4的 BD之后。
（ 1） BD-plasmid
P: ADH1启动子。 T: ADH1终止子。
筛选标志： TRP
核定位信号是 GAL4本身的一部分
ADH： Alcohol dehydrogenase
（ 2） AD-plasmid
外源基因按正确阅读框克隆到 GAL4的AD 片断之后。
P: ADHI启动子。 T: ADHI终止子。
筛选标志： LEU2
核定位信号是SV40 的 T 抗原的序列
4.6 酵母双杂交的实验过程
4.6.1 把蛋白 A 插入到 BD 质粒上（ pGBT9 ）
4.6.2 把蛋白 B 插入到 AD 质粒上（ pGAD424 ）
4.6.3 两种重组质粒共同转化酵母菌（ HF7c ）
报告基因： HIS （合成组氨酸）
4. 6.4筛选观察
（ 1 ）存活选择
在缺少亮氨酸（ LEU ）和色氨酸（ TRP ）培养基上筛选双载体转化子。
双载体转化才能合成亮氨酸和色氨酸，菌体存活。
Trp-
Leu-
在缺少组氨酸（ HIS ）、亮氨酸（ LEU ）和色氨酸（ TRP ）的培养基上筛选蛋白 A和蛋白 B 能相互作用的双载体转化子。
（ 2 ）蛋白结合选择
His-
Trp-
Leu-