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Aufnahmestudien

Orthotopes Tumormodell

Stand: 29.05.2006

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Durchführung I

• Tier: Maus c57/B16

• Tumorzellimplantation: 2·105 MB 49-Zellen

• Makrohämaturie intermittierend (zeitweilig aussetzend) bei allen

Tieren nach 20 Tagen, nur Maus 2 noch am Therapietag

• Therapiebeginn:

• Tag 26

• Narkose mit Pentobarbital, Kathetereinlage

• Therapie mit Instillation und sofortiger Katheterentfernung

(entspricht Wirkdauer von etwa 1h)

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Durchführung II

Therapie:

• Maus 1 50 µl intravesikal 10 µM siRNA

• Maus 2 50 µl intravesikal 1 µM siRNA

• Maus 3 50 µl intravesikal 0,25 µM siRNA

• (Bemerkung: bei Maus 3 para gelaufen daher

fragliche Therapie)

• Maus 4 50 µl intravesikal 10 µM siRNA + DOTAP (1:1)

• Maus 5 50 µl intravesikal 1 µM siRNA + DOTAP (1:1)

• Maus 6 50 µl intravesikal 0,25 µM siRNA + DOTAP (1:1)

• Maus 7 50 µl intravesikal PBS

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Durchführung III• Opferung:

• Tag 27, 12h nach Therapie

• Blasengewicht

• Maus 1 25 mg

• Maus 2 63 mg

• Maus 3 40 mg

• Maus 4 19 mg (wahrscheinlich kein Tumor)

• Maus 5 49 mg

• Maus 6 28 mg

• Maus 7 45 mg

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Durchführung IV

• Aufarbeitung:

• Kryokonservierung von Blase und Nieren (jeweils mit Harnleiter)

• Blasen aufgeschnitten Tumor nach oben auf Korkblättchen

• Gefrierschnitte

Bemerkung: aufgrund der gewellten Gewebe konnten nie vollständige

Schnitte angefertigt werden und innerhalb der Schnitte sind z.T. alle

Schichten der Blasenwand vertreten

• Fluoreszenzmikroskopie

• von einigen Ebenen HE-Färbungen und Begutachtung durch Pathologen

• die Nieren und Harnleiter wurden noch nicht aufgearbeitet

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Fluoreszenzmikroskopie• DAPI-Färbung der Zellkerne

• Detektion der FITC- und DAPI-Fluoreszenz mittels

Fluoreszenzmikroskopie

• Deutlich sichtbar: Bereiche stark vergrößerter, verdichteter Zellkerne

Vergleich mit HE-Färbungen zeigte, dass es sich um Tumorbereiche

handelt

HE-FärbungenAusbreitung der Tumoren:

• Tumoren wachsen hauptsächlich oberflächlich; bei Maus 7 aber

definitiv muskelinvasiv; bei anderen Mäusen z.T. nicht genau

feststellbar

7

200 µm 200 µm

200 µm200 µm

A

B

C

D

A Maus 1, B Maus 2, C Maus 3,

D Maus 2, HE (gleicher Ausschnitt wie Fluoreszenzbild)

8

200 µm200 µm

Maus 1:Maus 1:

links: Fluoreszenzmikr., rechts: HE-Färbung (gleicher Ausschnitt)

FITC in Muskelschicht

9

Maus 7, 100fache Vergrößerung

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Ergebnisse• Maus 1 bis 3: deutlich sichtbar Abnahme der FITC-Fluoreszenz in der

Blasenwand (Folie 7)

• Sichtbar am HE der Maus 2: FITC nur in Urothelschicht (Folie 7)

• Bei Maus 1 konnte geringe FITC-Intensität auch in Muskelschicht detektiert

werden (Folie 8)

• Maus 4 bis 6:

• ns-siRNA + DOTAP

• geringere Fluoreszenzintensität als bei Maus 1 bis 3 (ohne Lipidcarrier

applizierte Konstrukte) alle Bilder liegen bei

• Maus 7:

• PBS-behandelt keine FITC-Fluoreszenz detektiert (Folie 9)

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Bemerkungen

• alle aufgenommenen Fluoreszenz- und HE-Bilder liegen bei

die Vergrößerung und die Schnittebene („E“; Blasen wurden von oben {E.1} in

Richtung Korkblättchen geschnitten) sind jeweils im Dateinamen angegeben

Fluoreszenzaufnahmen: es wurden jeweils die DAPI- (c2) und FITC-

Fluoreszenz (c1) extra aufgenommen und übereinander gelegt (c1+c2)

• HE-Färbungen: hier wurden jeweils Fotos von den Bildausschnitten gemacht,

von welchen auch Fluoreszenzaufnahmen vorlagen;

von Maus 3 liegen keine HE-Bilder vor, da die Schnitte größtenteils vom

Objektträger abgespült waren