1

1. Molekularna osnova procesa apoptoze

1.1. Apoptoza

Ćelijska smrt, zajedno sa rastom i diferencijacijom, predstavlja suštinski deo

životnog ciklusa ćelije. Dnevno u organizmu čoveka umire do 5% od ukupnog broja

ćelija. Svaka osoba, u toku jedne godine, produkuje i razgradi ćelijsku masu koja je

jednaka težini tela. Homeostatska kontrola broja ćelija ostvaruje se putem dinamičke

ravnoteže između dva suprotna procesa - ćelijske deobe i ćelijske smrti (slika 1).

B R O J Ć E L I J A

Slika 1. Homeostatska kontrola broja ćelija. Tkivna homeostaza je posledica ravnoteže između proliferacije čelija i regulisanog ćelijskog umiranja po tipu apoptoze.

Ulogu ćelijske smrti u razvoju organizma prvi put su opisali pedesetih godina

prošlog veka Glucksmann i Saunders. Prvi dokaz za postojanje dva morfološki različita

tipa ćelijske smrti dao je australijski patolog Džon F. R. Ker (r.1934) 1965. godine (slika

2). Ker i saradnici su histohemijskim metodama ispitivali promene na lizozomima

hepatocita pacova u uslovima ishemije. Tokom tih ispitivanja uočili su postojanje ćelija

koje verovatno umiru, ali se po morfološkim odlikama razlikuju od ćelija koje se nalaze u

procesu nekroze.

Slika 2. Džon F. R. Ker. Australijski patolog koji je sredinom šezdesetih godina prošlog veka prvi opisao ćelije koje umiru procesom apoptoze.

2

Ker je novootkrivenu formu ćelijske smrti nazvao apoptoza. Reč apoptoza potiče

iz grčkog jezika (apo + pto) i znači opadanje (lišća sa drveta). Ovim nazivom Ker je želeo

da naglasi da se radi o fiziološkom, odnosno „prirodnom“ načinu umiranja ćelija.

Danas se ćelijska smrt deli na akcedentalnu i regulisanu ćelijsku smrt.

Akcedentalna ćelijska smrt je posledica dejstva ekstremnih fizičkih (visoka

temperatura, pritisak, ...), hemijskih (jaki deterdženti, velike promene pH) i mehaničkih

stimulusa. U tim okolnostima ćelija umire bez “uključenja” specifične molekularne

mašinerije. Regulisana ćelijska smrt je vrsta ćelijskog odgovora na prisustvo

odgovarajućih signala koji dovode do aktiviranja specifičnih molekularnih mašinerija.

Programirana ćelijska smrt je vrsta regulisane ćelijske smrti.

Prema morfološkim karakteristikama razlikuju se tri tipa ćelijske smrti. Ćelijska smrt

tipa I – apoptoza (ćelijsko samoubistvo), ćelijska smrt tipa II – autofagija i ćelijska smrt

tipa III – nekroza (ćelijsko ubistvo).

Apoptoza je aktivan proces genski regulisanog ćelijskog samouništenja i u

većini slučajeva služi homeostatskoj funkciji. To je jedan od najizučavanijih bioloških

fenomena ćelija eukariota. Poslednjih deset godina preko 10.000 naučnih radova

godišnje za temu istraživanja ima proces apoptoze.

Programirana ćelijska smrt po tipu apoptoze opisana je u normalnim fiziološkim

uslovima (tokom procesa embriogeneze, diferencijacije i u procesima razvoja i regulacije

imunskog sistema), kao i u nizu patoloških stanja organizma.

Biološka uloga apoptoze u normalnim fiziološkim uslovima organizma ogleda se u:

1. programiranom smanjenju broja ćelija tokom embriogeneze i metamorfoze - kod

čoveka najpoznatiji primer ćelijskog umiranja po tipu apoptoze je onaj tokom

embrionalnog formiranja prstiju ruku;

2. eliminaciji suvišnih ćelija u održavanju konstantnog broja ćelija - održavanje tkivne

homeostaze;

3. hormon zavisnoj redukciji broja ćelija kod adulta - ćelije endometrijuma tokom

menstrualnog ciklusa;

4. deleciji ćelija u ćelijskim populacijama koje karakteriše visok nivo proliferacije -

epitelne ćelije intestinalnih kripti gastrointestinalnog trakta;

5. u imunskom odgovoru tokom regulisane eliminacije specifičnih ćelijskih populacija,

kao i samih autoreaktivnih ćelija imunskog sistema;

6. uklanjanju transformisanih ili na drugi način oštećenih ćelija.

Rezultati eksperimentalnih istraživanja brojnih laboratorija pokazuju da postoji

čitav niz faktora koji mogu stimulatorno ili inhibitorno uticati na proces apoptoze.

Jonizujuće zračenje, virusna infekcija, toplotni stres i bilo koja druga promena spoljne

sredine koju ćelija prepoznaje kao stres jesu znak da ćelija aktivira program svog

3

suicida. Svi prirodni i veštački agensi koji dovode do oštećenja DNK mogu se, takođe,

smatrati induktorima procesa apoptoze (slobodni radikali, npr.). Naravno, postoji i veliki

broj fizioloških aktivatora procesa apoptoze, kao što su faktori rasta, neurotransmiteri,

hormoni, itd. Limfociti T koji su CD8+ imaju sposobnost indukcije procesa apoptoze

drugih ćelija.

Postoji čitav niz bolesti čoveka tokom kojih dolazi do inhibicije procesa apoptoze.

To su, pre svega, maligne bolesti. Inhibicija procesa apoptoze karakteriše i brojna auto-

imunska oboljenja. Istovremeno postoje mnoge bolesti kod kojih dolazi do stimulacije

procesa apoptoze. U prvom redu to su neurološka oboljenja, kao što su Parkinsonova

bolest, Alchajmerova bolest i ALS (amilotrofična lateralna skleroza). Progresivno

umiranje CD4+ limfocita T procesom apoptoze karakteristika je infekcije izazvane

virusom humane imunodeficijencije (HIV).

Na osnovu ovih saznanja, apoptoza je kao genski regulisan proces postala tema

brojnih molekularno-bioloških studija koje za cilj imaju istraživanja patofizioloških

mehanizama nastanka i lečenja bolesti čoveka.

1.1.2. Morfološke karakteristike procesa apoptoze

Apoptoza je asinhrona pojava koja zahvata pojedinačne ćelije tkiva. To je veoma brz

proces koji ćeliju iz jedne ćelijske populacije može „ukloniti“ za manje od 4 sata. U toku

procesa apoptoze dolazi do karakterističnih morfoloških promena koje se ispoljavaju bez

obzira na vrstu tkiva ili okolnosti pod kojim je izazvana. Upravo je ovaj ustaljeni obrazac

morfoloških promena bio presudan za pretpostavku da su u osnovi procesa apoptoze

pre aktivni nego pasivni ćelijski procesi.

Morfološke promene u toku ovog procesa mogu se podeliti na promene rane i

kasne faze procesa apoptoze. Prvi morfološki znak apoptoze predstavlja kondenzacija

hromatina, najčešće u marginalnim oblastima nukleusa. Uporedo sa izmenama

hromatina, u ovoj ranoj „kondenzacijskoj” fazi apoptoze, dolazi i do kondenzacije

citoplazme (slika 3). Kondenzacija nukleusa i citoplazme dovodi do smanjenja

zapremine ćelije, uz povećanje gustine citoplazme, sabijanja intaktnih organela i

razgradnje citoskeleta.

Kasnu fazu apoptoze obeležava segmentacija nukleusa i fragmentacija

citoplazme. Na ćelijskog membrani dolazi do pojave većeg broja citoplazmatskih izvrata.

Ovaj proces Ker je nazvao „pupljenje“ ćelijske membrane (slika 4).

4

Slika 3. Elektronsko-mikroskopski snimak limfocita B periferne krvi čoveka. Strelicom obeležena ćelija smanjene zapremine i kondezovanog hromatina koja se nalazi u procesu apoptoze (TEM, 20.000x).

Slika 4. Shematski prikaz morfoloških promena tokom procesa apoptoze. Objašnjenje dato u tekstu.

Završnu fazu procesa apoptoze karakteriše pojava fragmenata apoptotske ćelije

koji su okruženi ćelijskom membranom i nazivaju se apoptotska tela. Apoptotska tela

podležu procesu fagocitoze u kom učestvuju makrofagi, dendritske i druge ćelije

parenhima ili okolne ćelije. To je krajnja faza apoptoze - faza fagocitoze i unutarćelijske

razgradnje (slika 4). Proces fagocitoze apoptotskih tela karakteriše i odsustvo

5

zapaljenske reakcije. Apoptotska tela, koja se formiraju u eksperimentalnim uslovima in

vitro, ne bivaju fagocitovana. Ona spontano propadaju, u toku nekoliko sati, procesom

koji se naziva sekundarna nekroza.

Određene morfološke karakteristike procesa nekroze (značajna razgradnja

citoskeleta i „pupljenje“ ćelijske membrane) veoma su slične karakteristikama kasne faze

procesa apoptoze. Identifikacija biohemijskih mehanizama koji prate morfološke

promene apoptoze, pomaže u boljem razlikovanju ove dve vrste ćelijske smrti.

1.1.3. Biohemijske karakteristike procesa apoptoze

Najizučavaniji biohemijski aspekt procesa apoptoze predstavljaju promene na

molekulu DNK. Tokom rane faze procesa apoptoze dolazi do inicijalne fragmentacije

molekula DNK u okviru hromatinskih petlji na fragmente veličine od 50 – 300 kb.

Morfološki uočljivu kondenzaciju hromatina prati fragmentacija molekula DNK na

fragmente od približno 180 bp. Endonukleaza koja je odgovorna za internukleozomalnu

fragmentaciju molekula DNK nije još prečišćena i potpuno opisana. Na agaroznom gelu,

genomska DNK izolovana iz apoptoske ćelije daje karakteristična izgled nalik

merdivinama.

Tokom procesa apoptoze uočena je pojava promene orijentacije molekula

fosfatidilserina (PS) sa unutrašnje na spoljašnju stranu ćelijske membrane. Ova

promena lokacije PS definiše se kao signal „pojedi me“ („eat me“) preko kojeg fagociti i

druge ćelije prepoznaju apoptotsku ćeliju. Detekcija PS na spoljašnjoj strani ćelijske

membrane predstavlja i jednu od metoda detekcije apoptotskih ćelija.

Rezultati eksperimentalnih studija rađenih na nematodi C. elegans dali su dokaze o

ulozi enzima proteaza u procesu apoptoze. Ovo je podstaklo brojne naučnike da svoja

istraživanja usmere u pravcu uloge enzima proteaza i u procesu programirane ćelijske

smrti složenijih organizama, uključujući i čoveka. U skorije vreme učinjen je veliki

napredak u razumevanju molekularnih mehanizama izvršne faze apoptoze u kojoj je

dokazano učešće enzima proteaza, naročito zasebne familije cistein proteaza, kaspaza.

1.1.4. Apoptoza versus Nekroza

Postoje mišljenja da su apoptoza i nekroza „dva lica“ iste vrste ćelijske smrti.

Međutim, i ako obe vrste ćelijske smrti mogu indukovati isti stimulusi, rezultati brojnih

eksperimentalnih istraživanja idu u prilog činjenici da su apoptoza i nekroza dva različita

fenomena. Različiti odgovor ćelija na dejstvo istog stimulusa objašnjava se dužinom i

jačinom stimulusa.

Za razliku od apoptoze, nekroza se definiše kao pasivan proces koji nastaje pod

dejstvom nefizioloških uslova spoljašnje sredine. Ovaj proces je energetski nezavisan,

6

dok odvijanje apoptoze zahteva energiju (ATP). Glavna morfološka razlika ova dva

procesa je u tome što kod nekroze dolazi do bubrenja ćelijske membrane i lize ćelije uz

oslobađanje lizozomskih enzima koji indukuju zapaljensku reakciju. Za razliku od

apoptoze, fragmentacija DNK kod nekroze je „nasumična”, pa se na agaroznom gelu

uočavaju fragmenti različite veličine u vidu razmaza. Zbir osnovnih razlika između

apoptoze i nekroze dat je u tabeli 1.

Tabela 1. Apoptoza versus Nekroza

1.2. Molekularna osnova procesa apoptoze

1.2.1. Induktori procesa apoptoze

„Odluka“ ćelije da uđe u proces apoptoze može biti posledica vanćelijskih signala

smrti. To su najčešće specifični ligandi za tzv. receptore smrti (eng. death receptors,

DRs). Receptori smrti pripadaju familiji TNFRs (eng. tumour necrosis factor receptors,

TNFRs).

Vezivanjem odgovarajućih vanćelijskih molekula za receptore smrti, procesom

prenosa signala, moguće je aktiviranje procesa apoptoze. Najpoznatije ligande, koji

vezivanjem za svoje receptore indukuju proces apoptoze, predstavljaju TNF- (ligand za

TNFR 1 receptor) i Fas ligand (za receptor Fas poznat i pod nazivima CD95 i APO-1).

Fas ligand (FasL) je trimer, protein težak 40kDa, koji vezivanjem za receptor Fas

indukuje proces apoptoze. Receptor Fas je transmembranski receptor tipa I težak

45kDa. Prisutan je na ćelijskim membranama različitih tipova ćelija, uključujući i limfocite

T i NK ćelije čoveka. Receptori smrti, kao što je receptor Fas, poseduju citoplazmatske

domene veličine od približno 80 aminokiselinskih ostataka koji se zbog svog značaja u

prenosu signala nazivaju domeni smrti (eng. death domains, DDs) (slika 5).

Vrsta ćelijske smrti Apoptoza Nekroza

Pojava Asinhrona Masivna

Energetski zavisan proces Da Ne

Fragmentacija molekula DNK Uniformna Nasumična

Oštećenja na organelama Ne / Da Da

Apoptotska tela Da Ne

Liza ćelije Ne Da

Zapaljenska reakcija Ne Da

Ožiljak u tkivu Ne Da

7

Slika 5. Uloga kompleksa DISC u indukciji procesa apoptoze. Vezivanjem liganda (vanćelijskog signala smrti) za receptor Fas dolazi do konformacione promene koja omogućava interakciju domena smrti receptora sa domenima smrti proteina FADD. Protein FADD interaguje sa kaspazom 8 putem domena DED i na taj način formira se kompleks DISC.

Aktivacija receptora indukuje interakciju receptornih domena smrti sa homolognim

domenima smrti unutarćelijskih proteina koji se nazivaju proteinski adapteri. Tako,

domeni smrti receptora Fas interaguju sa homolognim domenima proteinskog adaptera

koji se naziva protein FADD (eng. Fas-associated death domain, FADD). Proteini

adapteri sadrže i efektorne domene smrti (eng. death effector domains, DEDs).

Domeni DED interaguju sa sebi homolognim efektornim domenima smrti enzima

kaspaze 8.

Kaspaza 8 je prvi enzim koji se tokom prenosa vanćelijskog signala smrti aktivira u

ćeliji i indukuje kaskadnu reakciju aktivacije drugih apoptotskih enzima, kaspaza. Zbog

svoje biološke uloge kaspaza 8 dobila je naziv inicijator kaspaza. Kompleks proteina –

receptor Fas, protein FADD i prokaspaza 8, koji indukuje proces apoptoze, naziva se

kompleks DISC (eng. Death Inducing Signaling Complex, DISC) (slika 5).

8

Osim vanćelijskim, proces apoptoze može biti indukovan i unutarćelijskim

signalima smrti. Unutarćelijski signali smrti najčešće se aktiviraju kao odgovor ćelije

na različite oblike stresa. Lekovi i druga toksična jedinjenja, toplotni stres, zračenje,

hipoksija i virusna infekcija najčešći su uzročnici aktivacije unutarćelijskih signala smrti.

Mehanizmi kojima različite vrste stresova aktiviraju biohemijsku mašineriju apoptoze

nisu potpuno poznati. Smatra se da intenzitet i dužina trajanja stresa predstavljaju

ključne faktore u „odluci“ ćelije da aktivira program svog samouništenja.

1.2.1. Efektori procesa apoptoze

Bez obzira na vrstu stimulusa (vanćelijski ili unutarćelijski) koji ga indukuje,

ključni događaj tokom procesa apoptoze predstavlja kaskadna reakcija proteolitičke

aktivacije članova familije enzima cistein proteaza – kaspaza. Kaskadna reakcija

aktivacije kaspaza glavna je karakteristika tzv. egzekutorne ili izvršne faze procesa

apoptoze. Kaspaze su aspartat-specifične cistein proteaze. U ćelijama čoveka otkrivena

je familija enzima kaspaza od 14 članova. Prema svojoj biološkoj ulozi u ćeliji one se deli

u dve potfamilije: potfamilija inflamatornih kaspaza (kaspaze 13, 5, 4, 1) i potfamilija

apoptotskih kaspaza (kaspaze 7, 3, 6, 8, 10, 2, 9).

Sve kaspaze sintetišu se u formi proenzima (zimogena) koji se sastoji od tri

domena: a) prodomena različite dužine na N-kraju proteina; b) velike subjedinice od 20

kDa (p20); i c) male subjedinice od 10 kDa (p10) na C–kraju proteina.

Aktiviraju se proteolitičkim mehanizmom koji razdvaja (na mestu aspartata)

najpre veću (p20) od manje (p10) subjedinice, a potom u formiranom dimeru p20/p10

dolazi do razdvajanja velike subjedinice (p20) od prodomena. Poslednja faza aktivacije

kaspaza predstavlja povezivanje dva heterodimera u aktivni tetramer, koji sa dva aktivna

mesta svoju proteolitičku aktivnost ispoljava na većem broju proteina (slika 6).

Slika 6. Shematski prikaz aktivacije kaspaza. Kaspaze se aktiviraju proteolitičkim raskidanjem velike (p20) od male subjedinice (p10). U formiranom dimeru p20/p10 dolazi do razdvajanja prodomena od velike subjedinice.

Kaspaze svojom enzimskom aktivnošću vrše inaktivaciju inhibitora apoptoze i

razgradnju struktura nukleusnog matriksa, nukleusne lamine i citoskeleta. Istovremeno,

9

proteoliza predstavlja jedan od mogućih mehanizama aktivacije endonukleaza tokom

procesa apoptoze. Dezintegracija hromatina, promene na citoskletu i „pupljenje” ćelijske

membrane su morfološki uočljive manifestacije biohemijskih dešavanja nastalih

dejstvom aktiviranih kaspaza.

Aktivacija kaspaza predstavlja sigurni znak da je ćelija krenula putem suicida, i

taj se suicid, odnosno njegova izvršna faza, nikakvim mehanizmima ne može sprečiti.

U ćelijama sisara dokazano je i prisustvo prirodnih inhibitora kaspaza koji se

nazivaju proteini inhibitori apoptoze (eng. inhibitors of apoptosis proteins, IAPs). Do

sada, otkriveno je sedam članova ove familije proteina. U okolnostima kada ne postoji

apoptotski stimulus, inhibitori kaspaza uspešno onemogućavaju njihovu proteolitičku

aktivaciju i konverziju iz forme proenzima u enzim.

Poslednjih godina pokazano je da unutarćelijski signali mogu indukovati proces

apoptoze koji je nezavisan od aktiviranja enzima kaspaza. U nekim ćelijama, proces

apoptoze indukuje se aktivacijom endonukleaze G i faktora AIF (eng. apoptosis-inducing

factor, AIF). Ova dva proteina primarno su lokalizovana u mitohondrijama. Nakon

dejstva unutarćelijskog signala, oni se iz mitohondrija transportuju u nukleus.

Endonukleaza G vrši fragmentaciju molekula DNK.

1.3. Regulacija procesa apoptoze

Brojni vanćelijski i unutarćelijski signali (induktori apoptoze) mogu indukovati

proces apoptoze, u čijoj izvršnoj fazi dolazi do aktivacije kaspaza (efektori apoptoze).

Rezultati eksperimentalnih istraživanja na raznim model sistemima su pokazali da je

proces apoptoze regulisan značajnim brojem unutarćelijskih regulatora (modulatori

apoptoze).

Proteini familije Bcl 2, protein p53, proteinski produkti određenih onkogena i gena

regulatora ćelijskog ciklusa, zatim citohrom C, razni transkripcioni regulatori, određene

klase fosfataza i kinaza predstavljaju samo neke od poznatih modulatora ovog procesa.

1.3.1. Uloga proteina familije Bcl 2 u regulaciji procesa apoptoze

Proteini familije Bcl 2 ključni su unutarćelijski modulatori (regulatori) procesa

apoptoze. Prvootkriveni član familije Bcl 2 bio je protein Bcl 2 (eng. B-cell

leukemia/lymphoma 2, Bcl 2). Gen je lokalizovan na dugom kraku hromozoma 18

(q21.3). Otkriven je 1984. godine tokom ispitivanja akutne B leukemijske ćelijske linije sa

detektovanom hromozomskom translokacijom t(14;18). Istraživanja na uzorcima

periferne krvi bolesnika sa kliničkom dijagnozom folikularnog limfoma pokazala su da se

t(14;18) aktivira proto-onkogen Bcl 2. Ovom translokacijom, gen BCL 2 „prebacuje” se u

10

blizinu lokusa teškog lanca imunoglobulina, što dovodi do visokog nivoa njegove

ekspresije.

Bcl 2 je unutarćelijski protein težine 26 kDa, lokalizovan u membranama

mitohondrija, endoplazmatičnog retikuluma i u spoljašnjoj membrani nukleusnog ovoja.

Nakon proteina Bcl 2, otkrivena je čitava familija homolognih proteina od kojih neki imaju

stimulatorni, a drugi inhibitorni efekat na proces apoptoze. Kao ko-imunoprecipitat

proteina Bcl 2, prvo otkriveni pro-apoptotski homolog bio je protein Bax (eng. Bcl 2 -

associated X, Bax). To je unutarćelijski protein težine 21 kDa pretežno lociran u

citoplazmi. U ćelijama čoveka otkriveno je preko 20 članova familije proteina Bcl 2.

Svi članovi familije proteina Bcl 2 sadrže najmanje jedan od četiri visoko

konzervirana Bcl 2 homologa domena (domeni BH). Šest anti-apoptotskih članova

familije Bcl 2 (Bcl 2, Bcl–Xl, Bcl-W, MCL1, A1 i Bcl-B) sadrže sva četiri homologna

domena (BH1-BH4). Na osnovu broja homolognih domena koje sadrže, pro-apoptotski

proteini su podeljeni u dve potfamilije (slika 7).

Slika 7. Proteini familije Bcl 2. Anti-apoptotski članovi familije Bcl 2 imaju sva četiri domena BH. Po broju domena BH, pro-apoptotski članovi ove familije dele se u dve potfamilije. Potfamilju protein Bid čine proteini koji sadrže samo domen BH3.

Proteini potfamilije od tri člana (Bax, Bak i Box) sadrže tri homologna domena i

nazivaju se potfamilija proteina Bax. Ostali pro-apoptotski proteini (potfamilija

proteina Bid) sadrže samo jedan domen BH. To je domen BH3 po kome su i dobili

naziv “BH3 – only proteins”. Većina članova familije proteina Bcl 2 sadrži i domene koji

omogućavaju njihovo vezivanje za različite membrane ćelija (domeni TM). Bcl 2

homologni domeni odgovorni su za procese homodimerizacije i heterodimerizacije

proteina članova familije Bcl 2. Zahvaljujući ovim domenima BH, heterodimere formiraju i

proteini sa suprotnim dejstvom na proces apoptoze.

11

Tokom indukcije procesa apoptoze, pod dejstvom apoptotskog stimulusa

aktivirani proteini Bax formiraju dimere. Homodimeri proteina Bax formiraju kanale na

spoljašnjoj membrani mitohondrija. Istu sposobnost ima i još jedan pro-apoptotski

protein familije Bcl 2. To je protein Bak (eng. BCL‑2 antagonist/killer, Bak)(slika 8).

Slika 8. Uloga mitohondrija u procesu apoptoze. Pro-apoptotski članovi familije Bcl 2 (protein Bax i Bak) formiraju kanale na spoljašnjim membranama kroz koje citohrom C napušta mitohondrije. Protein Bcl 2 može formirati heterodimere sa proteinima Bax ili Bak i na taj način blokira formiranje njihovih homodimera, odnosno kanala, na spoljašnjim membranama mitohondrija.

Putem ovih kanala molekuli citohroma C, koji je jedan od ključnih aktivatora

izvršne faze procesa apoptoze, napuštaju mitohondrije. U slučajevima kada je

predominantno prisustvo proteina Bcl 2 u ćeliji, vezivanjem za protein Bax, ovi molekuli

inhibiraju formiranje mitohondrijalnih membranskih kanala i oslobađanje citohroma C. Na

osnovu ovih saznanja većina autora kao glavnu biološku ulogu proteina Bcl 2 u inhibiciji

procesa apoptoze smatra njegovu sposobnost vezivanja za protein Bax i

heterodimerizacionu neutralizaciju njegovog pro-apoptotskog dejstva.

Zbog izuzetnog značaja, odnos pro-apoptotskih i anti-apoptotskih homodimera i

heterodimera smatra se vrstom autonomnog „ćelijskog reostata“ koji opredeljuje vrstu

12

ćelijskog odgovora na dejstvo apoptotskog stimulusa. Međutim, postoje i suprotna

mišljenja. Na osnovu rezultata eksperimentalnog rada na transgenim miševima,

Knudson i Korsmeyer zaključuju da proteini Bcl 2 i Bax mogu i na funkcionalno

nezavisan način da regulišu proces apoptoze.

Pojedini autori smatraju da ključnu ulogu u regulaciji procesa apoptoze ćelija

sisara ima protein Bcl-X. Alternativnom obradom primarnog transkripta gena BCL-X

moguće je dobiti 2 različita molekula iRNK, odnosno dva proteina Bcl-X: duži (Bcl-Xl) i

kraći (Bcl-Xs). Protein Bcl-Xl je strukturno i funkcionalno sličan proteinu Bcl 2. Drugi

protein Bcl-Xs u heterodimernoj kombinaciji sa proteinom Bcl 2 funkcioniše kao njegov

dominantni inhibitor.

Oslobađanje citohroma C je posledica aktivacije modulatora apoptoze dejstvom

unutarćelijskih signala smrti. Citohrom C je zbog svog pozitivnog dejstva na aktivaciju

kaspaze 3 dobio naziv Apaf 2 (eng. apoptotic protease activating factor 2, Apaf 2). U

prisustvu adapterskog molekula - proteina Apaf 1, citohroma C i adenozin-trifosfata

(ATP) dolazi do proteolitičke aktivacije prokaspaze 9 (Apaf 3). Protein-protein

interakciju Apaf 1 i Apaf 3 omogućuju njihove homologne sekvence nazvane CARD

(eng. caspase recruitment domains, CARDs) (slika 9). U odsustvu citohroma C ova

interakcija je blokirana zahvaljujući strukturnoj konformaciji molekula Apaf 1.

Slika 9. Apoptozom. Citohorom C vezivanjem za protein Apaf 1 vrši njegovu konformacionu protenu. Ova promena omogućava protein-protein interakciju ovog adapterskog molekula sa enzimom prokaspazom 9. Na ovaj način formira se apoptozom u kome dolazi do proteolitičke aktivacije enzima kaspaze 9.

13

Vezivanjem citohroma C za molekul Apaf 1 dolazi do njegove konformacione

promene koja domene CARD čini dostupne za interakciju sa homolognim domenima

prokaspaze 9. Proteinski kompleks koga čine proteini Apaf 1, Apaf 2 i citohrom C naziva

se apoptozom. Rezultat ove interakcije je proteolitička aktivacija prokaspaze 9.

Aktivirana kaspaza 9 u kaskadi apoptotskih događaja aktivira kaspazu 3, što predstavlja

početak ireverzibilne, izvršne faze procesa apoptoze. Kontrolisano oslobađanje

citohroma C iz mitohondrija u citosol je neophodan uslov za otpočinjanje izvršne faze

procesa apoptoze. Upravo zbog toga mitohondrije se nazivaju ćelijskim regulatorom

života i smrti.

Proteini potfamilije proteina Bid koji sadrže samo domen BH3 na dva načina

ostvaruju svoj pro-apoptotski efekat. Proteini Bad (eng. BCL‑2 antagonist of cell death,

Bad) i NOXA inaktiviraju anti-apoptotske članove svoje familije procesom

heterodimerizacije. Drugi članovi ove potfamilije (Bid, Bim i PUMA) direktno aktiviraju

pro-apoptotske proteine Bax i Bak koji imaju sposobnost formiranja kanala na

spoljašnjim membranama mitohondrija (slika 10).

Slika 10. Uloga pro-apoptotskih članova familije proteina Bcl 2 u procesu apoptoze. Proteini Bax i Bak formiraju kanale na membranama mitohondrija. Proteini Bid, Bim i PUMA direktno aktiviraju proteine Bax i Bak dok proteini Bad, Bcl-Xs i NOXA inaktiviraju anti-apoptoske članove familije (Bcl 2, Bcl-Xl i MCL-1).

14

1.3.2. Uloga proteina p53 u regulaciji procesa apoptoze

Protein p53 otkriven je 1979. godine. Inicijalno je okarakterisan kao ko-

imunoprecipitat velikog T antigena u SV 40-transformisanim ćelijama. Čitavih deset

godina verovalo se da je gen TP53 onkogen. Godine 1989. Bert Vogelstein i saradnici,

na osnovu istraživanja mutacija gena TP53, zaključuju da je protein p53 tumor-

supresorni protein. Od tada započinju intenzivna izučavanja ovog gena i njegovog

proteinskog produkta. Na osnovu broja naučnih studija, časopis Science 1993. godine

protein p53 proglašava za „Molekul godine” („Molecule of the Year“). Gen TP53

lokalizovan je na 20 kb dugoj sekvenci čovečijeg hromozoma 17 (17p13.1) kod čoveka.

Gen TP53 sastoji se od 11 egzona koji se prepisuju u iRNK dugu 1,8 kb. Prepisuje

se sa tri promotora. Pored uzvodnog promotora, poseduje promotore i u intronu 1 i

intronu 4. Proteinski produkt ovog gena od 375 aminokiselina ima molekulsku masu od

oko 53 kDa. U okviru proteinske sekvence razlikuje se nekoliko bitnih domena (slika

11):

na amino kraju (1-44 ak) nalazi se transaktivacioni domen odgovoran za

aktivaciju transkripcije ciljnih gena;

prolin-bogat domen (58-101ak) sa funkcijom u odgovoru proteina p53 na

oštećenja DNK procesom apoptoze;

DNK-vezujući domen (102-292ak) odgovoran za interakciju ovog proteina sa

molekulom DNK (ovaj domen najčešće je pogođen mutacijama); i

oligodimerizacioni domen (325-356 ak) odgovoran za vezivanje sa drugim

molekulima p53.

Slika 11. Shematski prikaz peptidnog lanca p53. Objašnjenje dato u tekstu.

Poluživot ovog proteina je kratak i iznosi od 5 do 20 minuta, a svoju biološku

ulogu ispoljava kao regulatorni protein transkripcije (slika 12). Metodom hromatin

imunoprecipitacije do sada je identifikovano preko 540 sekvenci u genomu čoveka koje

sadrže potencijalna vezujuća mesta za protein p53.

15

Slika 12. Protein p53 je regulatorni protein transkripcije. Protein p53 je transkripcioni represor gena čiji su proteinski produkti odgovorni za normalnu propagaciju ćelije kroz faze ćelijskog ciklusa. Istovremeno, on je i transkripcioni aktivator gena čiji su proteinski produkti uključeni kako u procese zaustavljanja ćelijskog ciklusa u fazi G1, tako i u indukciju procesa apoptoze.

U ćelijama se razgradnja proteina p53 ostvaruje posredstvom ubikvitin ligaze E3

koja je nazvana protein Mdm2 (eng. murine double minute 2, Mdm2). U uslovima

dejstva stresa na ćeliju dolazi do raskidanja heterodimera proteina p53 i Mdm2 i

blokiranja procesa razgradnje. Posttranslaciona modifikacija proteina p53 fosforilacijom

je odgovorna za stabilizaciju molekula i produžetak njegovog poluživota na nekoliko sati.

Kao posledica nagomilavanja proteina p53, u zavisnosti od jačine stresa, dolazi do

zaustavljanja ćelijskog ciklusa ili indukcije procesa apoptoze.

Zaustavljanje ćelijskog ciklusa u fazi G1 (tzv. „G1 zastoj”) za ćeliju predstavlja

„time out“ koji koriste reper mehanizmi da isprave oštećenja u molekulu DNK. U

neizmenjenim ćelijama tkiva, ovo vreme je dovoljno za ispravljanje većeg dela

oštećenja, i posle G1 zastoja ćelija nastavlja svoj ćelijski ciklus. Ukoliko je broj oštećenja

na molekulu DNK veliki, protein p53 indukuje proces apoptoze. Kada je protein p53 na

bilo koji način inaktiviran (najčešće mutacijama), ne dolazi do indukcije procesa

apoptoze zavisnog od proteina p53. To je čest slučaj u neoplastično transformisanim

ćelijama, što za rezultat ima agresivniji tumorski rast.

Uloga proteina p53 u indukciji procesa apoptoze je dvojaka. Kao aktivator

transkripcije učestvuje u regulaciji ekspresije pro-apototskih gena (PUMA, NOXA, BAX,

APAF 1). Pored toga, direktnom interakcijom sa proteinom Bcl-Xl favorizuje formiranje

dimera proteina Bax (slika 13).

16

Slika 13. Uloga proteina p53 u indukciji procesa apoptoze. Kao transkripcioni aktivator indukuje ekspresiju pro-apoptotskih gena, a direktnom interakcijom sa proteinom Bcl-Xl favorizuje formiranje homodimera proteina Bax.

17

Ključni koncepti

Danas se ćelijska smrt deli na akcedentalnu i regulisanu ćelijsku smrt.

Programirana ćelijska smrt je vrsta regulisane ćelijske smrti. Prema morfološkim

karakteristikama razlikuju se tri tipa ćelijske smrti. Ćelijska smrt tipa I – apoptoza

(ćelijsko samoubistvo), ćelijska smrt tipa II – autofagija i ćelijska smrt tipa III –

nekroza (ćelijsko ubistvo).

Apoptoza je aktivan proces genski regulisanog ćelijskog samouništenja i u većini

slučajeva služi homeostatskoj funkciji. Programirana ćelijska smrt po tipu

apoptoze opisana je u normalnim fiziološkim uslovima (tokom procesa

embriogeneze, diferencijacije i u procesima razvoja i regulacije imunskog

sistema), kao i u nizu patoloških stanja organizma.

Morfološke promene u toku ovog procesa mogu se podeliti na promene rane i

kasne faze procesa apoptoze. Kondenzacija nukleusa i citoplazme dovodi do

smanjenja zapremine ćelije, uz povećanje gustine citoplazme, sabijanja intaktnih

organela i razgradnje citoskeleta. Kasnu fazu apoptoze obeležava segmentacija

nukleusa i fragmentacija citoplazme. Završnu fazu procesa apoptoze karakteriše

pojava fragmenata apoptotske ćelije koji su okruženi ćelijskom membranom i

nazivaju se apoptotska tela. Apoptotska tela podležu procesu fagocitoze.

Najizučavaniji biohemijski aspekt procesa apoptoze predstavljaju promene na

molekulu DNK. Tokom rane faze procesa apoptoze dolazi do inicijalne

fragmentacije molekula DNK u okviru hromatinskih petlji na fragmente veličine od

50 – 300 kb. Morfološki uočljivu kondenzaciju hromatina prati fragmentacija

molekula DNK na fragmente od približno 180 bp.

„Odluka“ ćelije da uđe u proces apoptoze može biti posledica vanćelijskih signala

smrti. To su najčešće specifični ligandi za tzv. receptore smrti. Kaspaza 8 je prvi

enzim koji se tokom prenosa vanćelijskog signala smrti aktivira u ćeliji i indukuje

kaskadnu reakciju aktivacije drugih apoptotskih enzima, kaspaza. Zbog svoje

biološke uloge kaspaza 8 dobila je naziv inicijator kaspaza. Kompleks proteina –

receptora, protein adaptera i prokaspaza 8, koji indukuje proces apoptoze,

naziva se kompleks DISC.

Osim vanćelijskim, proces apoptoze može biti indukovan i unutarćelijskim

signalima smrti. Unutarćelijski signali smrti najčešće se aktiviraju kao odgovor

ćelije na različite oblike stresa.

18

Bez obzira na vrstu stimulusa (vanćelijski ili unutarćelijski) koji ga indukuje,

ključni događaj tokom procesa apoptoze predstavlja kaskadna reakcija

proteolitičke aktivacije članova familije enzima cistein proteaza – kaspaza.

Kaspaze svojom enzimskom aktivnošću vrše inaktivaciju inhibitora apoptoze i

razgradnju struktura nukleusnog matriksa, nukleusne lamine i citoskeleta.

Brojni vanćelijski i unutarćelijski signali (induktori apoptoze) mogu indukovati

proces apoptoze, u čijoj izvršnoj fazi dolazi do aktivacije kaspaza (efektori

apoptoze). Rezultati eksperimentalnih istraživanja na raznim model sistemima su

pokazali da je proces apoptoze regulisan značajnim brojem unutarćelijskih

regulatora (modulatori apoptoze).

Proteini familije Bcl 2 ključni su unutarćelijski modulatori (regulatori) procesa

apoptoze. Svi članovi familije proteina Bcl 2 sadrže najmanje jedan od četiri

visoko konzervirana Bcl 2 homologa domena (domeni BH). Bcl 2 homologni

domeni odgovorni su za procese homodimerizacije i heterodimerizacije proteina

članova familije Bcl 2. Zahvaljujući ovim domenima BH, heterodimere formiraju i

proteini sa suprotnim dejstvom na proces apoptoze. Pro-apoptotski članovi

familije Bcl 2 (protein Bax i Bak) formiraju kanale na spoljašnjim membranama

kroz koje citohrom C napušta mitohondrije. Protein Bcl 2 može formirati

heterodimere sa proteinima Bax ili Bak i na taj način blokira formiranje njihovih

homodimera, odnosno kanala, na spoljašnjim membranama mitohondrija. Zbog

izuzetnog značaja, odnos pro-apoptotskih i anti-apoptotskih homodimera i

heterodimera smatra se vrstom autonomnog „ćelijskog reostata“ koji opredeljuje

vrstu ćelijskog odgovora na dejstvo apoptotskog stimulusa.

Citohorom C vezivanjem za protein Apaf 1 vrši njegovu konformacionu protenu.

Ova promena omogućava protein-protein interakciju ovog adapterskog molekula

sa enzimom prokaspazom 9. Na ovaj način formira se apoptozom u kome dolazi

do proteolitičke aktivacije enzima kaspaze 9.

Protein p53 je transkripcioni represor gena čiji su proteinski produkti odgovorni

za normalnu propagaciju ćelije kroz faze ćelijskog ciklusa. Istovremeno, on je i

transkripcioni aktivator gena čiji su proteinski produkti uključeni kako u procese

zaustavljanja ćelijskog ciklusa u fazi G1, tako i u indukciju procesa apoptoze.

Kao transkripcioni aktivator indukuje ekspresiju pro-apoptotskih gena, a

direktnom interakcijom sa proteinom Bcl-Xl favorizuje formiranje homodimera

proteina Bax.

19

Pitanja

1. Šta je apoptoza i navedi njenu ulogu u normalnim fiziološkim stanjima organizma?

2. Navedi najznačajnije morfološke karakteristike procesa apoptoze.

3. Navedi najznačajnije biohemijske karakteristike procesa apoptoze.

4. Koje su osnovne razlike između procesa apoptoze i nekroze ?

5. Objasni dešavanja u ćeliji u kojoj je proces apoptoze indukovan vanćelijskim signalima.

6. Objasni dešavanja u ćeliji u kojoj je proces apoptoze indukovan unutarćelijskim

signalima.

7. Koja je uloga Bcl 2 familije proteina u procesu apoptoze ?

8. Koja je uloga proteina p53 u procesu apoptoze ?

9. Šta su kasapaze i koja je njihova uloga u ćeliji ?

10. Objasni ulogu mitohondrija u procesu apoptoze.