10-investigacion en biodeterioro
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UNIDAD 10
INVESTIGACIÓN EN BIODETERIORO Y BIODEGRADACIÓN
Introducción y Objetivos de la Unidad La última Unidad de la Asignatura está dedicada a la Investigación del
Biodeterioro y la Biodegradación de los materiales. Una vez que hemos estudiado los
materiales susceptibles de sufrir Biodeterioro, los agentes biodeterioradores y las causas
de su desarrollo sobre los materiales, debemos conocer cómo abordar el estudio de estos
procesos para, posteriormente poder aplicar los mecanismos de prevención y control
que ya tratamos en la unidad anterior. Los objetivos de la Unidad son:
Conocer el funcionamiento y desarrollo de una auditoría.
Identificar las etapas de una investigación en Biodeterioro y las medidas
a realizar en cada una de ellas.
Aprender las diferentes técnicas de ensayo de Biodeterioro, así como de
detección de los microorganismos implicados.
Índice de la Unidad
1. La Auditoría de la Fábrica
1.1. Evaluación de Estrategias de Control
1.2. Instauración del Sistema de Control
1.3. Monitorización de la Eficacia del Sistema
2. Técnicas de Detección de Microorganismos Causantes de Biodeterioro
2.1. Muestreo
2.2. Detección y Enumeración
3. Técnicas de Ensayo de Biodeterioro
3.1. La Selección Preliminar
3.2. El Ensayo de Simulación Medioambiental
3.3. El Ensayo de Campo
3.4. Ensayos Normalizados en Biodeterioro
4. Técnicas Recientes de Investigación en Biodeterioro
4.1. Técnicas de Análisis de Ácidos Nucleicos
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4.2. Análisis de Comunidades
4.3. Proteómica
4.4. Técnicas de Análisis de Superficies
4.5. Microsensores
5. El Futuro
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La prevención y el control de un problema de Biodeterioro requieren el
conocimiento de la composición del producto, de los detalles del proceso y la
fabricación, información sobre la cadena de suministro y la aplicación para poder
recomendar la solución más justa para todas las partes implicadas. Ya que los materiales
involucrados tienen un valor, puede ser necesario establecer o repartir la responsabilidad
para abordar un problema y, por tanto, en algunos casos se puede necesitar un “enfoque
forense”.
En las dos últimas décadas, la experiencia en esta área ha sido recogida por los
fabricantes y formuladores de los productos de conservación como parte del servicio de
atención al cliente. Han desarrollado metodologías y construido bancos de datos con su
experiencia y han revisado minuciosamente las normas nacionales e internacionales
para la evaluación de la eficacia de los productos de conservación y la durabilidad de
los materiales para los que se requiere resistencia microbiana. En ciertas áreas, como la
de la madera, la piedra y la alimentación, todavía existen agencias gubernamentales y
algunas consultorías que pueden proporcionar una visión independiente.
Para la investigación de un problema de Biodeterioro, es necesario considerar
cuatro etapas:
Determinar la causa.
Valorar posibles sistemas de control.
Establecer el sistema de control más apropiado.
Monitorizar el éxito (o lo contrario).
1. La Auditoría de la Fábrica Muchos problemas de Biodeterioro tienen su origen en los procesos industriales
y es imposible apreciar todos los factores involucrados a menos que se haga una visita
al lugar de manufactura y se efectúe una inspección completa de la situación. De esta
manera, se puede recoger información acerca del almacenamiento y manipulación de las
materias primas, configuración del equipo de fabricación, fases del proceso de
fabricación y almacenamiento final o sistemas de distribución. Los problemas de
Biodeterioro en las fábricas son, a menudo, complejos y suponen la interacción de
varios factores de naturaleza interdisciplinar. Uno de los principales factores de esta
complejidad es la participación de personas que tienen un conocimiento muy escaso de
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este campo y poca o ninguna formación en biología. Por lo tanto, el técnico no solo
tiene que ser experto y competente en los problemas técnicos, sino que además también
debe de ser perito en detección y en saber buscar compromisos con diplomacia. Antes
de que un problema de Biodeterioro se pueda resolver, hay que reconocerlo. Los
problemas no microbianos pueden ser relativamente fáciles de diagnosticar. Varios
centímetros roídos por ratas en la parte inferior de una puerta, marcas de dientes de
roedores en el cableado de un equipo de radio junto con sus excrementos, ejércitos de
cucarachas en marcha en una sala de un hospital, todos son signos bastante claros de un
problema biológico y la mayoría de la gente sería capaz de reconocerlos como tal. Lo
que ocurre con los microorganismos es completamente diferente. Por definición, estos
organismos son difíciles de ver y se encuentran inmersos en el material que está siendo
atacado. Donde los efectos son tales como para proporcionar alguna evidencia sobre la
superficie, la apariencia real, para un inexperto, no es necesariamente distinta de la que
produciría la acumulación de suciedad o materia prima desecada. El menú microbiano
también supone una dificultad añadida. Las ratas, los ratones y las cucarachas se
alimentan de materiales que constituyen comida real, pero ¿es razonable esperar que un
trabajador de una fábrica se dé cuenta de las actividades de las bacterias en un fluido de
corte, una pintura o un plástico? Por todo esto, algunas compañías realizan seminarios
para explicar a sus empleados la actividad de los microorganismos, cómo reconocer sus
efectos y las medidas de control a tomar.
Cuando se recurre a un técnico para pedirle consejo, éste debe hablar con todo el
personal involucrado en el proceso, incluso si el contacto inicial, que probablemente
será la dirección, le da todas las garantías de que no es necesario. El técnico debe ser
diplomático, ya que la dirección no siempre está al corriente de todo lo que realmente
ocurre en los talleres, incluso aunque los procedimientos estén detallados por escrito. La
adición de un biocida en la cantidad adecuada en la fábrica es un buen ejemplo de este
problema. La dosificación de materias primas suele estar automatizada en las fábricas
modernas y cuenta con sistemas de seguridad que evitan que el producto sea
manufacturado hasta que todos los ingredientes o premezclas hayan sido incorporados.
Sin embargo, se pueden producir adiciones manuales, especialmente tratándose de
cantidades pequeñas (los biocidas se pueden añadir en una cantidad tan pequeña como
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del 0,1% del total de la mezcla) y, entonces, surge la duda de si se le añadió el biocida o
no.
El siguiente paso es llevar a cabo una bioauditoría de la fábrica. Esto conlleva la
toma de muestras de las materias primas en diferentes estados a lo largo de su paso por
la planta (no se deben olvidar los tanques de agua que a menudo son un depósito para el
desarrollo de biopelículas), identificando y muestreando las etapas críticas en la
fabricación en las que se puede desarrollar o introducir contaminación, sin olvidar
ningún envase usado para contener el producto (las líneas de llenado suelen ser fuentes
de contaminación). El técnico debe ir equipado con una bolsa de “herramientas”
apropiada para cubrir todas las situaciones posibles. Envases estériles, una
cuchilla/bisturí, fórceps, lupas, hisopos, un rotulador y recursos para esterilizar las
herramientas son algunos de los materiales necesarios. Suele ser bastante útil que, en
esta fase, se encuentren involucrados más de un técnico - uno para mantener ocupado al
representante de la empresa, mientras que el otro hace un examen más exhaustivo. El
técnico debe realizar la toma de muestras metódicamente, rechazando, de forma
educada, las ofertas de ayuda y de muestras de fecha y origen desconocido. Es
importante que el técnico quede satisfecho de que las muestras que ha recogido son
representativas del problema. Ponemos énfasis en este punto ya que es muy fácil que
traten de persuadirle para que acepte una muestra de buena fe y así ahorrar tiempo o los
inconvenientes asociados con la visita al lugar de muestreo. El siguiente relato puede
servir de ejemplo.
Se requería una muestra de agua de río para establecer la susceptibilidad
microbiológica de un material en dicho ambiente. Se iba a recoger la muestra del río en
un lugar donde había trabajos de construcción y se había llegado a un acuerdo con el
ingeniero de la obra para acceder al lugar durante las horas de trabajo. Al llegar, el
técnico fue pasado de uno en uno por la cadena de mando mientras que alguien le quitó
de sus propias manos uno de los envases que había llevado para rellenarlo en una
tubería cercana. Cuando explicó que necesitaba agua del río, ¡le preguntaron que por
qué quería agua contaminada y sucia cuando había un montón de agua potable limpia
disponible! ¡Imagínense el resultado si se hubieran enviado los envases al lugar de la
obra!
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Al finalizar la visita, se le puede pedir al técnico que presente un breve informe
de forma oral a las partes interesadas mientras aún está en las instalaciones.
Seguramente le pedirán una solución o mitigación del problema a corto plazo. Solo si
tiene experiencia previa en resolver tales problemas podrá recomendar esas soluciones.
Se debería establecer un buen contacto con al menos un miembro de la empresa que
pueda actuar como enlace para agilizar la solución del problema. Finalizada la visita, el
laboratorio de investigación examinará las muestras de la bioauditoría para determinar
los niveles de contaminación, diferenciando el crecimiento bacteriano y fúngico. La
identificación a nivel de especie no es recomendable en esta fase, puesto que consume
mucho tiempo, es costoso y, a menudo, no es necesario a largo plazo. Se aprecia que se
dé una respuesta rápida, pero creíble, y que se transmita al cliente una idea del tiempo
necesario para resolverlo. Cualquier informe debe redactarse de forma que se entienda
claramente por personas que no sean biólogos y teniendo en cuenta, además, que el
informe puede pasar a terceras personas para su revisión. Nosotros hemos establecido
un banco de conocimientos en el que los problemas se pueden clasificar en cinco tipos:
1. Causa única.
2. Causa múltiple.
3. Pista falsa.
4. Inherentemente insoluble.
5. Desaparecido desde hace tiempo.
Estas categorías nos han ayudado a usar los casos prácticos en la enseñanza del
Biodeterioro y, de hecho, a concebir métodos selectivos para investigar las diferentes
categorías una vez que se hayan definido. Las categorías, con los casos prácticos
apropiados se repasan brevemente a continuación.
El problema de causa única se detecta rápidamente, y una acción correctora
proporciona una solución eficaz.
El problema de causa múltiple es el que se encuentra con más frecuencia y se
trata de un gran número de factores interrelacionados. Cada uno de ellos debe ser
valorado antes de que se pueda recomendar un régimen eficaz de acciones correctoras.
Es necesaria la monitorización de los efectos de dichas acciones.
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De vez en cuando el técnico debe aceptar que el problema no es biológico y a
esto lo llamamos pista falsa.
La falta de información disponible para el técnico es, a menudo, un factor
añadido. El problema inherentemente insoluble surge de la incapacidad de soportar las
condiciones medioambientales y proteger al material del deterioro a medio plazo; por
ejemplo, la rápida lixiviación de biocida bajo condiciones severas (como la inmersión
repetida en agua o en detergente líquido) deja un material desprotegido que puede ser
posteriormente atacado por agentes causantes de Biodeterioro.
En la última categoría, el problema desaparecido desde hace tiempo, no se suele
consultar con un técnico hasta mucho después de que el ataque inicial haya ocurrido,
quizás años. Normalmente, es el resultado de un litigio prolongado o de reclamaciones
del seguro en el que una o ambas partes no han pedido consejo biológico en su
momento. Se presenta el producto para su evaluación después de que el organismo
causante del problema haya desaparecido hace mucho tiempo. El resultado es que las
conclusiones son, a menudo, circunstanciales.
1.1. Evaluación de Estrategias de Control
Es casi inevitable que en la fabricación de productos industriales haya una
necesidad de mejorar la higiene de la fábrica y el uso de conservantes químicos
adecuados. No podemos esperar que un conservante moderno haga frente a una
contaminación continua por problemas en la fabricación por dos razones: la
concentración del conservante en el producto está limitada por reglamentación y hay un
riesgo de desarrollo de tolerancia microbiana al conservante. Un buen mantenimiento e
higiene de la fábrica son la clave para un sistema de control integrado. Una vez que la
bioauditoría haya identificado los puntos débiles en la higiene de la fábrica, se podrán
entonces recomendar las medidas de mantenimiento.
El conocimiento de la composición del producto y su aplicación servirá de ayuda
en la recomendación de sistemas de conservación adecuados. También es importante el
tipo de contaminación, ya que muchos conservantes son parcialmente específicos para
el control de bacterias, hongos o algas. El laboratorio de investigación podrá llevar a
cabo un ensayo de resistencia para evaluar la capacidad del producto (que lleva el
conservante candidato) para resistir la contaminación por organismos estándares únicos,
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inóculos mixtos, u organismos cultivados procedentes de la fábrica (denominados con
frecuencia “organismos de la casa”). Se pueden emplear diferentes condiciones para
evaluar la resistencia del conservante, las cuales se describen con detalle más abajo, en
esta Unidad.
1.2. Instauración del Sistema de Control
Las recomendaciones de higiene para la fábrica suponen la introducción de
procedimientos de limpieza, tratamientos de agua, eliminación de puntos muertos y el
uso de sistemas desinfectantes en las entradas para controlar la contaminación del aire.
En muchas situaciones se acordará la realización de una prueba industrial del nuevo
sistema conservante. Esto conlleva evaluar el conservante y/o las medidas de higiene de
la fábrica durante la fabricación del producto. Como se trata de una operación
comercial, se deben tomar medidas para asegurarse de que el producto no sale de la
fábrica en condiciones inadecuadas. El propósito de este ejercicio es establecer que las
estrategias de control recomendadas funcionan en la práctica. Se debe establecer un
programa de bioauditoría detallado de forma que se tomen muestras de todas las etapas
críticas. Si hay indicaciones de que el sistema está fallando, entonces habrá que tomar
medidas correctoras para limitar la pérdida del producto o permitir que sea reprocesado.
1.3. Monitorización de la Eficacia del Sistema
Una vez establecido un sistema de control mejorado, es aconsejable que se
hagan bioauditorías de forma periódica por parte del proveedor del conservante o del
laboratorio asesor para que se detecten cuanto antes los problemas potenciales y se
puedan iniciar acciones correctoras. Se puede usar un semáforo (verde, amarillo, rojo) o
un sistema de alarma numérico para evitar el pánico innecesario al primer signo de una
colonia bacteriana aislada de una muestra. Dependiendo del proceso, se puede aceptar
cierto nivel de contaminación bacteriana, mientras no cause efectos desfavorables en la
integridad del producto. Un incremento sobre este nivel aconsejaría iniciar una segunda
evaluación. Si esta segunda evaluación confirma el primer resultado, entonces se
iniciaría una acción específica. Si esta deja el problema bajo control, comenzaría de
nuevo la monitorización normal. El cliente y el laboratorio de investigación deben
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determinar conjuntamente un sistema de monitorización que sea apropiado para ambas
partes.
2. Técnicas de Detección de Microorganismos Causantes de
Biodeterioro Los métodos normalizados de detección e identificación de microorganismos se
utilizan también en el Biodeterioro. Los libros de texto y los manuales que cubren esta
área son útiles, especialmente si tratan de organismos medioambientales y no solo de
cepas puramente clínicas. A menudo no interesa tanto la identidad o el nombre del
organismo como su actividad deterioradora específica, y algunos de los ensayos más
recientes se basan simplemente en la identificación de enzimas o sus productos
específicos. Un ejemplo es la prueba de la hidrogenasa para las bacterias
sulfatorreductoras que puede ser especialmente relevante, ya que la enzima hidrogenasa
es importante en la biocorrosión.
2.1. Muestreo
Esta es la etapa más importante en cualquier análisis microbiológico. Si no se
dispone de muestras representativas y apropiadas ni siquiera la técnica de detección más
sensible funcionará. Basta con imaginar un silo lleno de grano almacenado que debe ser
analizado para la detección de micotoxinas para darse cuenta de la importancia
fundamental de esta etapa. Puede que sólo un puñado de grano esté contaminado y que
esté en la primera muestra o que no se detecte. Si no hay métodos normalizados
establecidos, se debe solicitar el consejo de un experto.
Como hemos visto a lo largo del curso, los agentes microbianos causantes de
Biodeterioro viven en estrecho contacto con los materiales que deterioran, generalmente
formando biopelículas sobre la superficie y, a menudo, penetrando en el material. Por
ello, resulta imprescindible que cualquier investigación sobre Biodeterioro conlleve el
muestreo de biopelículas. No existe ningún método normalizado para este
procedimiento. En la Tabla 1 se muestran algunas de las técnicas empleadas, con sus
ventajas y desventajas.
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Tabla 1. Métodos utilizados para el muestreo de biopelículas Método Ejemplos Comentarios
Hisopo Superficies para la preparación de alimentos
Simple, pero difícil de estandarizar; solo se recoge una fracción del total de los organismos. Algunos hisopos son inhibitorios.
Raspado Tuberías, minerales Más eficaz que el uso de hisopos, pero también se pueden recoger materiales ajenos (que pueden ser inhibitorios).
Lavado (agitación en líquido)
Telas, muestras pequeñas, muestras insolubles
En el agua de lavado se puede incluir un surfactante que no sea antimicrobiano.
Placas de contacto Superficies de edificios, papel
Permite mantener la distribución espacial de la biopelícula; solo es útil para biopelículas delgadas.
Cinta adhesiva Vidrio, materiales de construcción
Como las placas de contacto, pero más eficaz en la recogida de células de la superficie; el adhesivo no debe ser inhibitorio si las células se van a cultivar.
Recogida del sustrato (material) con la biopelícula intacta
Capas de pintura, secciones de tubería, grano almacenado
La mejor de todas las opciones para un microbiólogo, pero puede dañar el material. La planificación durante la etapa de diseño de un sistema permite la incorporación de probetas que se puedan retirar fácilmente.
La monitorización de un material o de un ambiente para evaluar el riesgo de
Biodeterioro conlleva, generalmente, el análisis de muestras tomadas a lo largo de un
periodo de tiempo. En este caso, es importante usar una técnica de muestreo bien
normalizada para que los resultados puedan ser fácilmente comparables y se pueda
detectar rápidamente un incremento en el número de microorganismos causantes de
deterioro. Los organismos que causan deterioro son habitantes habituales del medio
ambiente y es lógico encontrar un pequeño número en situaciones “seguras”, por lo que
solo deben tomarse medidas cuando este número comienza a aumentar. De forma
similar, cuando el objetivo del muestreo es evaluar la eficacia de los biocidas puede
usarse cualquier método siempre que esté estandarizado. Por ejemplo, la toma de
muestras con un hisopo es casi imposible de normalizar; la humedad del hisopo y la
presión aplicada durante el muestreo son difíciles de mantener constantes.
Más recientemente se han desarrollado métodos para medir el número o la
actividad de los microorganismos relevantes directamente en una biopelícula. Estos
análisis en tiempo real e in situ pueden usar técnicas sofisticadas o carecer de
sensibilidad, pero cuando se optimizan, ofrecen una herramienta excelente para el
investigador en Biodeterioro. Un ejemplo sencillo es el uso de una reacción de óxido-
reducción para medir la respiración microbiana. El cambio de color que se produce en el
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sustrato se ha utilizado para estimar la actividad microbiana general en biopelículas
sobre superficies de piedra. Las sondas fluorescentes, como el naranja de acridina y el
4´,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), se pueden utilizar para teñir células microbianas de
una biopelícula delgada y así contarlas directamente usando un microscopio de
epifluorescencia. Las células vivas se pueden contar mediante el empleo de sondas que
emiten fluorescencia solo cuando son activadas por enzimas microbianas; la
2´7´diclorodihidrofluoresceína (DCFH), por ejemplo, se suministra en forma oxidada y
sólo produce fluorescencia verde cuando es reducida por células vivas. Más sofisticados
son los métodos modernos de microscopía; el microscopio de fuerza atómica tiene una
resolución capaz de distinguir átomos sobre una superficie, el microscopio electrónico
de barrido ambiental, que evita los artefactos inducidos por la preparación de las
muestras en el SEM tradicional, y el microscopio de barrido láser confocal, que permite
tomar secciones ópticas a través de las capas superficiales de un material y que fue
indispensable para construir el modelo actual de biopelícula en 3-D, con sus montañas,
poros y canales. Todos ellos se utilizan actualmente en investigación, más como
herramienta analítica que de rutina. Lo mismo sucede con los microsensores, que se
pueden usar para medir el pH, la concentración de oxígeno y así sucesivamente, en
secciones micrométricas de una biopelícula. En la sección de investigación de este
capítulo se darán otros ejemplos.
A pesar de la importancia de las biopelículas, muchos ensayos de Biodeterioro
todavía se basan en la detección de los microorganismos planctónicos. Este es el
método tradicional para identificar un ambiente agresivo y evaluar la eficacia de los
biocidas.
2.2. Detección y Enumeración
Los métodos microbiológicos normalizados de microscopía y de cultivo se
utilizan mucho en los estudios de Biodeterioro. Cualquier manual práctico de
microbiología contiene los principios y las técnicas básicas que se usan.
En el mercado hay disponibles una serie de kits útiles para la detección rápida y
aproximada de los microorganismos causantes de deterioro de mayor importancia
económica. Los contaminantes de combustible y las SRB son buenos ejemplos. Algunos
de ellos son simples “placas de contacto”, láminas de plástico cubiertas con el medio de
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cultivo adecuado que se pueden sumergir en una muestra líquida o presionar sobre una
superficie sólida antes de ser incubados para permitir el desarrollo de colonias a partir
de las células capturadas durante la fase de muestreo. Estos métodos no requieren
experiencia ni instalaciones de laboratorio, pero por lo general tienen menor
sensibilidad. Pueden ser selectivos para un grupo particular de microorganismos
mediante el uso de medios específicos apropiados.
Los métodos basados en la detección de biomoléculas, como el adenosín
trifosfato (ATP), los fosfolípidos y el ergosterol, se pueden utilizar para la detección
rápida y cuantitativa de contaminación microbiana general o específica. La detección de
ATP mediante la medida de su bioluminiscencia se ha utilizado desde hace tiempo en la
industria alimentaria para determinar la contaminación microbiana de las superficies
donde se preparan los alimentos. El principio de la técnica se describe en la Figura 1.
Cuanto mayor es el número de células vivas (o que estaban vivas hasta hace poco
tiempo) mayor es la cantidad de ATP y mayor la luz emitida y detectada en el
luminómetro.
Figura 1. Principio de la técnica de bioluminiscencia para la determinación de ATP
La medida de ergosterol es una forma rápida y útil de medir biomasa fúngica,
como se comenta en esta Unidad más adelante en la sección de ensayos de simulación
medioambiental. El ergosterol es un componente estructural de las membranas de
hongos y no aparece, o lo hace en cantidades muy pequeñas, en otros organismos.
Aunque la técnica tiene sus inconvenientes [el uso de cromatografía líquida de alta
resolución (HPLC) y la dificultad para relacionar la concentración de ergosterol
directamente con la biomasa fúngica] es, no obstante, un indicador útil y, desde luego,
no menos seguro que las técnicas de cultivo en placa. La determinación de fosfolípidos,
aunque es un método rápido para la cuantificación de biomasa, no se utiliza
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habitualmente de forma rutinaria y se comenta más a fondo en la sección de
investigación de esta Unidad.
Se ha examinado la utilidad de los kits disponibles en el mercado para la
detección de contaminación en gasóleo marino y se ha encontrado que la mayoría de los
resultados obtenidos se correlacionaban bien con los recuentos en placa estándar. Se
detectaron <50-103 bacterias/mL de combustible en los tanques de combustible de los
barcos y 102-106 bacterias/mL en el agua de mar usada como lastre, con recuentos
fúngicos de 0-10 y 20-102 respectivamente. Un método de detección “rápido” para
analizar el queroseno en Brasil es el Boron Microbe Monitor Test, en el que las
muestras de combustible se incuban sobre una capa acuosa de sales minerales con o sin
biocida. Un resultado positivo es aquel en el que se observa un cambio en la interfase
(crecimiento fúngico) en el matraz que no contiene biocida. Aunque es un método
sencillo de realizar y de interpretar, los resultados no se obtienen hasta pasadas una o
dos semanas, lo que constituye demasiado tiempo para que un avión permanezca sin
volar. Se ha descrito un método inmunofluorescente rápido diseñado para detectar
Hormoconis resinae de forma específica (véase la Figura 2), pero aún no se ha
adoptado de forma rutinaria, probablemente debido a la necesidad de un equipo un tanto
caro (un microscopio de epifluorescencia) y personal formado. Esta técnica altamente
sensible da resultados en una hora, una mejora bastante considerable respecto de las
metodologías estándar.
Figura 2. (a) Principio de la técnica de inmunofluorescencia, (b) Hormoconis resinae en una biopelícula sobre un metal, marcado mediante inmunofluorescencia. Fotografía: Dra. Christine Gaylarde.
a) b
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Un método inmunológico alternativo, el ensayo de inmunoadsorción enzimática
(ELISA), que es muy utilizado en clínica para la detección microbiana rápida y su
recuento, también se ha adaptado para su aplicación con Hormoconis resinae. El
principio de la técnica es similar al método de inmunofluorescencia, pero se usa una
enzima como molécula marcadora en vez de un compuesto fluorescente. No se requiere
microscopio de epifluorescencia; se observa una reacción positiva, como un cambio de
color en el sustrato de la enzima, y el proceso completo se automatiza fácilmente dando
resultados cuantitativos rápidos. Algunas técnicas inmunológicas se han desarrollado en
forma de kits para la detección de microorganismos causantes de deterioro. Un ejemplo
es el RapidCheck para la detección de SRB; es un método ELISA que mide la enzima
adenosina fosfosulfato reductasa, específica de SRB.
Aunque los métodos inmunológicos son muy sensibles y específicos, dependen
de medios biológicos para la producción de los reactivos más importantes - los
anticuerpos. El uso de la tecnología de los anticuerpos monoclonales ha facilitado la
producción de reactivos de inmunoglobulina estándar, pero todavía se producen
variaciones, y esto limita, hasta cierto punto, el uso de estos métodos. Parece probable
que en el futuro sean sustituidos por técnicas de biología molecular, que impliquen el
análisis de los ácidos nucleicos. Esta es un área de intensa investigación en la actualidad
y en la sección de investigación de esta Unidad se presenta una introducción al respecto.
3. Técnicas de Ensayo de Biodeterioro La evaluación de la susceptibilidad biológica de los materiales se puede
clasificar en tres categorías principales: la selección preliminar, el ensayo de simulación
medioambiental controlada y el ensayo de campo o exposición a largo plazo. Cada
categoría tiene sus ventajas e inconvenientes y, a menudo, dos o más categorías se
combinan o se llevan a cabo de forma secuencial. Se debería mencionar también una
cuarta categoría: el uso de ensayos que cumplen con la normativa vigente. Estos
ensayos se pueden considerar incluidos dentro de la primera o de la segunda categoría,
pero tienen un papel especial garantizando los niveles de calidad en materiales y
productos. Se consideran en una sección aparte.
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3.1. La Selección Preliminar
En las primeras etapas de desarrollo de un producto puede haber un número
prometedor de formulaciones que merezcan una investigación más a fondo. Por
ejemplo, se puede haber sintetizado una nueva clase de productos químicos con una
actividad biocida prevista o se puede necesitar estudiar la eficacia de una variedad de
conservantes en un producto nuevo antes de que el más adecuado sea propuesto para
futuras evaluaciones. Para eliminar candidatos inútiles que, en la práctica, no
demuestren actividad o no funcionen adecuadamente, se puede emplear una técnica de
cribado en el laboratorio. Estos cribados son muy atractivos ya que se pueden efectuar
rápidamente mediante técnicas de microbiología tradicional y un gran número de
réplicas. Pero son limitados, porque no simulan el uso final del producto y, a menudo,
no tienen en consideración las consecuencias ecológicas. Los cribados también están
sujetos a interpretaciones erróneas y exageraciones.
Estos cribados suelen realizarse en matraces o en placas Petri que contienen
medios de cultivo diseñados para crear las condiciones óptimas para el crecimiento
microbiano. El conservante se incorpora al medio de cultivo después de su esterilización
o, en el caso de un medio sólido, se puede poner en un pocillo recortado en el agar.
Después los organismos de ensayo se inoculan en el medio como caldos de cultivo o
suspensiones que se dispersan sobre la superficie del medio sólido. En los medios
líquidos, el punto final puede ser una gran reducción logarítmica (en 4 unidades) y, en
los medios sólidos, un halo de inhibición alrededor del pocillo. Alternativamente, se
coloca una alícuota del producto que contiene el biocida sobre la superficie del agar
inoculado (Figura 3). Después se mide el halo de inhibición de crecimiento alrededor
del pocillo o del producto. Los resultados se interpretan asumiendo que cuanto mayor es
este halo, mayor es la potencia del biocida. Sin embargo, se podría argumentar que
cuando mayor es el halo de inhibición, mayor es la tasa de lixiviación, una cualidad
indeseable en un biocida que debe tener una vida larga. Los componentes del medio
también pueden afectar a la movilidad del biocida, así como el diluyente.
Los cribados se suelen realizar a las temperaturas en las que la tasa de
crecimiento es máxima (25-30 ºC). Las cepas bacterianas y fúngicas de laboratorio se
usan como cultivos puros. Estas cepas se eligen por su naturaleza ubicua (por ejemplo
Pseudomonas), la facilidad con que se cultivan en el laboratorio (por ejemplo
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Escherichia coli), o su llamativa morfología en el cultivo (las masas de esporas marrón
oscuro de Aspergillus niger).
Figura 3. Halos producidos en ensayos de inhibición para (a) bacterias y (b) hongos. Fotografías: Dr. Kenneth J. Seal.
Algunas veces, se elige una colección de microorganismos por sus diferencias
taxonómicas, o se usa una cepa “favorita” que exhibe una propiedad particular. En el
último caso, se puede utilizar un hongo celulolítico que crezca bien en medios de
laboratorio para evaluar la eficacia de un biocida que se usará para proteger productos
de celulosa o que contengan derivados de la celulosa. Dicho hongo puede que no sea
reconocido como colonizador de estos productos y, por tanto, cualquier extrapolación
debe hacerse con cuidado. También existe peligro en la validez de los resultados para un
microorganismo en un cribado. Por ejemplo, se sabe que Aureobasidium pullulans y
Aspergillus niger son tolerantes al cobre. El uso exclusivo de cualquiera de estos dos
hongos en la evaluación de un biocida que implique una formulación que contenga
cobre puede provocar el rechazo de un biocida adecuado para aplicar en un lugar en el
que no sería probable encontrar a estos dos hongos como agentes causantes de
Biodeterioro. La otra posibilidad es que se recomendasen cantidades innecesariamente
elevadas de biocida para aplicaciones prácticas.
La ecología de la comunidad microbiana asociada con el Biodeterioro de un
material no se puede contemplar exclusivamente en una placa Petri. Se debe tener en
cuenta que se pueden producir interacciones que aumenten la tasa de descomposición en
el material o afecten negativamente a la potencia de un biocida a una concentración que
se sabe es eficaz sobre un cultivo puro. A menudo, encontramos ejemplos de esta última
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posibilidad cuando se pasa del cribado inicial al uso de cultivos mixtos o de un inóculo
aislado de un sistema contaminado (a menudo denominado “organismos de la casa”). La
influencia del biocida sobre una biopelícula adherida a la luz de una tubería no se puede
establecer con métodos normales. Es necesario idear una técnica que simule el
ambiente, o al menos, usar probetas metálicas en el medio que se puedan extraer a
intervalos concretos para su estudio.
La técnica que, con diferencia, se utiliza con mayor frecuencia cuando se tiene
que evaluar la eficacia de conservantes en un material o un producto en particular es el
ensayo de resistencia. El principio de la técnica consiste en añadir un inóculo en
cantidad conocida de un solo organismo o de una mezcla a muestras de producto, por
ejemplo, una pintura líquida que contiene varias concentraciones del conservante bajo
análisis. Las muestras inoculadas se incuban, junto con un control blanco (sin
conservante) y un sistema de referencia con un punto final conocido (control positivo), a
una temperatura dada (normalmente 25-30 ºC) y se recogen alícuotas cada cierto tiempo
(habitualmente hasta siete días). Estas se siembran en placas de agar, directamente
desde el recipiente que contiene la muestra o después de hacer una serie de diluciones
en solución de Ringer y se estiman los supervivientes mediante un esquema de
cuantificación subjetivo o contando en una dilución adecuada (normalmente entre 30 y
300 colonias). Después de siete días (o más si el conservante muestra una tasa de
mortalidad más lenta), las muestras se vuelven a poner en contacto con el mismo
inóculo y se repite el proceso de detección de supervivientes. Este ensayo de resistencia
se puede repetir muchas veces, pero lo normal son tres. Un conservante capaz de matar
tres réplicas (o desafíos), se considera adecuado para continuar con los ensayos,
normalmente en la fábrica (es decir, ensayos en campo). Existe polémica, especialmente
entre los microbiólogos de cosméticos, acerca de la utilidad de un ensayo de resistencia
reiterado comparado con un ensayo único, si el propósito del ensayo es evaluar la
eficacia. Después de todo, tres ensayos de una concentración bacteriana de 108 se
pueden considerar igual que uno de 3 por 108 bacterias, si se está evaluando la
capacidad del conservante. Sin embargo, el ensayo de resistencia se acepta como buen
vaticinador de éxito en el campo.
Ahora que se han enumerado las limitaciones de las técnicas de selección,
debería observarse que proporcionan una idea rápida del efecto aproximado que ocurre
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en el sistema. Los ensayos de cribado en Biodeterioro normalmente utilizan el criterio
de crecimiento/no crecimiento. Algunos sistemas de clasificación intentan cuantificar el
crecimiento de forma subjetiva como excelente, bueno, moderado o pobre. A menudo se
utiliza como indicativo de la eficacia del conservante la cantidad de cobertura de la
muestra o de la estría dejada por el microorganismo en una escala del 0 al 100%, de 0 a
5, o en un incremento del número de signos positivos (- a +++). Este enfoque ha sido
criticado para los inóculos fúngicos, ya que no se considera el grado de esporulación,
que es un indicador importante de la capacidad reproductiva de los hongos sobre los
materiales.
Varios métodos de ensayo se basan en el uso de un medio de agar con sales
minerales, en el que se introduce el material como única fuente de carbono. Esto puede
ser un protocolo eficaz para algunos materiales, por ejemplo, textiles y cuero, pero
algunos plásticos como los poliuretanos, requieren la presencia de nutrientes
suplementarios como los azúcares para iniciar su crecimiento. En ausencia de
suplementos, no se produce el ataque hasta pasados veintiocho días. El pH del medio
puede afectar la actividad del biocida que se está evaluando; por ejemplo, se ha
descubierto que una reducción del pH de 4,5 a 3,3 es suficiente como para reducir la
toxicidad del ión cobre sobre las cepas sensibles a cobre de Aureobasidium pullulans.
Por ello es importante que los resultados se interpreten con cuidado y moderación.
3.2. El Ensayo de Simulación Medioambiental
Estos ensayos se diseñan teniendo en cuenta el uso final del material
manteniendo un control razonable de las condiciones medioambientales. Para lograr
estos propósitos, el biocida candidato se puede incorporar en el material que se supone
que va a proteger, o se puede exponer un material al tipo de ambiente con el que
probablemente se encontrará en servicio. El material, con o sin biocida, puede ser
sometido posteriormente a desgaste o envejecimiento artificial simulando los efectos de
la lluvia, ciclos de temperatura y luz solar. Los equipos para producir climas artificiales,
por ejemplo, las lámparas de arco de xenón o de UV, están especialmente diseñados
para llevar a cabo ciclos de tiempo (por ejemplo, 100, 200 y 400 horas). También es
posible simular una atmósfera industrial mediante la introducción de dióxido de azufre
y ozono. La muestra se puede exponer a ciclos de tiempo de temperatura y humedad
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relativa (RH) para simular un ambiente tropical. Tales condiciones no suelen aparecer
en las publicaciones, pero merecen una seria consideración. Los productos a base de
cemento que pueden requerir una evaluación directa, o el ensayo de un recubrimiento
superficial se pueden carbonatar antes del ensayo para reducir las condiciones alcalinas
(pH 10-11) del producto fresco, lo que daría lugar a resultados erróneos. Los materiales
casi siempre presentan alguna forma de contaminación, que puede actuar como
nutriente para cualquier colonizador potencial. Para considerar este factor, el material se
puede rociar o sumergir en una solución nutritiva mineral apropiada para estimular el
crecimiento. Cuando se hace esto, la valoración visual por sí sola no es suficiente a
menos que el material contenga un biocida candidato y se utilice la inhibición del
crecimiento como criterio de evaluación. Se debe utilizar alguna forma de ensayo físico
para examinar cambios desfavorables en las propiedades del material. Este aspecto se
discutirá más adelante.
Se utilizan dos ambientes como representantes de la amplia variedad del uso
final de los materiales, que son el suelo y una atmósfera húmeda. Ambas condiciones se
pueden conseguir en el laboratorio con un mínimo equipamiento. El suelo se puede
obtener del jardín, o en forma de un compost premezclado como el John Innes nº 1
(nótese que cuando la etiqueta dice “esterilizado” en estos tipos de suelo, se refiere a
semillas de malas hierbas e insectos y no a los microorganismos). El suelo debe tener
una flora microbiana activa, un pH entre 5,5 y 7, ser de composición arcillosa y tener
una humedad de 25-35%, o del 60% de su capacidad máxima de retención de agua. Para
eliminar las piedras, se recomienda tamizar el suelo con un tamiz de jardín. El suelo
suele colocarse en cubetas de 15-24 cm de profundidad y mantenerse a temperatura
constante. Las cubetas de suelo se denominan a menudo lechos para ensayos en tierra
(Figura 4).
Figura 4. Materiales sometidos a un ensayo de enterramiento en suelo. Obsérvese la pieza de tejido de algodón degradado que se ha utilizado para evaluar la actividad del suelo. Fotografía: Dr. Kenneth J. Seal.
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Estos pueden ser muy grandes, ocupando un laboratorio construido
especialmente para dicho propósito, con un ambiente controlado. Los lechos se pueden
mantener durante varios años si se utilizan regularmente. Puede ser necesaria la adición
ocasional de materia orgánica o fertilizante si la actividad comienza a decrecer. Para un
uso más a corto plazo, se pueden utilizar vasos de precipitados grandes, cubos, o
recipientes herméticos de plástico, pero es necesario tener en cuenta sus limitaciones,
pues solo representan una fuente limitada de microorganismos y no un medio ambiente
complejo como el del suelo natural. Como sugiere el nombre de lechos, los materiales
para los ensayos se entierran en el suelo por periodos de tiempo predefinidos. Se suelen
prever tres meses, pero es importante permitir la extracción de muestras adicionales que
se puedan recuperar a tiempos más cortos y más largos de exposición. El suelo es
considerado como un ambiente severo o agresivo y su uso se justifica para materiales y
sistemas de conservación que estarán en contacto con el suelo durante su vida en
servicio. Microbiológicamente hablando, es un sistema mal definido, pero
sorprendentemente, si se lleva a cabo de forma adecuada, las técnicas de enterramiento
en suelo proporcionan resultados comparables y se emplean en varias normas
nacionales en Europa y en los Estados Unidos.
Muchos materiales se colocan distantes al contacto directo con el suelo, pero
sujetos a la colonización por la microflora del suelo y del aire. En estas situaciones, es la
humedad de la atmósfera la que juega un papel importante en el desarrollo y el
crecimiento “sostenido” de los potenciales agentes causantes de Biodeterioro. Hay
muchas situaciones industriales y domésticas en las que se pueden dar condiciones de
alta humedad localizada. En estas situaciones, las algas y los hongos son los
colonizadores predominantes y el mayor efecto que producen es el desconchado. Esto se
puede simular en el laboratorio usando cámaras que, o bien contienen agua, para
proporcionar una atmósfera saturada del 100% RH, o bien un rango de soluciones
salinas saturadas para humedades controladas por debajo de la saturación. Los
materiales sometidos a ensayo se suspenden en la atmósfera o se colocan en un lecho de
vermiculita mojada (Figura 5), donde se rocían con un inóculo mixto de hongos y/o
algas y se incuban a una temperatura constante. Después de un tiempo predeterminado
(a menudo veintiocho días), los materiales se examinan para evaluar la presencia de
crecimiento activo sobre su superficie. La extensión del crecimiento se mide en
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términos de porcentaje de cobertura o densidad, como se ha descrito anteriormente. Un
estudio reciente sugiere el análisis de ergosterol mediante HPLC para dar una medida
cuantitativa del crecimiento fúngico sobre capas de pintura. Este método,
extremadamente rápido y sencillo, muestra la eficacia relativa de los fungicidas
incorporados a la capa de pintura.
Figura 5. Lecho de vermiculita para evaluar la eficacia de alguicidas en capas de pintura. Fotografía: Dr. Kenneth J. Seal.
Se pueden utilizar modificaciones de este sistema para resolver situaciones
particulares. Uno de estos sistemas se utiliza para evaluar pinturas fungicidas una vez
aplicadas. Una superficie pintada puede estar expuesta a la condensación como
resultado de un gradiente de temperatura a través de una pared y esto puede
desencadenar el crecimiento de moho (típico en cuartos de baño y cocinas mal
ventiladas). Para simular esta situación, los paneles pintados se suspenden en una
cámara con agua caliente en el suelo a 5 ºC por encima de la temperatura ambiente. Esto
induce la condensación del agua en la capa. Se aplica un inóculo mixto sobre la capa y
se incuba durante al menos tres meses. Los lechos de vermiculita húmeda se utilizan
actualmente de forma rutinaria como técnica para simular una superficie que se
encuentra continuamente expuesta a condiciones de humedad. Esta técnica es
particularmente útil para ensayar alguicidas. Los paneles planos (tableros de base
mineral o de madera blanda), a menudo previamente expuestos a la humedad como se
ha descrito anteriormente, con la capa de pintura en estudio aplicada en la superficie
superior, se exponen horizontalmente sobre la vermiculita húmeda en un recipiente
hermético de plástico transparente. Se aplica el inóculo de una mezcla de algas (con
brocha o mediante rociado) y se evalúa de acuerdo a la cantidad de crecimiento presente
durante un periodo de hasta tres meses. Se utilizan ciclos determinados de luz y
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oscuridad para simular el ciclo día-noche y se pueden añadir nutrientes minerales de
forma periódica rociándolos sobre los paneles inoculados.
Cuando se ha definido claramente un tipo particular de Biodeterioro y se han
identificado los organismos responsables, por ejemplo, descomposición de la madera,
una simulación aceptable es usar esos organismos junto con especies de madera
susceptibles con el fin de evaluar la eficacia de los conservantes de la madera, midiendo
la pérdida de peso de bloques de madera impregnados (comparados con los controles)
después de tres meses de exposición a cultivos puros de hongos que degradan la
madera. El acondicionamiento de los bloques mediante el uso de un paso de lixiviado
elimina aquellos biocidas con probabilidad de tener periodos cortos de residencia y, por
lo tanto, un rendimiento limitado como conservantes. El valor de los ensayos de
simulación reside principalmente en una predicción más realista de cómo se comportará
el material en servicio mientras el ambiente se mantiene bajo estricto control, lo que
permite que se puedan comparar los resultados de los ensayos llevados a cabo en
distintos laboratorios y en diferentes momentos.
3.3. El Ensayo de Campo
El ensayo de campo es, por lo general, un ensayo a largo plazo (mayor de un
año), en el que el material es expuesto a una o más situaciones de servicio o una
variedad de climas diferentes en los que es probable que se vaya a encontrar cuando esté
en servicio. Los ensayos de campo pueden durar hasta diez años y abarcar ambientes
que vayan desde condiciones de humedad tropical hasta situaciones de
congelación/descongelación. En el diseño de un ensayo de campo es de suma
importancia decidir los lugares de exposición, la mejor forma de presentar el material al
ambiente, el número de muestras, la frecuencia del análisis de las muestras, las
propiedades que se van a evaluar, qué organismos va a ser necesarios monitorizar, si
pueden resultar útiles datos fotográficos, qué datos históricos son necesarios (registros
meteorológicos del lugar, temperaturas en la superficie), quién va a administrar,
coordinar y asegurar la continuidad a lo largo de todo el ensayo y si habrá un registro
principal o manual de procedimientos que describa el ensayo de campo completo para
garantizar su trazabilidad, y dónde debe estar ubicado para su custodia. Es importante
mantener la seguridad en los lugares seleccionados para evitar la pérdida de muestras.
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Se deben considerar planes de contingencia en caso de que un lugar sea cerrado o
transferido. También se deben establecer los acuerdos necesarios para el transporte de
las muestras desde el lugar de muestreo hasta el punto donde serán examinadas, si no lo
puede hacer el técnico. La organización y puesta en marcha de un ensayo de campo
pueden ser muy laboriosas y costosas, especialmente en el caso de materiales que se van
a usar en una variedad de situaciones para las que son probables interacciones entre
factores físicos y biológicos. No es posible generalizar en el diseño experimental de un
ensayo de campo. Sin embargo, sirva de ejemplo una breve descripción del tipo de
ensayo que se utiliza a menudo para evaluar los efectos del medio ambiente tanto sobre
los materiales de construcción usados en el exterior como sobre recubrimientos de
superficie.
La industria de recubrimientos de superficies y aquellas industrias que producen
tableros compuestos de base mineral que se usan para revestimientos exteriores y
cubiertas de tejado utilizan bastidores en los que se pueden montar los paneles de
ensayos. A la hora de montar los paneles es importante tener en cuenta su ángulo con el
plano horizontal, la dirección en la que se orienta y la distancia al suelo. Los paneles se
inclinan normalmente 45º o 90º hacia el plano horizontal y mirando al norte o al sur
(Figura 6).
Figura 6. Paneles pintados expuestos a 45º orientados hacia el sur siendo examinados por Dennis Allsopp. Fotografía: Dr. Kenneth J. Seal.
Un panel a 45º será el que se encuentre expuesto a condiciones más severas, ya
que la contaminación que cae sobre él permanecerá en su superficie por un periodo de
tiempo mayor que aquel que esté en posición vertical y, si además también está
orientado al sur en el Hemisferio Norte, captará más luz solar. Se han diseñado métodos
elaborados para rotar los paneles continuamente y mantenerlos expuestos al sol. Sin
embargo, las medidas de UV muestran que las concentraciones de luz reflejada e
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incidente sobre paneles estáticos a 45º hacen que los métodos rotacionales sean un lujo
innecesario. Un panel orientado al norte, en el Hemisferio Norte, no recibe luz solar
directamente y es probable que se mantenga más frío y húmedo que una muestra
orientada al sur. Esto suele provocar el crecimiento de algas y hongos, que pueden
afectar algunas de las propiedades de las muestras con el tiempo. Estas orientaciones se
invierten en el Hemisferio Sur. La altura a la que se colocan los paneles desde el nivel
del suelo puede influir en la contaminación. Para simular una situación en la que no hay
contacto con el suelo, los paneles se deben colocar a una distancia del suelo de al menos
1 m para evitar salpicaduras. Por supuesto, los paneles se pueden colocar a distancias
menores para permitir la contaminación desde el suelo. Los paneles también se pueden
proteger con un techo que cubra todo el bastidor, si se pretende simular una aplicación
de menor exposición.
El diseño del bastidor es muy importante ya que debe soportar de forma segura
todos los paneles que se vayan a exponer, no se debe pudrir o corroer significativamente
mientras dure el ensayo, su diseño no debe contribuir a los cambios observados en los
paneles a menos que se haya incorporado deliberadamente y se debe diseñar para que su
mantenimiento sea fácil. Debe estar hecho de madera tratada o de metal resistente a la
corrosión y tener soportes que permitan fijaciones a 45º y verticales en dos direcciones
opuestas. Los paneles se ajustan al bastidor mediante sujeciones que no afecten al
material, por ejemplo, aumentando la corrosión de un panel de metal que se esté
evaluando; en este caso, las sujeciones se deben pintar para prevenir la corrosión. La
retirada periódica de los paneles es seguida por la observación de las superficies e
identificación de los microorganismos presentes; se requieren ensayos mecánicos o
químicos adecuados para determinar cualquier cambio en el material expuesto.
El análisis estadístico es importante en la interpretación de estos ensayos. Para
asegurar su viabilidad hay que preparar suficientes réplicas y el análisis estadístico no
paramétrico es probablemente el más adecuado. En ausencia de un método normalizado
se debe pedir consejo a un experto. Un artículo reciente sobre el Biodeterioro de capas
de pintura exterior con y sin biocidas sugiere el uso de análisis de regresión logística
con datos acumulados para evitar la necesidad de un gran número de réplicas durante un
periodo de tiempo. El conocimiento de la estadística es extremadamente importante
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cuando se están planeando estudios comparativos de este tipo para asegurar que los
resultados sean significativos.
3.4. Ensayos Normalizados en Biodeterioro
Existe un pequeño número de normas nacionales e internacionales que contienen
procedimientos para evaluar los efectos de los organismos sobre los materiales o los
sistemas de conservación usados en estos materiales. En las Tablas 2 y 3 se puede
encontrar una lista de estas normas actualmente en uso, de las que se deduce que se
agrupan en la categoría de cribado o simulación medioambiental.
Tabla 2. Normas británicas y europeas de evaluación del Biodeterioro
Número: Año Título
BS1982:1990 Métodos de ensayo para evaluar la resistencia fúngica de paneles fabricados de materiales de origen orgánico o que los contienen
BS2011:1989 Evaluación medioambiental de componentes y equipos electrónicos. Parte 2.1, Ensayo J. Crecimiento de hongos
BS2087:1992 Tratamientos de conservación de tejidos
BS3046:1981 Especificación para adhesivos de recubrimientos de pared. Apéndice G. Ensayos de susceptibilidad al crecimiento de hongos
BS3900:1989 Métodos de ensayo para pinturas. Ensayo G6. Evaluación de la resistencia al crecimiento de hongos
BS4249:1989 Especificación para papel y corcho. Sección 5.7. Resistencia al crecimiento de hongos
BS5763:1996 Métodos para el análisis microbiológico de alimentos y productos de alimentación animal
BS5980:1980 Especificación para adhesivos de uso en azulejos cerámicos y mosaicos. Sección 7. Resistencia al crecimiento de hongos
BS6068:1988 Calidad del agua. Guía para el recuento de microorganismos mediante cultivo BS6085:1992 Métodos para la determinación de la resistencia de tejidos al deterioro microbiológico
BS6920:2000 Idoneidad de productos no metálicos para su uso en contacto con agua prevista para el consumo humano con respecto a su efecto sobre la calidad del agua. Parte 2.4. Crecimiento de microorganismos acuáticos
BS7066:1990 Conservantes de la madera. Eficacia frente al manchado azul
BS7874:1998 Método para evaluar el deterioro microbiológico de sellos elastoméricos para uniones en fontanería y canalizaciones
BSEN 113:1997 Método de ensayo para determinar la eficacia protectora contra basidiomicetos que degradan la madera
BSEN 152:1988 Método de laboratorio para determinar la eficacia protectora en servicio de un tratamiento conservador contra el manchado azul. Parte 1. Procedimiento de cepillado. Parte 2. Métodos distintos al cepillado
BSEN1040:1997 Desinfectantes químicos. Actividad bactericida básica. (Véase también BSEN 1275, 1276 y 1650)
BSENISO846:1997 Plásticos: Evaluación de la acción de microorganismos DDEN839:2002 Conservantes de la madera. Eficacia contra basidiomicetos que destruyen la madera
BSISO14851:1999 Determinación de la biodegradabilidad de materiales plásticos en un medio acuoso. (Véase también BSISO 14852 y 14855)
BS, Norma Británica; EN, Norma Europea; DD, Proyecto de Norma; ISO, Organización Internacional para la Normalización.
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Tabla 3. Normas estadounidenses de evaluación del Biodeterioro
Número Título
ASTM D5274-00 Método de ensayo normalizado para evaluar la resistencia al ataque por microorganismos de pinturas envasadas
ASTM D3273-00 Método de ensayo normalizado para evaluar la resistencia al crecimiento de hongos sobre la superficie de cubiertas interiores en una cámara ambiental
ASTM D3274-95 Método de ensayo normalizado para evaluar el grado de deterioro de capas de pintura por crecimiento microbiano (fúngico o de algas) o por acumulación de tierra y suciedad
ASTM D4300-01 Método de ensayo normalizado para evaluar la capacidad de las películas adhesivas para soportar o resistir el crecimiento de hongos
ASTM G21-96 Método normalizado para determinar la resistencia de materiales poliméricos sintéticos a los hongos
ASTM G29-96 Método normalizado para determinar la resistencia de materiales poliméricos sintéticos a las algas
MIL STD 810E Métodos de ensayo medioambientales. Método 508.2. Hongos ASTM, Sociedad Americana de Ensayos y Materiales; MIL STD, Normas Militares.
Para la evaluación de la resistencia o susceptibilidad biológica de los materiales
se coloca la muestra en agar nutritivo, donde el material a menudo la “única” fuente de
carbono, y se rocía con un cultivo único o mixto de bacterias u hongos. Las cepas
utilizadas se encuentran especificadas mediante un número de catálogo de una colección
de cultivos tipo, aunque la norma suele permitir el empleo de otras cepas si existe un
acuerdo entre las partes implicadas. La susceptibilidad se establece por la cantidad de
crecimiento sobre la muestra después de un periodo de incubación adecuado o, en el
caso de los conservantes, por la ausencia de crecimiento sobre la muestra o un halo de
inhibición alrededor de la misma. La pérdida de peso en bloques de madera o muestras
de plástico acondicionadas y previamente pesadas también se utiliza como indicativo de
la eficacia de un conservante o de la susceptibilidad del material ensayado a la
utilización microbiana. La información proporcionada por este tipo de normas se refiere
únicamente al potencial Biodeterioro de materias primas y no a un ensayo de simulación
en servicio en el que se evalúan productos completos o componentes que comprendan
una serie de materias primas. En el último caso, los componentes son suspendidos en
una cámara donde la humedad es alta o son enterrados en el suelo, como se ha descrito
anteriormente, y se realiza una evaluación de la extensión de crecimiento sobre la
superficie. Al terminar el ensayo microbiológico se suele llevar a cabo un ensayo de
prestaciones.
Por tanto, es importante que en la redacción de las especificaciones de los
ensayos que contemplen los ensayos biológicos se incluya la norma adecuada para
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identificar el grado del Biodeterioro. Por ejemplo, si los componentes de un tablero de
construcción hecho con pasta de celulosa, mica y cemento fueran evaluados, el
componente de celulosa siempre fallaría, pero como compuesto puede que supere un
ensayo de enterramiento en suelo o de alta humedad por el pH alcalino del medio. Se
requiere perfeccionar y actualizar las normas que abordan el Biodeterioro de materiales.
Algunas pueden dar resultados erróneos, mientras que otras emplean una serie de
organismos que son difíciles de justificar como agentes directos del Biodeterioro de los
materiales seleccionados para su evaluación. El requisito de la Directiva de Productos
Biocidas (Directive on Biocidal Products) para demostrar la eficacia de los
conservantes, supondrá la introducción de métodos de ensayo mejor enfocados.
Los procesos de acreditación de laboratorios nacionales establecidos para
asegurar la calidad de los ensayos de los laboratorios se están implementando en
muchos países. De ellos, solo un pequeño número lleva a cabo ensayos de Biodeterioro
en la actualidad; la mayoría de los ensayos se realizan como parte de servicios de apoyo
técnico que proporcionan las compañías de conservantes/biocidas.
4. Técnicas Recientes de Investigación en Biodeterioro Los ensayos normalizados y los métodos de tratamiento descritos en la sección
anterior están sujetos a constantes revisiones y actualizaciones. La investigación en los
aspectos teóricos y prácticos del Biodeterioro es fundamental para este proceso. La
investigación dirigida específicamente al deterioro microbiano de materiales se refiere
fundamentalmente a la aclaración de los mecanismos implicados y la identificación y
fisiología de los organismos involucrados, siendo el control o prevención del daño el
propósito final. Áreas particularmente activas en la actualidad son las biopelículas y el
desarrollo de técnicas moleculares para el estudio de los agentes causantes de deterioro
microbiano.
4.1. Técnicas de Análisis de Ácidos Nucleicos
El desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a principios de los
años ochenta (véase la Figura 7) ha revolucionado la investigación biológica. Los
cebadores (o primers) 1 y 2 en la Figura 7 son oligonucleótidos sintéticos que se unen
específicamente a sitios seleccionados en el DNA permitiendo a la enzima Taq
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comenzar la replicación. Dado que la replicación se realiza siempre en la misma
dirección en la cadena de DNA (de 5´ a 3´) se requiere un cebador diferente para cada
cadena. Estos se conocen como cebadores “Forward” (F) (que significa ir hacia
delante) y “Reverse” (R) (ir marcha atrás).
Figura 7. Principio de la PCR. dNTPs, desoxinucleótidos trifosfato. Paso 1. Desnaturalización de la doble cadena de DNA (ds) mediante el aumento de la temperatura a 90-95 ºC. Paso 2. Hibridación de los cebadores y las cadenas de DNA separadas. La temperatura puede variar entre 40 y 70 ºC. Paso 3. Extensión de las cadenas de DNA en formación por medio de la enzima Taq polimerasa (temperatura habitual 72 ºC). Paso 4. Repetición de los ciclos (alrededor de 35) para producir múltiples copias de DNA de doble cadena.
La capacidad para amplificar específicamente partes del genoma posibilita la
producción de “sondas génicas” para detectar géneros y especies microbianas y sus
actividades. La manipulación de la secuencia de los cebadores y/o de las condiciones
del paso de hibridación en la PCR nos permite cambiar su especificidad, disminuirla
para permitir la detección simultánea de un grupo general de organismos (por ejemplo,
hongos en general) o aumentarla para limitar los tipos de organismos/actividades
detectados. Se pueden identificar los genes de la lipasa para detectar organismos
capaces de degradar grasas, genes de celulasa para células celulolíticas y así
sucesivamente. La detección de mRNA en las células, en lugar de DNA, nos permite
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determinar si los genes están activos. Esto se realiza por medio de la PCR de
transcripción inversa (RT-PCR).
La PCR, junto con los métodos de análisis del DNA amplificado, tales como el
análisis de restricción del gen ribosomal 16S amplificado (ARDRA), el polimorfismo
de conformación de cadena sencilla (SSCP) y la electroforesis en gel con gradiente
desnaturalizante (DGGE), han demostrado la presencia de microorganismos
desconocidos hasta la fecha en materiales deteriorados. Hoy se considera como
axiomático que sólo entre el 1 y el 10% de todos los microorganismos se han cultivado
en medios artificiales. Cuando se utilizan como cebadores secuencias de DNA del gen
de la subunidad pequeña (SSU) del RNA ribosómico (16S rDNA en procariotas y 17S ó
18S rDNA en eucariotas), los microorganismos se pueden detectar e identificar rápida y
específicamente sin necesidad de cultivo. Una vez que se haya identificado una región
específica del DNA (sonda) para un “nuevo” organismo se puede aplicar la hibridación
in situ con sondas fluorescentes (FISH) para visualizar las células en su hábitat natural.
La tecnología está bien desarrollada para las bacterias, pero la investigación sobre otros
microorganismos es aún escasa. En la Tabla 4 se presentan algunos de los cebadores
que se han utilizado para amplificar varios tipos de DNA.
Tabla 4. Ejemplos de cebadores específicos utilizados en la PCR
Cebadores SSU rDNA Especificidad Secuencia de bases
ITS1F Hongos CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA ITS4 (R) Universal de hongos TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS4-A (R) Ascomicetos CGCCGTTACTGGGGCAATCCCTG ITS4-B (R) Basidiomicetos CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG 27F1 Universal de bacterias AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
408R Cianobacterias TTACAA(CT)CCAA(AG)(AG)(AG) (AG)CCTTCCTCCC
1492R Universal de bacterias GGTTACCTTGTTACGACTT 63F Espiroquetas CATGTCGACGTYTTAAGCATGCAAGT NSM156 (F) Nitrosomonas spp. TATTAGCACATCTTTCGAT Ejemplos de pares de cebadores para genes implicados en el Biodeterioro
opl1 Lipasas GAATTTTTTTAGGAGGACACTATGAGTC(F) CCCTGCAGCTTATTTACCC CCATTATAAGTGGTTTGATTTTAGGCC(R)
catA Catecol-1,2-dioxigenasa (degradación de hidrocarburos)
GAAGGACCGCTATATGTTGCAGGTGC(F) TAGTGAATATGCGCAGGGCG(R)
F, cebador forward (hacia adelante); R cebador reverse (hacia atrás).
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La identificación a nivel de género o de especie se puede lograr idealmente
mediante la determinación de la secuencia de bases del DNA amplificado. Después, esta
secuencia se envía a las bases de datos disponibles (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)
para ser comparada con secuencias conocidas que han sido depositadas previamente por
otros investigadores. Uno de los problemas es que estas bases de datos son limitadas,
especialmente en el caso de hongos y cianobacterias, y muchas de las secuencias que se
envían pueden tener problemas de emparejamiento y permanecer sin identificar. Uno de
los esfuerzos más importantes en la investigación actual debe ser la secuenciación del
DNA de más microorganismos, tanto cultivables como no cultivables. La secuenciación
del genoma completo es importante, pero incluso el depósito de secuencias parciales,
determinadas mediante el empleo de sólo un pequeño número de cebadores, permitirá
una mejora en los servicios ofrecidos por los bancos de datos. Se puede encontrar una
lista constantemente actualizada de las secuencias completas de genomas microbianos
en la dirección http://www.tigr.org/tdb.shtml.
4.2. Análisis de Comunidades
El Biodeterioro se refiere sobre todo a las interacciones entre los organismos
vivos y los materiales inertes en ambientes naturales. Debido a que los organismos no se
encuentran normalmente en cultivos puros en la naturaleza, es importante examinar la
comunidad viva al completo y su relación con el deterioro. Esto se ha hecho en el
pasado mediante el uso de técnicas como el análisis de ácidos grasos de fosfolípidos. La
determinación de los ácidos grasos específicos mediante cromatografía de gases y
espectrometría de masas (GC-MS) puede indicar no sólo las cantidades, sino también
los tipos de microorganismos presentes. Las llamadas “huellas de ácidos grasos”,
algunas de las cuales se muestran en la Tabla 5, permiten la detección cuantitativa de
grupos específicos de microorganismos en una muestra ambiental. Sin embargo, se
requieren técnicas de extracción y separación bastante prolijas y especializadas y aún no
se han identificado los marcadores de ácidos grasos de fosfolípidos (PLFAs) para todos
los grupos de organismos causantes de deterioro; por tanto, las nuevas técnicas de
biología molecular hacen que la detección simultánea de microorganismos de una
comunidad sea un propósito mucho más factible.
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Tabla 5. Algunos patrones de fosfolípidos de ácidos grasos (PLFA) utilizados para detectar grupos específicos de microorganismos
Patrón lipídico Grupo microbiano 18:2ω6, 18:3 Eucariotas 18:2ω6,9 Hongos 20:5ω3, 18:3ω3 Algas 10Me18:0 Actinomicetos PLFAs saturados con ramificaciones terminales (por ejemplo, i15:0, i17:0) Bacterias anaerobias Gram-negativas
10Me16:0, i17:1ω7 Bacterias sulfatorreductoras i17:1ω7c Desulfovibrio
Las poblaciones microbianas de cualquier nicho medioambiental se pueden
estudiar más fácil, precisa y rápidamente que en los viejos tiempos “pre-PCR” mediante
el empleo de métodos de análisis de comunidades como la DGGE y la electroforesis en
gel con gradiente de temperatura (TGGE) del DNA amplificado. Estas dos técnicas
permiten la separación de fragmentos de DNA con diferente secuencia de bases en un
gel de poliacrilamida. La temperatura o concentración de reactivos desnaturalizantes
(formamida, urea) a la que las dos hebras de DNA se separan depende de la secuencia
de bases. Se evita la separación completa de las dos hebras (y su salida del gel)
mediante una “cola GC” que se fija a uno de los extremos. Esta ristra de bases de
guanina y citosina mantiene a las dos hebras de DNA unidas incluso a altas
temperaturas o concentraciones desnaturalizantes. Así el DNA total de una población
mixta se puede amplificar con un par de cebadores generales (para eubacterias, por
ejemplo) y el DNA amplificado de las diferentes bacterias, que serán fragmentos de
tamaño similar, indistinguibles en un gel corriente de agarosa, se pueden separar en un
gel DGGE/TGGE (Figura 8). Las bandas separadas se pueden cortar y clonar o
amplificarse para su secuenciación, permitiendo una determinación rápida de la
diversidad (y, si es posible, de las identidades) de los microorganismos de la muestra. El
análisis filogenético, basado en las secuencias determinadas experimentalmente junto
con aquellas previamente depositadas, puede indicar el grado de relación entre los
microorganismos presentes y aquellos que ya se conocen.
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Figura 8. Técnica de electroforesis en gel de gradiente para separar fragmentos de DNA con diferente secuencia de bases: (a) diagrama que muestra los pasos necesarios (basado en Amann y Ludwig, 2000).
Figura 8 (continuación) (b) productos de PCR de diferentes hongos separados mediante DGGE. Número de línea (de izquierda a derecha): 1, mezcla de hongos; 2, Penicillium; 3, Cladosporium; 4, Alternaria; 5, Aspergillus; 6, Acremonium. Fotografía: Dra. Denise Saad.
Esta aproximación se ha utilizado para mostrar que la biodiversidad en suelos
árticos aumenta en respuesta a la contaminación por petróleo y que la mayoría de los
miembros de la comunidad pertenecen al grupo de las bacterias Gram-positivas con alto
contenido en G+C. Las diversas actividades en la comunidad se pueden investigar
mediante el aislamiento y la amplificación del mRNA presente (o, de forma más
sencilla, del RNA total). En este caso, el uso de microarrays de DNA (chips) es
probable que tenga gran utilidad. Los microarrays son conjuntos ordenados de múltiples
sondas de DNA fijadas a una superficie pequeña (el microchip). Se pueden fijar
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alrededor de 90.000 sondas a un único chip. En la Figura 9 se muestra de forma
esquemática cómo se puede diseñar y utilizar un array. Se están utilizando para
caracterizar la estructura y función de comunidades complejas. Por ejemplo, para
monitorizar la biodegradación potencial in situ en ambientes contaminados se está
empleando un array básico de genes catabólicos derivados de genes microbianos para la
degradación de contaminantes orgánicos y genes implicados en ciclos geoquímicos.
También se han desarrollado chips de proteínas, pero todavía no se utilizan mucho.
Figura 9. (a) Producción y (b) uso de microarrays.
4.3. Proteómica
La comparación de secuencias de proteínas, en vez de DNA, es un enfoque
alternativo para la identificación de actividades relevantes en los organismos causantes
de deterioro. La proteómica comprende la identificación de proteínas, elucidando su
estructura tridimensional y determinando cómo interaccionan. El proteoma es mucho
más complicado que el genoma y ofrece mayores posibilidades a los científicos, ¡al
igual que mayores desafíos! Un único gen puede producir múltiples productos génicos,
permitiendo reunir más información sobre un sistema particular.
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Una vez que el DNA genómico de un organismo se ha secuenciado completa o
sustancialmente, se pueden calcular las proteínas que se podrían producir, basándonos
en nuestro conocimiento del funcionamiento del genoma bacteriano. Estas secuencias
de proteínas se pueden comparar posteriormente con bases de datos de secuencias de
enzimas para determinar si la bacteria que se está investigando tiene la capacidad de
producir una proteína de estructura similar a una enzima conocida. Solo se necesita
conocer la secuencia del sitio activo de la enzima para llevar a cabo este proceso y
obtener un resultado apasionante, indicando que un organismo aislado de una muestra
particular tiene la información genética necesaria para degradar ese sustrato. Los COGs
(conjuntos de grupos ortólogos de proteínas) codificados en los genomas de varios
microorganismos representan rutas o sistemas funcionales, tales como los de reparación
del DNA y transporte de iones y se pueden encontrar en la dirección
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG.
4.4. Técnicas de Análisis de Superficies
En la actualidad, se utilizan en Biodeterioro un número de técnicas
instrumentales extremadamente sensibles para el análisis de superficies. Estas incluyen
los microscopios mencionados en la sección anterior sobre técnicas de detección, o los
microscopios ópticos normales, cuyo uso, en combinación con instrumentos que
realizan el análisis químico de las superficies a nivel de microescala, nos permiten
correlacionar áreas de material dañado con la presencia de células o sus productos
metabólicos y, por consiguiente, relacionar las actividades microbianas directamente
con el deterioro. Las técnicas que se han usado de esta forma incluyen el análisis de
energía dispersiva de rayos X, espectroscopia de infrarrojos, espectroscopia de
infrarrojos por transformada de Fourier, difracción de rayos X, espectrometría de rayos
X, fluorescencia de rayos X, espectroscopia de reflectancia infrarroja de absorción
intensificada superficialmente y espectroscopia de masas de ionización secundaria de
tiempo de vuelo.
4.5. Microsensores
El desarrollo de sensores de unas pocas micras de diámetro ha permitido obtener
medidas de pH y de diversos iones dentro de la biopelícula. Obviamente, esta tecnología
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será de inmensa importancia a la hora de relacionar actividades microbianas con el
deterioro de materiales y su prevención. Ya se han utilizado, por ejemplo, para
determinar la concentración de cloro en una biopelícula artificial de Pseudomonas
aeruginosa y Klebsiella pneumoniae. La concentración de cloro medida en la
biopelícula era típicamente del 20% o menos que la concentración en el líquido. Se han
utilizado microsensores de oxígeno, pH, sulfuro de hidrógeno, ión amonio, ión nitrato e
ión nitrito para examinar la dinámica de nitrificación y de fotosíntesis en las
biopelículas. Sin embargo, incluso estos pequeños sensores son considerablemente más
grandes que una célula bacteriana típica y su introducción dentro de la biopelícula
puede causar algunas alteraciones; por tanto, la técnica es invasiva y se pueden producir
artefactos. Esto debe tenerse en cuenta a la hora de interpretar los resultados en relación
con el Biodeterioro de la superficie subyacente.
5. El Futuro Muchas de las tecnologías descritas en esta Unidad constituyen técnicas de
rutina en la investigación del Biodeterioro. Otras requieren aún un desarrollo
considerable antes de ser aplicadas. Las técnicas de PCR basadas en DNA y RNA ya se
han desarrollado en forma de kits para la identificación de especies y actividades y es
probable que los microarrays sean utilizados cada vez más. La proteómica está aún en
pañales, pero creciendo rápidamente. Ofrece oportunidades apasionantes para el estudio
de los mecanismos de Biodeterioro y será, sin duda, utilizada en el futuro. Sin embargo,
siempre habrá en la investigación y en los ensayos de rutina un lugar para los métodos
clásicos de microbiología.
Adaptado del Libro “Introducción al Biodeterioro”, Dennis Allsopp, Kenneth Seal, Christine Gaylarde. Editorial Acribia. 2008.