Metodi immunometrici Metodi immunometrici convenzionali e proteomici per convenzionali e proteomici per la rilevazione di autoanticorpi la rilevazione di autoanticorpi

organo specificiorgano specifici

dott. Danila Bassetti dott. Danila Bassetti Struttura Semplice SierologiaStruttura Semplice Sierologia AutoimmunitAutoimmunitààMicrobiologia Virologia, Ospedale S.Chiara Microbiologia Virologia, Ospedale S.Chiara -- TrentoTrento

Gruppo di StudioGruppo di Studio AutoimmunologiaAutoimmunologia –– SIMeLSIMeL

BassanoBassano 77--9 ottobre 20099 ottobre 2009

Tecnologie innovative Tecnologie innovative (specificit(specificitààautoanticorpaliautoanticorpali, gestione del campione, , gestione del campione, possibilitpossibilitàà di determinazioni multiple, di determinazioni multiple, automazione completa, strumentazione automazione completa, strumentazione non dedicata)non dedicata)

Consolidamenti in atto Consolidamenti in atto (esigenze di (esigenze di assorbire aumentati carichi di lavoro, assorbire aumentati carichi di lavoro, confronto clinico meno facilitato) confronto clinico meno facilitato)

Nuovi scenari nel Laboratorio di Nuovi scenari nel Laboratorio di AutoimmunologiaAutoimmunologia

TecniciTecnici: sensibilit: sensibilitàà, specificit, specificitàà, , standardizzazionestandardizzazione

PraticiPratici: oggettivit: oggettivitàà, tipologia , tipologia risposta, disponibilitrisposta, disponibilitàà test II livello, test II livello, automazione, accesso continuo,automazione, accesso continuo, randomrandom

GestionaliGestionali: numerosit: numerositàà campioni, campioni, tempitempi refertazionerefertazione,, economiciteconomicitàà, , organizzazione del Laboratorioorganizzazione del Laboratorio

Criteri di scelta analitica in Criteri di scelta analitica in Autoimmunologia Autoimmunologia Test/tecnologia: caratteristiche idealiTest/tecnologia: caratteristiche ideali

AppropriatezzaAppropriatezza analiticaanalitica: : sensibilitsensibilitàà e e specificitspecificitàà

Efficacia per il LaboratorioEfficacia per il Laboratorio: : orientativa orientativa perper teststests di II livello, esigenza adeguata di di II livello, esigenza adeguata di conferme e test reflexconferme e test reflex

Efficacia clinicaEfficacia clinica: : orientativa per diagnosiorientativa per diagnosiEfficienzaEfficienza: : investimento di risorse, resa, investimento di risorse, resa,

operativitoperativitàà commisurata alla realtcommisurata alla realtàà ed ai ed ai carichi di lavoro del Laboratorio carichi di lavoro del Laboratorio

MAOS ed AutoanticorpiMAOS ed Autoanticorpi

Nelle malattie autoimmuni organo specifiche l’identificazione e laidentificazione e la validazionevalidazione didi markers markers sierologicisierologici può avere obiettivi di:

•• diagnosi precocediagnosi precoce

•• diagnosi differenzialediagnosi differenziale

•• monitoraggiomonitoraggio

• screeningscreening

•• prognosiprognosi

SubstratoNatura(sezionidi tessuto,colture cellulari)origine(umana, animale)fissazione

Sierotampone di diluizionediluizione adeguata

Incubazionedurata temperatura

Coniugatonatura, originispecificitàdiluizione adeguata

Strumentazionestato del microscopiostabilizzazione fluor.

Interpretazioneconoscenza dell’istologia del substrato

IFI: fattori variabiliIFI: fattori variabili

VantaggiRapiditàSemplicitàEconomicitàVersatilità

SvantaggiOperatore-dipendenzaLettura interpretativaTessuti di difficile reperimentoMicroscopio a fluorescenza

ImmunofIuorescenza indirettaImmunofIuorescenza indiretta IFI e MAOSIFI e MAOS

Riconoscimento della positività

IFI consente una visione aGRANDGRAND’’ANGOLOANGOLO

dell’espressione antigenica

Identificazione dell’antigene

ELISA consente una visione aZOOMZOOM

dell’espressione antigenica

Tradizionali• ELISA• CLIA• Immunoblotting

Innovativi (multiplex): profili autoAb• Automazione discreta (AtheNA, FIDIS,

QuantaPlex, UltraPlex)• Automazione completa (BioPlex 2000)

Metodi alternativi ad IFIMetodi alternativi ad IFI(tecnologia e gestione) (tecnologia e gestione)

Tecniche analitiche Tecniche analitiche alternative ad IFI nella alternative ad IFI nella diagnosi di Laboratorio diagnosi di Laboratorio

delle MAOS:delle MAOS:

Logica di UtilizzoLogica di Utilizzo

Metodi immunologici per il rilievo Metodi immunologici per il rilievo di autoanticorpidi autoanticorpi

METODI IMMUNOCHIMICIMETODI IMMUNOCHIMICI : consentono la ricerca qualitativa (presenza/assenza)

1. Immunoblotting : Western Blot (WB), Dot e Line Blot

2. Immunofluorescenza indiretta (IFI)

METODI IMMUNOMETRICIMETODI IMMUNOMETRICI : consentono una ricerca quantitativa

1. Immunoenzimatico (EIA)2. Immunofluorimetria (FIA)3. Immunochemiluminometria (CLIA)4. Radioimmunologia (RIA)

Tecniche alternative ad IFITecniche alternative ad IFI

Quando ?

Perché ?

Quali ?

In alternativaIn sostituzioneIn aggiunta

ad IFI

Metodi immunometriciMetodi immunometrici Caratteristiche tecniche analiticheCaratteristiche tecniche analitiche

IFA ELISA ID IBAntigeni nativi in

situ nativi o ricombinanti

Solubili da estratti tissut.

denaturati (blot)

Principi fissazione di AC su AG in situ

reazione AG-AC in fase solida

precipitazione su gel degli Ac e AG solubili

reazione di AC con AG separati elettroforetic.

Specificità multipla singola multipla singola Sensibilità ++ +++ + ++ Dosaggio + +++ - - Complessità ++ ++ + +++ Tempi + + +++ ++ Costo ++ +++ + +++

ELISAELISA

PIASTRA E RELATIVA PIASTRA E RELATIVA

CURVA DI UN DOSAGGIO CURVA DI UN DOSAGGIO

QUANTITATIVOQUANTITATIVO

ELISA: fattori variabiliELISA: fattori variabili

Antigeneorigine, natura, dimensioni, formacomposizione, purezza, stabilitàantigenicità

Adsorbimento sul supporto (coating)adsorbimento semplice: plastica (polistirene, polivinile)immobilizzazione assistita: presensibilizzazione del supportolegame covalente: plastica modificata

Influenza dell’adsorbimentoquantità di antigene adsorbito (densità degli epitopi) deformazione della molecolaorientamento spaziale della molecola (presentazione ed accessibilitàdegli epitopi)stabilità del coating

ANTIGENEFISSAGGIOCONIUGATO

Elementi di criticitElementi di criticitàà nella scelta nella scelta IFI / EIAIFI / EIA

ANTIGENE: ANTIGENE: tecniche di estrazione e purificazione tecniche di estrazione e purificazione

• Trattamenti fisici:omogenizzazionecentrigugazione

• Trattamenti chimici: enzimisolventi

• Purificazione

DenaturazioneImpurità

denaturation

Denaturation

native purification

Epitopo conformazionale

Epitopo lineare

Proteina denaturata:

Rottura regione antigenica

Epitopi antigenici

denaturazione

Conformazione nativa

Proteina nativa

Rinaturazione totale 100 %

Rinaturazione parziale

Purificazione nativa

Confromazione distrutta

denaturation

Denaturation

native purification

Epitopo conformazionale

Epitopo lineare

Proteina denaturata:

Rottura regione antigenica

Epitopi antigenici

denaturazione

Conformazione nativa

Proteina nativa

Rinaturazione totale 100 %

Rinaturazione parziale

Purificazione nativa

Conformazione distrutta

ANTIGENE ESTRATTIVO: ANTIGENE ESTRATTIVO: denaturazionedenaturazione--rinaturazionerinaturazione

Antigeni

IFICelluleTessuti

EIAAntigeni naturali purificatiAntigeni estrattivi “Antigeni ricombinanti

Fissaggio antigeni

IFIFissanti variConservazione

EIACoatingAdesione wells

Coniugato

IFI - EIAStabilitàIsotipo IgG IgA IgMPolivalente

Enzima/Substrato

EIAPerossidasi (HPR)Fostatasi alcalina

Stabilità

Antigene idoneo

Coniugato appropriato

Scelta IFI / EIAScelta IFI / EIA

E L I S A E L I S A -- CLIACLIA

Vantaggi• Standardizzazione• Operatività• Quantizzazione• Automazione

Svantaggi:• AG - limitazione• Costo

ChemiluminescenzaChemiluminescenza• Chemiluminescenza

Le molecole chemiluminescenti raggiungono lo stato eccitato in seguito ad una reazione chimica. In seguito si ha un decadimento a livello elettronico fondamentale con generazione di energia luminosa. In alcuni casi il risultato della reazione sarà la rottura di un legame chimico.Ci sono due tipi di Chemiluminescenza:

Glow L’emissione della luce èprolungata nel tempo

Flash L’emissione di luce è molto rapida (pochi secondi)

formato: indiretto, 2-step (10’+10’)1o risultato: ca. 35'throughput: 86 resultati/h

materieprime • Fase solida (particelle magnetiche):

Antigeni• tracciante:

MoAb α-IgG : ABEI

Schema del test

campione(IgG)

CLIA: caratteristiche del testCLIA: caratteristiche del test IMMUNOCHEMILUMINESCENZAIMMUNOCHEMILUMINESCENZAGli analizzatori per questa metodologia offrono una automazione completa

Caratteristiche tecnologiche di questi sistemi : utilizzo di microparticelle paramagnetiche o sferette di polistirene ricoperte di Antigene che costituiscono la fase solida,utilizzo di un tracciantechemiluminescente e disponibilità di una curva “master” per ogni test con ricalibrazione su 2 punti

Gli strumenti prevedono il caricamento continuo di nuovi campioni e reagenti con strumentazione attiva

Gli analizzatori per questa metodologia offrono una automazione completa

Caratteristiche tecnologiche di questi sistemi : utilizzo di microparticelle paramagnetiche o sferette di polistirene ricoperte di Antigene che costituiscono la fase solida,utilizzo di un tracciantechemiluminescente e disponibilità di una curva “master” per ogni test con ricalibrazione su 2 punti

Gli strumenti prevedono il caricamento continuo di nuovi campioni e reagenti con strumentazione attiva

IMMUNOFLUOROENZIMATICAIMMUNOFLUOROENZIMATICA

Gli analizzatori per questa metodologia sono strumenti ad automazione totale

Caratteristiche tecnologiche di questi sistemi : utilizzo di una camera di reazione o micropozzettocon adesi alla parete autoantigeni singoli o in pool , substrato-indicatore costituito da una sostanzafluorocroma e un sistema di calibrazione unico per più test con ricalibrazione a due punti

Gli strumenti prevedono il caricamento continuo di nuovi campioni e reagenti con strumentazione ferma.

Gli analizzatori per questa metodologia sono strumenti ad automazione totale

Caratteristiche tecnologiche di questi sistemi : utilizzo di una camera di reazione o micropozzettocon adesi alla parete autoantigeni singoli o in pool , substrato-indicatore costituito da una sostanzafluorocroma e un sistema di calibrazione unico per più test con ricalibrazione a due punti

Gli strumenti prevedono il caricamento continuo di nuovi campioni e reagenti con strumentazione ferma.

Immunometria: vantaggiImmunometria: vantaggi

Accesso randomDefinizione “profili” AutoAb StandardizzazioneAutomazioneRiproducibilitàAlta specificità e sensibilità

SDS - elettroforesi ImmunoblottingImmunoblotting: principi: principi

Separazione degli antigenitrattamento con agenti riducenti (SDS)elettroforesi in gel di poliacrilamide (PAGE)separazione delle proteine in funzione del loro p.m.

Trasferimento degli antigenimediante campo elettricotrasferimento su nitrocellulosa

Incubazioneincubazione della membrana con il siero fissazione degli anticorpi sugli antigeni

Evidenziazione degli anticorpiincubazione con antiglobulina marcata con enzimaincubazione con il substrato dell’enzimacomparsa di bande anticorpalideterminazione del p. m. e della specificità antigenica

IMMUNOBLOTTING IMMUNOBLOTTING

Gli antigeni vengono separatiGli antigeni vengono separati elettroforeticamenteelettroforeticamente su un gel di poliacrilamide ( un agente riducente denatura le proteine rompendo i ponti disolfuro )WesternWestern BlottingBlotting:: la separazione elettroforetica viene trasferita su una membrana di nitrocellulosaDot BlotDot Blot: al termine dell’elettroforesi le proteine sono “selezionate” e quindi trasferite su nitrocellulosaIn entrambe le metodiche le strips vengono incubate incubate con i siericon i sieri opportunamente diluiti e quindi incubate con un antisiero coniugato con un enzimaantisiero coniugato con un enzimaL’aggiunta di substratosubstrato e la conseguente reazione evidenzia bandebande che vengono poi confrontate con marcatori di PM noto

Dot Line Blottrasferimento diretto di molecole su membrana di nitrocellulosa o nylon –si ottengono aspetti:

punto dot blot

linea line blot

Immunoblotting: vantaggiImmunoblotting: vantaggi

Alta flessibilitàPraticitàRiproducibilitàAlta specificità e sensibilità

TestTest blotblot perper AgAg epaticiepatici

LKM+M2+ SLA+

PDH 74 kD

51 kD 52-50 kD53 kD

Immunoblotting ed Epatopatie autoimmuni MAOS:MAOS: EpatologiaEpatologia

EPATITE AUTOIMMUNE 1EPATITE AUTOIMMUNE 1

Antigeni nucleari: DNA, SSA, SSBCitoscheletro: muscolo liscio, actinaCitosol: SLA (citocheratina 8-18, glutationetransferasi), LC2Membrana epatocita: LSP, recettore Asialoglicoproteina

IFA, EIA, WB““

EIA

MAOS:MAOS: EpatologiaEpatologiaEPATITE AUTOIMMUNE 2EPATITE AUTOIMMUNE 2

Microsomi: LKM1 (Citocromo P450-IID6)Citosol: LC1 (Formininotransferasi-cyclodesaminasi)

IFA, EIA, WB

“

MAOS:MAOS: EpatologiaEpatologiaCIRROSI BILIARE PRIMITIVACIRROSI BILIARE PRIMITIVA

Antigeni nucleari: Centromero, Multiple Nuclear Dots 95 kDMembrana nucleare: gp210 (nuclear pore protein)Mitocondri: M2 (Piruvatodeidrogenasi), M4 (Sulfitossidasi), M9 (Glicogenofosforillasi)

IFA, EIA, WB

“

“

AMA: test di laboratorioAMA: test di laboratorioBizzaro N et al. 2008Bizzaro N et al. 2008

MAOS:MAOS: EpatologiaEpatologia -- altre epatitialtre epatiti

Acido tienilicoIdralazinaHDVHAV

IFA, EIA, WBWB EIAIFA, EIA

Microsomi: LKM2 Microsomi: LM Microsomi: LKM3Citoscheletro: vimentina

MAOS: EndocrinologiaMAOS: Endocrinologia

Tiroiditi M.Basedow

TG, TPO

Recettore TSH

IFA, EIA RIA, EIA

IDDM ICA GAD 65 ICA 512 (IA2) IAA

IFA EIA, WB, IPA EIA, IPA

RIA

M.Addison

ACA-microsomi cortex (21idrossilasi)

IFA,EIA,WB, IPA

MAOS:MAOS: gastroenterologiagastroenterologia

Gastrite atrofica

APCA Fattore intrinseco H+/K+ ATPasi

IFA EIA

M. Crohn Colite ulcerosa

ASCA X-ANCA BPI

EIA IFA EIA

Celiachia EMA IgA tTG IgA, IgG AGA IgG, IgA ARA

IFA EIA EIA IFA

ELISA / CLIA eELISA / CLIA e CeliachiaCeliachia CeliachiaCeliachia

Specificità Sensibilità

AGA IgG Children 79% 94% IgA Children 97% 61% IgG Adults 88% 70% IgA Adults 98% 60%

ARA IgG 100% 65% EMA IgA 99% 97% htTG IgA 97% 99%

MAOS:MAOS: nefrologianefrologia, neurologia, neurologia

M.Goodpasture GBM IFA EIA

Miastenia AchR EIA RIA

MAOS: neurologiaMAOS: neurologia

SNC: Sd.paraneoplastiche: Deg. cerebellare Encefalomielite Opsoclono Sd.Stiff-man

PCA 1 / Yo ANNA-1 /Hu ANNA-2 /Ri GAD

IFA, EIA, WB

SNP: Sd.paraneoplastiche: Neuropatia subacuta Neuropatia con ac.Gs

ANNA-1 /Hu, MAG Anti Gangliosidi (GM1, asialo-GM1, GD1, Sulfatide, Galattocerebroside, GQ 1b, GO 1b

IFA, EIA, WB

MAOS: dermatologiaMAOS: dermatologia

Pemfigo PV,PF,PP

ICS (desmosomi) Desmogleina 3 Desmogleina 1 Desmoplachina 1- 2

IFA EIA,WB

Pemfigoide BP EBA PC

MBZ (emidesmosomi) IgG-M

BP 230, 180 Collageno VII Laminina

IFA EIA, EIA, WB EIA, WB

Vitiligine Anti-melanina EIA, IDD

Criteri per la scelta di un metodoCriteri per la scelta di un metodo

E’ importante giungere alla scelta di un metodoin base a:Rapporto con i clinici : necessità di indagini mirate a specifiche esigenze diagnosticheFinalità del test : screening , approfondimento , monitoraggio (ogni test offre differenti performances in termini di sensibilità e specificità)Compatibilità del metodo con la struttura tecnologica e organizzativa del Laboratorio

E’ importante giungere alla scelta di un metodoin base a:Rapporto con i clinici : necessità di indagini mirate a specifiche esigenze diagnosticheFinalità del test : screening , approfondimento , monitoraggio (ogni test offre differenti performances in termini di sensibilità e specificità)Compatibilità del metodo con la struttura tecnologica e organizzativa del Laboratorio

Scelta IFA / EIAScelta IFA / EIAEvidence Based MedicineEvidence Based Medicine

Efficacia

Efficienza

Requisiti per la validazione di Requisiti per la validazione di un test di Laboratorioun test di Laboratorio

Efficacia tecnicaEfficacia tecnicain relazione alle tecniche analitiche utilizzatetecniche analitiche utilizzatemonitorata con CQi e VEQCQi e VEQ

Accuratezza diagnosticaAccuratezza diagnosticaespressa in termini di sensibilitsensibilitàà e di specificitspecificitàà di nell’ambito della popolazione considerata (predittivitàe Bayes)orientata alla finalità di assumere decisioni cliniche decisioni cliniche (diagnostiche e terapeutiche)(diagnostiche e terapeutiche)

Outcome clinicoOutcome clinico

Metodi alternativi ad IFIMetodi alternativi ad IFI

Quando

Perché

Quali

Applicazioni test ELISA in Applicazioni test ELISA in AutoimmunologiaAutoimmunologia

In sostituzione

Diagnosi di laboratorio di Malattia CeliacaLa ricerca di IgA anti Transglutaminasi èil test di I livello (sens. 99% spec. 97%), cui può seguire la ricerca con IFI di IgA anti-Endomisio su esogafo di primate.

Applicazioni test ELISA in Applicazioni test ELISA in AutoimmunologiaAutoimmunologia

In aggiunta

Nella determinazione degli AMAl’associazione della tecnica IFA ed ELISA (per antigeni specifici MIT3, gp210, sp100) consente una miglioramento sensibilità clinica

Nuove tecnologie: Microarray Nuove tecnologie: Microarray e Multiplexe Multiplex

precisa correlazione fra patologia ed antigenedubbi interpretativi in IFIpositività concomitanti sovrappostedifferenziazione antigeni

Metodi Immunometrici: Metodi Immunometrici: analiticamente preferibilianaliticamente preferibili

Modello gerarchico per la Modello gerarchico per la valutazione di esami diagnostici valutazione di esami diagnostici

6) valutazionieconomiche

5) risultati per il paziente4) decisioni terapeutiche3) decisioni diagnostiche

2) accuratezza diagnostica 1) efficacia tecnica

(modificato da Fryback e Thornbury)

efficiency

effectiveness

efficacy