Metodi immunometrici Metodi immunometrici convenzionali e proteomici per convenzionali e proteomici per la rilevazione di autoanticorpi la rilevazione di autoanticorpi
organo specificiorgano specifici
dott. Danila Bassetti dott. Danila Bassetti Struttura Semplice SierologiaStruttura Semplice Sierologia AutoimmunitAutoimmunitààMicrobiologia Virologia, Ospedale S.Chiara Microbiologia Virologia, Ospedale S.Chiara -- TrentoTrento
Gruppo di StudioGruppo di Studio AutoimmunologiaAutoimmunologia –– SIMeLSIMeL
BassanoBassano 77--9 ottobre 20099 ottobre 2009
Tecnologie innovative Tecnologie innovative (specificit(specificitààautoanticorpaliautoanticorpali, gestione del campione, , gestione del campione, possibilitpossibilitàà di determinazioni multiple, di determinazioni multiple, automazione completa, strumentazione automazione completa, strumentazione non dedicata)non dedicata)
Consolidamenti in atto Consolidamenti in atto (esigenze di (esigenze di assorbire aumentati carichi di lavoro, assorbire aumentati carichi di lavoro, confronto clinico meno facilitato) confronto clinico meno facilitato)
Nuovi scenari nel Laboratorio di Nuovi scenari nel Laboratorio di AutoimmunologiaAutoimmunologia
TecniciTecnici: sensibilit: sensibilitàà, specificit, specificitàà, , standardizzazionestandardizzazione
PraticiPratici: oggettivit: oggettivitàà, tipologia , tipologia risposta, disponibilitrisposta, disponibilitàà test II livello, test II livello, automazione, accesso continuo,automazione, accesso continuo, randomrandom
GestionaliGestionali: numerosit: numerositàà campioni, campioni, tempitempi refertazionerefertazione,, economiciteconomicitàà, , organizzazione del Laboratorioorganizzazione del Laboratorio
Criteri di scelta analitica in Criteri di scelta analitica in Autoimmunologia Autoimmunologia Test/tecnologia: caratteristiche idealiTest/tecnologia: caratteristiche ideali
AppropriatezzaAppropriatezza analiticaanalitica: : sensibilitsensibilitàà e e specificitspecificitàà
Efficacia per il LaboratorioEfficacia per il Laboratorio: : orientativa orientativa perper teststests di II livello, esigenza adeguata di di II livello, esigenza adeguata di conferme e test reflexconferme e test reflex
Efficacia clinicaEfficacia clinica: : orientativa per diagnosiorientativa per diagnosiEfficienzaEfficienza: : investimento di risorse, resa, investimento di risorse, resa,
operativitoperativitàà commisurata alla realtcommisurata alla realtàà ed ai ed ai carichi di lavoro del Laboratorio carichi di lavoro del Laboratorio
MAOS ed AutoanticorpiMAOS ed Autoanticorpi
Nelle malattie autoimmuni organo specifiche l’identificazione e laidentificazione e la validazionevalidazione didi markers markers sierologicisierologici può avere obiettivi di:
•• diagnosi precocediagnosi precoce
•• diagnosi differenzialediagnosi differenziale
•• monitoraggiomonitoraggio
• screeningscreening
•• prognosiprognosi
SubstratoNatura(sezionidi tessuto,colture cellulari)origine(umana, animale)fissazione
Sierotampone di diluizionediluizione adeguata
Incubazionedurata temperatura
Coniugatonatura, originispecificitàdiluizione adeguata
Strumentazionestato del microscopiostabilizzazione fluor.
Interpretazioneconoscenza dell’istologia del substrato
IFI: fattori variabiliIFI: fattori variabili
VantaggiRapiditàSemplicitàEconomicitàVersatilità
SvantaggiOperatore-dipendenzaLettura interpretativaTessuti di difficile reperimentoMicroscopio a fluorescenza
ImmunofIuorescenza indirettaImmunofIuorescenza indiretta IFI e MAOSIFI e MAOS
Riconoscimento della positività
IFI consente una visione aGRANDGRAND’’ANGOLOANGOLO
dell’espressione antigenica
Identificazione dell’antigene
ELISA consente una visione aZOOMZOOM
dell’espressione antigenica
Tradizionali• ELISA• CLIA• Immunoblotting
Innovativi (multiplex): profili autoAb• Automazione discreta (AtheNA, FIDIS,
QuantaPlex, UltraPlex)• Automazione completa (BioPlex 2000)
Metodi alternativi ad IFIMetodi alternativi ad IFI(tecnologia e gestione) (tecnologia e gestione)
Tecniche analitiche Tecniche analitiche alternative ad IFI nella alternative ad IFI nella diagnosi di Laboratorio diagnosi di Laboratorio
delle MAOS:delle MAOS:
Logica di UtilizzoLogica di Utilizzo
Metodi immunologici per il rilievo Metodi immunologici per il rilievo di autoanticorpidi autoanticorpi
METODI IMMUNOCHIMICIMETODI IMMUNOCHIMICI : consentono la ricerca qualitativa (presenza/assenza)
1. Immunoblotting : Western Blot (WB), Dot e Line Blot
2. Immunofluorescenza indiretta (IFI)
METODI IMMUNOMETRICIMETODI IMMUNOMETRICI : consentono una ricerca quantitativa
1. Immunoenzimatico (EIA)2. Immunofluorimetria (FIA)3. Immunochemiluminometria (CLIA)4. Radioimmunologia (RIA)
Tecniche alternative ad IFITecniche alternative ad IFI
Quando ?
Perché ?
Quali ?
In alternativaIn sostituzioneIn aggiunta
ad IFI
Metodi immunometriciMetodi immunometrici Caratteristiche tecniche analiticheCaratteristiche tecniche analitiche
IFA ELISA ID IBAntigeni nativi in
situ nativi o ricombinanti
Solubili da estratti tissut.
denaturati (blot)
Principi fissazione di AC su AG in situ
reazione AG-AC in fase solida
precipitazione su gel degli Ac e AG solubili
reazione di AC con AG separati elettroforetic.
Specificità multipla singola multipla singola Sensibilità ++ +++ + ++ Dosaggio + +++ - - Complessità ++ ++ + +++ Tempi + + +++ ++ Costo ++ +++ + +++
ELISAELISA
PIASTRA E RELATIVA PIASTRA E RELATIVA
CURVA DI UN DOSAGGIO CURVA DI UN DOSAGGIO
QUANTITATIVOQUANTITATIVO
ELISA: fattori variabiliELISA: fattori variabili
Antigeneorigine, natura, dimensioni, formacomposizione, purezza, stabilitàantigenicità
Adsorbimento sul supporto (coating)adsorbimento semplice: plastica (polistirene, polivinile)immobilizzazione assistita: presensibilizzazione del supportolegame covalente: plastica modificata
Influenza dell’adsorbimentoquantità di antigene adsorbito (densità degli epitopi) deformazione della molecolaorientamento spaziale della molecola (presentazione ed accessibilitàdegli epitopi)stabilità del coating
ANTIGENEFISSAGGIOCONIUGATO
Elementi di criticitElementi di criticitàà nella scelta nella scelta IFI / EIAIFI / EIA
ANTIGENE: ANTIGENE: tecniche di estrazione e purificazione tecniche di estrazione e purificazione
• Trattamenti fisici:omogenizzazionecentrigugazione
• Trattamenti chimici: enzimisolventi
• Purificazione
DenaturazioneImpurità
denaturation
Denaturation
native purification
Epitopo conformazionale
Epitopo lineare
Proteina denaturata:
Rottura regione antigenica
Epitopi antigenici
denaturazione
Conformazione nativa
Proteina nativa
Rinaturazione totale 100 %
Rinaturazione parziale
Purificazione nativa
Confromazione distrutta
denaturation
Denaturation
native purification
Epitopo conformazionale
Epitopo lineare
Proteina denaturata:
Rottura regione antigenica
Epitopi antigenici
denaturazione
Conformazione nativa
Proteina nativa
Rinaturazione totale 100 %
Rinaturazione parziale
Purificazione nativa
Conformazione distrutta
ANTIGENE ESTRATTIVO: ANTIGENE ESTRATTIVO: denaturazionedenaturazione--rinaturazionerinaturazione
Antigeni
IFICelluleTessuti
EIAAntigeni naturali purificatiAntigeni estrattivi “Antigeni ricombinanti
Fissaggio antigeni
IFIFissanti variConservazione
EIACoatingAdesione wells
Coniugato
IFI - EIAStabilitàIsotipo IgG IgA IgMPolivalente
Enzima/Substrato
EIAPerossidasi (HPR)Fostatasi alcalina
Stabilità
Antigene idoneo
Coniugato appropriato
Scelta IFI / EIAScelta IFI / EIA
E L I S A E L I S A -- CLIACLIA
Vantaggi• Standardizzazione• Operatività• Quantizzazione• Automazione
Svantaggi:• AG - limitazione• Costo
ChemiluminescenzaChemiluminescenza• Chemiluminescenza
Le molecole chemiluminescenti raggiungono lo stato eccitato in seguito ad una reazione chimica. In seguito si ha un decadimento a livello elettronico fondamentale con generazione di energia luminosa. In alcuni casi il risultato della reazione sarà la rottura di un legame chimico.Ci sono due tipi di Chemiluminescenza:
Glow L’emissione della luce èprolungata nel tempo
Flash L’emissione di luce è molto rapida (pochi secondi)
formato: indiretto, 2-step (10’+10’)1o risultato: ca. 35'throughput: 86 resultati/h
materieprime • Fase solida (particelle magnetiche):
Antigeni• tracciante:
MoAb α-IgG : ABEI
Schema del test
campione(IgG)
CLIA: caratteristiche del testCLIA: caratteristiche del test IMMUNOCHEMILUMINESCENZAIMMUNOCHEMILUMINESCENZAGli analizzatori per questa metodologia offrono una automazione completa
Caratteristiche tecnologiche di questi sistemi : utilizzo di microparticelle paramagnetiche o sferette di polistirene ricoperte di Antigene che costituiscono la fase solida,utilizzo di un tracciantechemiluminescente e disponibilità di una curva “master” per ogni test con ricalibrazione su 2 punti
Gli strumenti prevedono il caricamento continuo di nuovi campioni e reagenti con strumentazione attiva
Gli analizzatori per questa metodologia offrono una automazione completa
Caratteristiche tecnologiche di questi sistemi : utilizzo di microparticelle paramagnetiche o sferette di polistirene ricoperte di Antigene che costituiscono la fase solida,utilizzo di un tracciantechemiluminescente e disponibilità di una curva “master” per ogni test con ricalibrazione su 2 punti
Gli strumenti prevedono il caricamento continuo di nuovi campioni e reagenti con strumentazione attiva
IMMUNOFLUOROENZIMATICAIMMUNOFLUOROENZIMATICA
Gli analizzatori per questa metodologia sono strumenti ad automazione totale
Caratteristiche tecnologiche di questi sistemi : utilizzo di una camera di reazione o micropozzettocon adesi alla parete autoantigeni singoli o in pool , substrato-indicatore costituito da una sostanzafluorocroma e un sistema di calibrazione unico per più test con ricalibrazione a due punti
Gli strumenti prevedono il caricamento continuo di nuovi campioni e reagenti con strumentazione ferma.
Gli analizzatori per questa metodologia sono strumenti ad automazione totale
Caratteristiche tecnologiche di questi sistemi : utilizzo di una camera di reazione o micropozzettocon adesi alla parete autoantigeni singoli o in pool , substrato-indicatore costituito da una sostanzafluorocroma e un sistema di calibrazione unico per più test con ricalibrazione a due punti
Gli strumenti prevedono il caricamento continuo di nuovi campioni e reagenti con strumentazione ferma.
Immunometria: vantaggiImmunometria: vantaggi
Accesso randomDefinizione “profili” AutoAb StandardizzazioneAutomazioneRiproducibilitàAlta specificità e sensibilità
SDS - elettroforesi ImmunoblottingImmunoblotting: principi: principi
Separazione degli antigenitrattamento con agenti riducenti (SDS)elettroforesi in gel di poliacrilamide (PAGE)separazione delle proteine in funzione del loro p.m.
Trasferimento degli antigenimediante campo elettricotrasferimento su nitrocellulosa
Incubazioneincubazione della membrana con il siero fissazione degli anticorpi sugli antigeni
Evidenziazione degli anticorpiincubazione con antiglobulina marcata con enzimaincubazione con il substrato dell’enzimacomparsa di bande anticorpalideterminazione del p. m. e della specificità antigenica
IMMUNOBLOTTING IMMUNOBLOTTING
Gli antigeni vengono separatiGli antigeni vengono separati elettroforeticamenteelettroforeticamente su un gel di poliacrilamide ( un agente riducente denatura le proteine rompendo i ponti disolfuro )WesternWestern BlottingBlotting:: la separazione elettroforetica viene trasferita su una membrana di nitrocellulosaDot BlotDot Blot: al termine dell’elettroforesi le proteine sono “selezionate” e quindi trasferite su nitrocellulosaIn entrambe le metodiche le strips vengono incubate incubate con i siericon i sieri opportunamente diluiti e quindi incubate con un antisiero coniugato con un enzimaantisiero coniugato con un enzimaL’aggiunta di substratosubstrato e la conseguente reazione evidenzia bandebande che vengono poi confrontate con marcatori di PM noto
Dot Line Blottrasferimento diretto di molecole su membrana di nitrocellulosa o nylon –si ottengono aspetti:
punto dot blot
linea line blot
Immunoblotting: vantaggiImmunoblotting: vantaggi
Alta flessibilitàPraticitàRiproducibilitàAlta specificità e sensibilità
TestTest blotblot perper AgAg epaticiepatici
LKM+M2+ SLA+
PDH 74 kD
51 kD 52-50 kD53 kD
Immunoblotting ed Epatopatie autoimmuni MAOS:MAOS: EpatologiaEpatologia
EPATITE AUTOIMMUNE 1EPATITE AUTOIMMUNE 1
Antigeni nucleari: DNA, SSA, SSBCitoscheletro: muscolo liscio, actinaCitosol: SLA (citocheratina 8-18, glutationetransferasi), LC2Membrana epatocita: LSP, recettore Asialoglicoproteina
IFA, EIA, WB““
EIA
MAOS:MAOS: EpatologiaEpatologiaEPATITE AUTOIMMUNE 2EPATITE AUTOIMMUNE 2
Microsomi: LKM1 (Citocromo P450-IID6)Citosol: LC1 (Formininotransferasi-cyclodesaminasi)
IFA, EIA, WB
“
MAOS:MAOS: EpatologiaEpatologiaCIRROSI BILIARE PRIMITIVACIRROSI BILIARE PRIMITIVA
Antigeni nucleari: Centromero, Multiple Nuclear Dots 95 kDMembrana nucleare: gp210 (nuclear pore protein)Mitocondri: M2 (Piruvatodeidrogenasi), M4 (Sulfitossidasi), M9 (Glicogenofosforillasi)
IFA, EIA, WB
“
“
AMA: test di laboratorioAMA: test di laboratorioBizzaro N et al. 2008Bizzaro N et al. 2008
MAOS:MAOS: EpatologiaEpatologia -- altre epatitialtre epatiti
Acido tienilicoIdralazinaHDVHAV
IFA, EIA, WBWB EIAIFA, EIA
Microsomi: LKM2 Microsomi: LM Microsomi: LKM3Citoscheletro: vimentina
MAOS: EndocrinologiaMAOS: Endocrinologia
Tiroiditi M.Basedow
TG, TPO
Recettore TSH
IFA, EIA RIA, EIA
IDDM ICA GAD 65 ICA 512 (IA2) IAA
IFA EIA, WB, IPA EIA, IPA
RIA
M.Addison
ACA-microsomi cortex (21idrossilasi)
IFA,EIA,WB, IPA
MAOS:MAOS: gastroenterologiagastroenterologia
Gastrite atrofica
APCA Fattore intrinseco H+/K+ ATPasi
IFA EIA
M. Crohn Colite ulcerosa
ASCA X-ANCA BPI
EIA IFA EIA
Celiachia EMA IgA tTG IgA, IgG AGA IgG, IgA ARA
IFA EIA EIA IFA
ELISA / CLIA eELISA / CLIA e CeliachiaCeliachia CeliachiaCeliachia
Specificità Sensibilità
AGA IgG Children 79% 94% IgA Children 97% 61% IgG Adults 88% 70% IgA Adults 98% 60%
ARA IgG 100% 65% EMA IgA 99% 97% htTG IgA 97% 99%
MAOS:MAOS: nefrologianefrologia, neurologia, neurologia
M.Goodpasture GBM IFA EIA
Miastenia AchR EIA RIA
MAOS: neurologiaMAOS: neurologia
SNC: Sd.paraneoplastiche: Deg. cerebellare Encefalomielite Opsoclono Sd.Stiff-man
PCA 1 / Yo ANNA-1 /Hu ANNA-2 /Ri GAD
IFA, EIA, WB
SNP: Sd.paraneoplastiche: Neuropatia subacuta Neuropatia con ac.Gs
ANNA-1 /Hu, MAG Anti Gangliosidi (GM1, asialo-GM1, GD1, Sulfatide, Galattocerebroside, GQ 1b, GO 1b
IFA, EIA, WB
MAOS: dermatologiaMAOS: dermatologia
Pemfigo PV,PF,PP
ICS (desmosomi) Desmogleina 3 Desmogleina 1 Desmoplachina 1- 2
IFA EIA,WB
Pemfigoide BP EBA PC
MBZ (emidesmosomi) IgG-M
BP 230, 180 Collageno VII Laminina
IFA EIA, EIA, WB EIA, WB
Vitiligine Anti-melanina EIA, IDD
Criteri per la scelta di un metodoCriteri per la scelta di un metodo
E’ importante giungere alla scelta di un metodoin base a:Rapporto con i clinici : necessità di indagini mirate a specifiche esigenze diagnosticheFinalità del test : screening , approfondimento , monitoraggio (ogni test offre differenti performances in termini di sensibilità e specificità)Compatibilità del metodo con la struttura tecnologica e organizzativa del Laboratorio
E’ importante giungere alla scelta di un metodoin base a:Rapporto con i clinici : necessità di indagini mirate a specifiche esigenze diagnosticheFinalità del test : screening , approfondimento , monitoraggio (ogni test offre differenti performances in termini di sensibilità e specificità)Compatibilità del metodo con la struttura tecnologica e organizzativa del Laboratorio
Scelta IFA / EIAScelta IFA / EIAEvidence Based MedicineEvidence Based Medicine
Efficacia
Efficienza
Requisiti per la validazione di Requisiti per la validazione di un test di Laboratorioun test di Laboratorio
Efficacia tecnicaEfficacia tecnicain relazione alle tecniche analitiche utilizzatetecniche analitiche utilizzatemonitorata con CQi e VEQCQi e VEQ
Accuratezza diagnosticaAccuratezza diagnosticaespressa in termini di sensibilitsensibilitàà e di specificitspecificitàà di nell’ambito della popolazione considerata (predittivitàe Bayes)orientata alla finalità di assumere decisioni cliniche decisioni cliniche (diagnostiche e terapeutiche)(diagnostiche e terapeutiche)
Outcome clinicoOutcome clinico
Metodi alternativi ad IFIMetodi alternativi ad IFI
Quando
Perché
Quali
Applicazioni test ELISA in Applicazioni test ELISA in AutoimmunologiaAutoimmunologia
In sostituzione
Diagnosi di laboratorio di Malattia CeliacaLa ricerca di IgA anti Transglutaminasi èil test di I livello (sens. 99% spec. 97%), cui può seguire la ricerca con IFI di IgA anti-Endomisio su esogafo di primate.
Applicazioni test ELISA in Applicazioni test ELISA in AutoimmunologiaAutoimmunologia
In aggiunta
Nella determinazione degli AMAl’associazione della tecnica IFA ed ELISA (per antigeni specifici MIT3, gp210, sp100) consente una miglioramento sensibilità clinica
Nuove tecnologie: Microarray Nuove tecnologie: Microarray e Multiplexe Multiplex
precisa correlazione fra patologia ed antigenedubbi interpretativi in IFIpositività concomitanti sovrappostedifferenziazione antigeni
Metodi Immunometrici: Metodi Immunometrici: analiticamente preferibilianaliticamente preferibili
Modello gerarchico per la Modello gerarchico per la valutazione di esami diagnostici valutazione di esami diagnostici
6) valutazionieconomiche
5) risultati per il paziente4) decisioni terapeutiche3) decisioni diagnostiche
2) accuratezza diagnostica 1) efficacia tecnica
(modificato da Fryback e Thornbury)
efficiency
effectiveness
efficacy