11. efecto de la temperatura
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11. EFECTO DE LA TEMPERATURA
Al aumentar la T se aceleran 2 procesos independientes: la velocidad de la reacción y la inactivación térmica del E. Es
decir, si bien es necesario un aumento de T para que la actividad enzimática aumente, tendremos puntos óptimos a
partir de los cuales la actividad enzimática disminuirá.
La actividad enzimática reside en la estructura terciaria, de modo que si aumentamos la temperatura a partir del punto
óptimo,
el
E
absorbe
demasiada
energía,
alterando
la
estructura
terciaria
y,
por
tanto,
inhibiendo
la
actividad.
E FECTO DE LA T SOBRE LAS K EQ
El efecto de la T sobre las constantes de equilibrio de una reacción, viene dado por la ecuación de Van’t Hoff:
l n
Δ°
→ ln
Δ 1
1
La Δ° también puede obtenerse de:
log Δ°
2,3
1
Δ°
2,3
→ log Δ°
2,3
1
Δ°
2,3
En este caso es la constante catalítica, aunque también puede emplearse la velocidad máxima.
Conocidas la entalpía y entropía, hallamos la energía libre de Gibbs:
Δ° Δ° Δ° Otro modo de hallar la entalpía y entropía son:
log Δ°
2,3 10,32 Δ°2,3
Si hacemos la representación de
VS
tendremos una recta con pendiente negativa ( °
,) y un punto b igual a
(
10,32 °
,).
E CUACIÓN DE ARRHENIUS Y E A
Por la teoría de las colisiones tenemos que una reacción química de‐
pende de las frecuencias de las colisiones, en nuestro caso entre S y
E. Además, necesitaremos una energía mínima para que tenga lugar
una reacción (supere la montaña energético), conocida como energía
de activación ().
La constante de velocidad de una reacción es:
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Donde es la probabilidad de que haya reacción cuando se da la colisión entre reactantes; es la frecuencia de la
colisión. Esta ecuación puede transformarse en:
l n
Integrando:
log 2,3 log
Donde .
Representando log 1/, el punto de corte es log y la pendiente es ,. Generalmente, en el gráfico repre‐
sentamos la velocidad frente a 1/T, y obtenemos una , que tiene mínimas variaciones.
¿Qué sucede con la desnaturalización del enzima? Que nos aparecerán dos pendientes (generalmente una positiva y
una negativa), indicándonos que la desnaturalización del enzima requiere de una energía de activación (más positiva
que la de reacción). También sucede que hay enzimas que tienen dos actividades diferentes en función de la tempe‐
ratura, lo que se representa en dos pendientes (con y ).
E FECTO SOBRE
LAS
VELOCIDADES
DE
LAS
REACCIONES
CATALIZADAS
POR
ENZI
‐
MAS
PARÁMETROS AFECTADOS POR T
‐ Cambios en la estabilidad
‐ Solubilidad de los gases
‐ pH del tampón
‐ Afinidad de E por los ligandos (S, A o I)
‐ Reacciones que compiten entre sí
‐ Ionización de grupos prototrópicos del sistema (E‐S)
‐ Afinidad
del
E y S
‐ Velocidad de conversión del S a P
‐ Grado de asociación de E multipeptídicos
ESTABILIDAD DE LOS E
La estabilidad de un E está en función de:
‐ T
‐ pH
‐ Fuerza iónica y naturaleza del tampón
‐ Presencia o ausencia de S/cofactores (Thompson y Sullivan dijeron que los S tienden a proteger a los E de la
inactivación)
‐ [E]
‐ Otras proteínas del sistema
‐ Tiempo de incubación
‐ Presencia o ausencia de I y A
Todos estos factores han de estar controlados y, siempre que realicemos algún ensayo, tendremos que mantener las
condiciones ideales.
Los E son más estables a bajas T generalmente, aunque hay enzimas que son menos estables a 10 ºC que a 30 ºC.
Ejemplos:
‐ La catalasa de hígado de buey es inestable a 35 ºC.
‐ La
ribonucleasa
resiste
a 100
ºC.
‐ La adenilato kinasa puede hervirse sin perder actividad
‐ La fosfatasa alcalina y la peroxidasa vegetal son más estables al calor (estando a pH 7). Estos enzima se emplea
en productos lácteos.
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Existe una relación entre el tamaño, complejidad y susceptibilidad al calor del enzima. Por ejemplo, enzimas de PM
bajo (12 – 50 kDa) suelen tener una cadena polipeptídica y suelen ser más resistentes al tratamiento por calor; mien‐
tras que enzimas de estructura más grande y compleja son menos resistente al calor.
Además, cuando el enzima se encuentra en extracto crudo es mucho más estable que estando pura, ya que la concen‐
tración de enzima total disminuye. Generalmente, cuando la proteína está ya purificada, suele añadirse alguna pro‐
teína inerte, como la BSA o gelatinas comerciales, que aumentan su protección.
EFECTO DE L T EN L EST BILID D
Generalmente, a partir de un tiempo determinado, el enzima pierde la actividad. Por ello, definimos la vida media del
enzima como el tiempo que el enzima tarda en perder el 50% de la actividad máxima. Para ello, realizamos el siguiente
experimento: trabajando a altas temperaturas, disminuimos la [E] activa y, por tanto, tendremos menor actividad. Por
tanto, medimos la actividad enzimática en función del tiempo (medir a 5’ y 30’, por ejemplo) a diferentes temperatu‐
ras.
Si trabajamos a tiempos bajos, observaremos que a partir de un punto, la actividad será lineal con el tiempo, pero a
partir de un punto de T, observaremos unas velocidades iniciales altas, pero en muy poco tiempo la actividad dismi‐
nuirá. Esto es porque disminuye la cantidad del enzima al desnaturalizarse por la T y el tiempo.
La energía de activación para transformar de S a P varía entre 6000 y 15000 cal/mol; mientras que las de desnaturali‐
zación oscilan entre 50000 y 150000 cal/mol. Otro dato importante es que aunque el enzima, por ejemplo, tenga la
actividad máxima a 30 ºC, se suele trabajar a 25 o 27 ºC, porque la velocidad de desnaturalización es muchísimo mayor
a 30 que a 25 ºC.
Otro ensayo que siempre se hace es incubar el enzima con el S a varias temperaturas. Se observa la actividad del
enzima con el tiempo. Generalmente, a un rango bajo de temperaturas la estabilidad es del 100% y, a partir de un
punto, la pendiente con la que cae la estabilidad aumenta rápidamente.
IN CTIV CIÓN REVERSIBLE DEL E
Para mostrar si el enzima sufre inactivación reversible, calentamos el enzima a una temperatura moderadamente alta,
y medimos la velocidad de reacción. A continuación, guardamos a temperaturas más bajas y medimos la actividad a la
T óptima. Si la inactivación fuera irreversible, la velocidad debería ser la misma que cuando se calentó el enzima,
mientras que
si
fuera
reversible,
la
actividad
debería
ser
mayor
que
al
desnaturalizarla.
Sin embargo, hay que tener en cuenta que, independientemente de la reversibilidad del enzima, si aumentamos de‐
masiado la temperatura, tendremos inhibición reversible.
C MBIOS EN L SOLUBILID D DE LOS G SES CO N L T
La polifenol oxidasa, lipooxigenasa y glucosa oxidasa tienen como sus‐
trato de la reacción el O2. Si aumentamos la temperatura de la mez‐
cla, alteramos la solubilidad del O2 en el agua, y se inactiva la reacción.
E
FECTO
DE
L
T
SOBRE
L VELOCID D
DE
L RE CCIÓN
Un modo
de
medir
la
actividad
enzimática
es
la
Q10,
que
es
el
coefi
‐ciente con el que la velocidad de la reacción aumenta con diez grados
más de temperatura. Generalmente este coeficiente es 2 en muchos
enzimas, es decir, que la actividad se duplica cuando aumentamos la
temperatura en 10 grados. Sin embargo, cuando pasemos la T óptima,
el coeficiente decrecerá.
Este coeficiente viene determinado por la fórmula:
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