報告様式 12

科学研究実践活動のまとめ

1. タイトル

海苔のノリノリ♪種判別

Abstract

Generally, species of nori (Pyropia) are discriminated by morphological or DNA analyses.

However,these methods are usually time-consuming, require advanced technique, and

are costly. In this experiment, we focused analysis of abundant proteins(RuBisCo and

phycobiliproteins) in Pyropia,and aimed to establish an easy, rapid, and reliable method

for discrimination of nori species, by means of extraction of abundant proteins,

separation them using electrophoresis (SDS-PAGE), and mass spectrometry

(MALDI-QIT-TOF MS) of the tryptic digest. We used four kinds of cultivated or wild

Pyropia, which are different in origin, as samples. We found out that it was possible

that we could discriminate species based on the differences in the mass spectrum which

reflected the differences in the amino acid sequence of RuBisCo SSU (small subunit).

2. 研究目的

海苔（アマノリ類）の種判別には、形態や DNA による判別方法があるが、熟練を要し、

また時間とコストがかかることが難点である。その海苔（アマノリ類）にはタンパク質

が多く含まれていることに着目し、タンパク質のアミノ酸配列に基づいた種の判別がで

きるかどうかを試みた。

3. 方法

見た目だけでは判断が難しい様々な種類の海苔を、海苔にたんぱく質が多く含まれて

いることに着目して、タンパク質のアミノ酸配列の違いによって区別する。

<実験方法>

今回は４種類の海苔の判別を行った。実験は大きく以下の４つに分けられる。

① サンプル調製(タンパク質の抽出と還元アルキル化)

② ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)

③ ゲルスキャンによる解析とゲル内トリプシン消化

④ トフマスによる質量分析

<実験①>

・まず、採取した場所が違う海苔 A：(有明産の市販の寿司のり金扇)、B：(京都府袖志

整理番号 SG160015

活動番号 A-016

産経ヶ岬海苔)、C：(山口県産山口湾産のアマノリ)、D：(三重県二見浦にて採取された

アマノリ)の四種類を用意した(写真：1)。そして乾燥海苔を 10mg の超純水で膨潤させ、

生海苔 100mg を 1.5ml チューブに入れたところで還元アルキル化用 1xSDS サンプル

バッファーを１ml 加えた(写真：2)。それを超音波ホモジナイザーに入れ、超音波で海

苔の中に含まれる物質を分離し、タンパク質を抽出した(写真：3)。50μl の抽出液を新

しい 1.5‐ml チューブに入れ、キャップロックを付けて 95℃で 10 分間加熱処理し、

タンパク質を還元した。25μl の 7M アクリルアミドを添加し、アルミホイルで遮光下、

室温で 10 分間アルキル化（プロピオンアミド化）した。

(写真：1) (写真：2) (写真：3)

<実験②>

・まず、ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS‐PAGE）

を行うために、泳動槽に Mini‐Protean TGX precast gel(Any kD, 12‐well comb, Bio‐

Rad)をセットし、泳動バッファー(25mM トリス,192mM グリシン,0.1％SDS,pH8.3)

を注いだ(写真：1)。そして、Bio-Rad プレシジョン Plus プロテインプレステインドス

タンダードデュアルエクストラ(2～250kDa；5μL/lane)とサンプル(7.5μL/lane および

15μL/lane)をゲルの各ウェルに供し、200V 定電圧でブロモフェノールブルーのフロン

トマーカーがゲル下端付近の黒色ラインに到達するまでタンパク質を泳動した(写

真：2)。プラスチック板を除去せずゲルの写真撮影をした。そして、プラスチック板

を除去後、FluoroPhoreStar3000(Anatech,Tokyo,Japan)を用いた蛍光検出と撮影を行っ

た。(Blue+Green,５秒)。その後、ゲルを 50mL の超純水で 10分間、振盪洗浄を 3回繰

り返し、40mL の CBB G-250 による染色を室温で 1 時間半行った(写真：3)。最後に、

ゲルを 50mL の超純水で、10 分間の振盪洗浄を 3 回繰り返した後(写真：4)、ゲルス

キャンを行い、画像を取得した。

(写真：1) (写真：2) (写真：3)

(写真：4) ↑CBB検出 ↑蛍光検出

・実験②結果

実験１で取り出したタンパク質を電気泳動法によって分離した。分子サイズの違い

により、LSU (55kDa)、SSU (15kDa)、フィコビリタンパク質 (20kDa)を分離するこ

とができたことができた。

<実験③>

・まず、ゲルピッカー(φ1.8mm)を用いて、ゲルのバンドから切り出し、1.5-ml

チューブに入れた。その後、脱色液 (30％アセトニトリル in 25mM

NH4HCO3)200μL を加えて、10 分間振盪、脱色した。着色した脱色液を捨て、100μl

の 100％アセトニトリルを加えて 5～10 分振盪、脱色した(ゲルが小さく縮んで、

白く濁った)。アセトニトリルを取り除く。トリプシン溶液(プロテオミクスグレ

ード μg/ml in 10％アセトニトリル,25mM NH4HCO3)8μl を加えて、氷上で 20 分

放置した。そして、ゲルが吸収しなかった過剰のトリプシン溶液を、10μl チップ

を装着したピペットマンを用いて取り除いた。ビーカー(容量 300ml)に 200ml の

脱イオン水をいれ、その上にサンプルの入ったチューブを挿したチューブホルダ

ーを置き、37℃にセットした空気循環式恒温器中で一晩保温消化。した。ペプチ

ド溶解用溶媒(アセトニトリルと 0.1％TFA 溶液の 2：3 混合溶媒)10μl を加えて、

1 分間超音波処理(カップホーン、レベル 4)によりペプチドを抽出した。新しい

1.5ml チューブに抽出液 2μl を移し、ペプチド溶解用溶媒で 1/10 希釈した 2x

DHBA マトリックスを 2μl 加え、ピペッティングで混合した。

(写真：1) (写真：2) (写真：3)

ＬＳＵ

ＳＳＵ

フィコビリ

4. 結果

・トリプシンという酵素は、タンパク質の中のアミノ酸がリジン(K)とアルギニン(R)

のときにペプチドに分解することができる(トリプシン消化：下図)。このため質量分

析に適したサイズ(800～3500 Da)のペプチドを得やすい。トフマスを用いた精密な質

量分析を行う前(質量校正の前)に、トリプシン消化が適切になされているか(つまり、

ペプチドの断片化がうまくいっているか)をトフマスで確認した。その結果、良好な

消化がなされていることを確認できた。(質量校正前のスペクトルはここでは示さな

い。実験 4 の質量校正済みスペクトル参照。)

<実験④>

・質量スペクトルの解析によるアミノ酸配列の推定を行った。まず、新しい 1.5ml

チューブに抽出液 2μl を移し、ペプチド溶解用溶媒（アセトニトリルと 0.1％TFA溶

液の 2：3混合溶液）で、1/10に薄めた 2xDHBA マトリックスを、２μl 加え、ピペッ

ティングで混合した。そして、プレートを室温で完全に乾燥させ(写真：1,2)、

MALDI-QIT-TOFMS(AXIMAResonance,shimadzu)を用いて質量分析し、最後に MSスペクト

ルを取得し、スペクトルを比較した(写真：3,4)。

(写真：1,2) (写真：3,4)

↑レーザーを照射するときの様子

トリプシンペプチド断片

↑トフマスにより得られたデータ

↑質量スペクトル解析結果(トリプシン消化ペプチドの実測質量)と MS-Digest により

算出されたアミノ酸配列由来のトリプシン消化ペプチドの理論質量の照合

<トフマスについて>

① MALDI プレート上のサンプルにレーザーを照射しイオン化させる。このとき、機内

はほぼ真空なので、突然水分が蒸発して故障してしまうのを防ぐためプレート上のサ

ンプルは完全に乾かしておかなければならない(図：①)。

② 四重極を用いて計測対象のイオン以外のイオンを捨て計測対象のイオンのみを投射

する。プレートと接地グラウンド(Ground)の間には V0の電位差があるので、イオン

0

50

100

%Int.

800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

m/z

1[c].I13

2[c].I10

3[c].I7

4[c].I4

365 mV 298 mV 62 mV 136 mV

D1_0001, C1_0001, B1_0001, A1_0001

Shimadzu Biotech Axima Resonance 2.9.1.20100121

1388.93

1360.72

1077.74

1388.91

2196.15

1388.87

1360.80

1521.84

1433.981077.71

842.58

1187.66

2196.31

2001.01875.45

1049.67 1941.11 2196.20

875.51

2422.25

834.49

2001.12

1619.01

1714.07

1958.24

1707.91 2422.35

2422.37

2422.40

2807.60

3034.67 3430.97

2808.57

2719.57

3050.66

3431.13

3310.50

①LSU

A

B

C

D

スサビノリ(A) MR/LTQGTFSFLPDLTDEQI N K/QL A YIVSK/GLSANVEYTDDPHPR/

マルバアマノリ(D) MR/LTQGTFSFLPDLTDEQI S K/QL T YIVSK/GLSANVEYTDDPHPR/

NSYWELWGLPLFDVK/DASAVMYEISSCRK/AKPNYY V K/VNAFDNTR/GIESCVMSFIV

NSYWELWGLPLFDVK/DASAVMYEISSCRK/AKPNYY I K/VNAFDNTR/GIESCVMSFIV

NR/P A NEPGFLLQR/QDFEGR/TMKYSLHSYATEKPEGAR/Y

NR/P I NEPGFLLQR/QDFEGR/TMKYSLHSYATEKPEGAR/Y

0

50

100

%Int.

800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

m/z

1[c].I14

2[c].I11

3[c].I8

4[c].I5

66 mV 78 mV 81 mV 210 mV

D2_0001, C2_0001, B2_0001, A2_0001

Shimadzu Biotech Axima Resonance 2.9.1.20100121

1420.87

1829.10

1420.89

1606.95 2175.27

1829.15

1420.91

1829.20

815.49

1606.99

2422.37

1829.20

2175.33

1436.941868.18

1607.04 1868.18

2175.38

1157.63

815.53

815.52

1922.17

1922.10

2422.41

2422.43

1922.21

2197.26

2227.31 2454.49

2807.49

3178.87

2809.47

3180.84

3078.76 3348.90

3047.46

②フィコビ

リ

A

B

C

D

0

50

100

%Int.

800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

m/z

1[c].I15

2[c].I12

3[c].I9

4[c].I6

104 mV 225 mV 35 mV 228 mV

D3_0001, C3_0001, B3_0001, A3_0001

Shimadzu Biotech Axima Resonance 2.9.1.20100121

936.53

1708.961241.76

2167.27982.60 1724.09

2167.35

936.58

936.56

1867.19

2195.34

1419.84

1709.05

2140.35

1241.82

1475.93

2748.58

2167.32

2769.62

2807.582449.46

2527.43

3395.863108.75

2995.64 3298.78

③SSU

A

B

C

D

0

20

40

60

80

100

%Int.

800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400

m/z

1[c].I15

2[c].I6

104 mV 228 mV

X5

D3_0001, A3_0001

Shimadzu Biotech Axima Resonance 2.9.1.20100121

936.53

1708.96

1241.76

1867.09 2167.27982.60

1420.86

936.58

1867.19

1889.08

1709.05

2189.28

2140.35

2748.58

2790.80

2527.43 2995.64 3298.78

③SSU

A

D

は図の方向に引き出される。引き出し後の各イオン速度 vは、エネルギー保存の法則

より求められる。ここで電位差 V0は、どのイオンに対しても一定であるから、m/z

値が小さい（軽い）イオンほど高速でドリフト空間(Drift Space)を飛行し、検出器

(Detector) に到着する(図：②)。

③ 投射後の飛行時間によって質量を分析する。

注意点…機内は高真空で温度が 20～25℃以内でないと正常に作動しないため、１年を

通して管理しなければならない(図：③)。

↑トフマス ① ② ③

5. 考察・まとめ

抽出したルビスコの LSUでは、質量分析の際のスペクトルが、試料 A、B、C、Dで似て

いて、ノイズが多くきれいなデータが取れなかったことから、理論的には可能かもし

れないが、種判別には向いていないと判断した。

フィコビリタンパク質からは、質量分析の際のスペクトルが、試料 A、B、C、Dで似て

いることと、タンパク質のアミノ酸配列の解析がまだ進んでないことから、種判別に

適していないと思われた。

ルビスコの SSU では、試料 B では、様々な海苔が混ざった海苔だったため、種判別が

できなかった。試料 C では、アミノ酸配列の解析がまだ進んでないことから、種判別

ができなかった。試料 A,D では質量をきれいに計ることができたので、アミノ酸配列

と照らし合わせることにより、Aがスサビノリ、Dがマルバアマノリであるという事が

示唆され、種判別ができた。

6. 謝辞

今回の実験に関して丁寧にご指導してくださった長崎大学水産学部の山口健一先生、

長崎大学水産学部の皆さんに感謝申し上げます。