14_ expressao_e_purificacao_proteinas_recombinantes
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1
EXPRESSÃO E
PURIFICAÇÃO DE
PROTEÍNAS
RECOMBINANTES
Dra. Débora Colombi
GENÔMICA ↓↓↓↓
compreender a organização molecular do genoma seu conteúdo de informações e respectivos
produtos gênicos
↓↓↓↓ ↓↓↓↓
estrutural funcional↓↓↓↓ ↓↓↓↓
natureza física transcriptoma(proteoma))))
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2
PROTEOMA
CONJUNTO DE PROTEÍNAS EXPRESSAS
NUM DETERMINADO TECIDO OU ORGANISMO,
NUM DADO MOMENTO, NUMA DADA CONDIÇÃO
PROTEÍNAS
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3
Dogma Central da Biologia MolecularDogma Central da Biologia Molecular
DNA
RNA
Proteína
Replicação:OrigemForquilhaTelômeros
Reparo e Recombinação
Transcrição:PromotorEnhancers
Processamento:capcauda de poliAremoção de íntrons
Tradução:código genéticoiniciação e terminaçãoribossomo
Processamento:enovelamentopontes S-Sglicosilação
PROTEÍNAS
As proteínas são biopolímeros compostos
por resíduos de aminoácidos ligados entre
si por ligações peptídicas
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4
AMINOÁCIDO
TOTAL = 20 Aminoácidos
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5
Ligação Peptídica
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6
ESTRUTURA
Estrutura Primária
A estrutura primária é caracterizada pela
sequência de aminoácidos e ligações peptídicas
da molécula; é o nível estrutural mais simples.
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PRIMÁRIA1 M V A A G K S D L S L P K T F A C S A F
1 ATGGTGGCGGCTGGTAAATCCGACCTTTCCTTGCCCAAAACTTTCGCCTGCAGTGCCTTC
21 A A C V G E V C T I P L D T A K V R L Q
61 GCTGCTTGCGTCGGCGAGGTATGCACAATTCCATTGGACACTGCTAAAGTTAGGCTTCAG
41 L Q K S A L A G D V T L P K Y R G L L G
121 CTCCAAAAGTCTGCTCTTGCTGGTGATGTTACTCTGCCTAAATATCGAGGATTGTTGGGA
61 T V G T I A R E E G L R S L W K G V V P
181 ACTGTTGGTACCATAGCAAGGGAAGAAGGGTTACGTTCACTATGGAAAGGTGTTGTACCT
81 G L H R Q C L F G G L R I G M Y E P V K
241 GGATTGCATCGTCAATGCCTATTTGGAGGTCTTAGGATTGGAATGTATGAGCCGGTGAAA
101 N L Y V G K D F V G D V P L S K K I L A
301 AACTTGTATGTTGGAAAAGACTTTGTAGGTGATGTTCCATTGAGCAAGAAAATTCTTGCT
121 G L T T G A L G I M V A N P T D L V K V
361 GGTTTGACAACAGGTGCACTGGGTATCATGGTAGCAAATCCCACTGATCTTGTGAAAGTT
141 R L Q A E G K L A A G A P R R Y S G A L
421 AGGCTTCAGGCGGAAGGAAAATTAGCTGCAGGTGCGCCAAGACGGTACTCTGGAGCGCTG
First (5')Second
Third (3') U C A G
U
PhePheLeuLeu
SerSerSerSer
TyrTyrTer*Ter*
CysCysTer*Trp
U
C
AG
C
LeuLeuLeuLeu
ProProProPro
HisHisGlnGln
ArgArgArgArg
U
C
AG
A
IleIleIlefMet
ThrThrThrThr
AsnAsnLysLys
SerSerArgArg
U
CA
G
G
ValValValVal**
AlaAlaAlaAla
AspAspGluGlu
GlyGlyGlyGly
U
C
A
G
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Amino acid 3 letter abbreviations
1 letter abbreviations
MW,Daltons
Alanine Ala A 89.1
Arginine Arg R 174.2 Asparagine
Asn N 132.1
Aspartic Acid Asp D 133.1
Asparagine or Aspartic Acid
Asx B -
Cysteine Cys C 121.2
Glutamic Acid Glu E 147.1
Glutamine Gln Q 146.1
Glutamine or Glutamic Acid
Glx Z -
Glycine Gly G 75.1
Histidine His H 155.2
Isoleucine Ile I 131.2
Leucine Leu L 131.2
Lysine Lys K 146.2
Methionine Met M 149.2
Phenylalanine Phe F 165.2
Proline Pro P 115.1
Serine Ser S 105.1
Threonine Thr T 119.1
Tryptophan Trp W 204.2
Tyrosine Tyr Y 181.2
Valine Val V 117.1
Estrutura Secundária
A estrutura secundária é caracterizada pelo
estabelecimento de ligações de hidrogênio entre os
átomos dos aminoácidos de uma cadeia protéica.
Ex: α-hélice (mesma cadeia)
e folha-β ou pregueada (outra cadeia).
O grupo radical não participa !
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Os átomos envolvidos na ligação peptídica se-encontram no mesmo plano: w=180o (trans) ou 0o (cis)
Os ângulos f (phi) e y (psi) tem “livre” rotação
Estrutura Terciária
A estrutura terciária é a organização “global” de uma
única cadeia polipeptídica; o principal fator que determina
a estrutura terciária numa proteína globular é o efeito
hidrofóbico, ou seja, as cadeias laterais dos aminoácidos
não polares ficam como que “escondidas” dentro da
estrutura e as cadeias laterais dos resíduos polares ficam
expostos à superfície.
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Estrutura de mioglobina de baleia, uma proteína globular típica
Estrutura Quaternária
A estrutura quaternária é caracterizada pela associação
de duas ou mais cadeias polipeptídicas numa estrutura
com várias subunidades, resultando numa unidade ativa.
Este tipo de estrutura é estabilizada por ligações de
hidrogênio, forças de Van der Walls ou ligações iônicas.
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Estrutura Quaternária de Proteínas
Estrutura Quaternária de Proteínas
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EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS
• 1. BACTÉRIAS (E.coli)
• 2. LEVEDURA (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris)
• 3. CULTURA DE CÉLULAS
• 4. PLANTAS (Tabaco, milho, etc...)
Escolha do Sistema de Expressão
Escolha do Vetor de Expressão
• Características necessárias:• POLYLINKER
• ORIGEM DE REPLICAÇÃO
• GENE DE RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICO
• PROMOTOR
• SINAL DE INÍCIO DE TRADUÇÃO (ATG)
• SINAL DE TERMINAÇÃO
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Prós e Contras do uso de BactériasVantagens:Facilidade no crescimento e purificaçãoPossibilidade de uso de várias cepas e plasmídeos comerciaisAlta produção (normalmente 500 mg/l de cultura)Comparativamente baratoSistemas de expressão bem conhecidosTecnologia relativamente simples
Prós e Contras do uso de BactériasVantagens:Facilidade no crescimento e purificaçãoPossibilidade de uso de várias cepas e plasmídeos comerciaisAlta produção (normalmente 500 mg/l de cultura)Comparativamente baratoSistemas de expressão bem conhecidosTecnologia relativamente simples
Desvantagens:Não há modificações pós-traducionais (glicosilação,ribosilação, acetilação, co-fatores etc.)Tamanho do cDNA limitadoCodon usage diferente
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Prós e Contras do Uso de Leveduras
• Ex: Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris
• Vantagens:
• Algumas modificações pós-tradução• Possui mitocôndria
• Desvantagens:
• Maior custo e mais trabalhoso• Possui proteases• Modificações não desejáveis
Prós e Contras do Uso de Células de Mamíferos
• Vantagens:• Muitas vezes a biologia celular é a mesma da proteína em
questão (localização, função, etc...)• Há sistemas de modificação pós-traducionais• Os sistemas estão cada vez mais eficientes
• Desvantagens:• Baixa produção• Sistemas caros e trabalhosos• Vetores
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Ex: BACTÉRIAGENE DE RESISTÊNCIA(Ampicilina / Kanamicina)
Origem de replicação(ori)
Promotor(LacZ e T7)
Polylinker(sítios únicos de clonagem)
Escolha do Vetor de Expressão
MCS (multi-cloning site)
• Polylinker – É necessário clonar o fragmento na mesma fase de leitura doplasmídeo
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MCS (multi-cloning site)
Já existe vetores com as 3 fases de leitura
Opções de Proteínas de Fusão
• Maltose binding protein (MBP)
• HIS-Tags (cauda de histidina)
• Glutathione S transferase
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Purificação das Proteínas Expressas
Cromatografia de Afinidade
Purificação das Proteínas Expressas
• HIS-Tags – Coluna de níquel
• Maltose binding protein – Coluna de amilose
• Glutathione S transferase – Coluna de glutationa
Cromatografia de Afinidade
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Vetor pMALNew England Biolabs
Maltose Binding Protein (MBP)
Vetor pMALNew England Biolabs
MBP
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Vetor pMALNew England Biolabs
Maltose Binding Protein (MBP)
pETNovagen
HIS-tag
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HIS-tag
HIS-tag
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HIS-tag
HIS-tag
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Tipos de cepas de E. coli utilizadas para expressão
• BL21 – perdeu naturalmente a protease lon e foi
codificado para ser deficiente para a protease OmpT
INDUZIDA POR BACTERIÓFAGO LAMBDA
Tipos de cepas de E. coli utilizadas para expressão
• BL21 – perdeu naturalmente a protease lon e foi codificado para ser
deficiente para a protease OmpT
INDUZIDA POR BACTERIÓFAGO LAMBDA
• BL21(DE3) – foi modificada para carregar o gene da T7RNA
polimerase sob o controle do promotor LacUV = carrega o lisogene
lambda DE3
INDUZIDA POR IPTG
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BL21(DE3)
Tipos de cepas de E. coli utilizadas para expressão
• BL21 – perdeu naturalmente a protease lon e foi codificado para ser
deficiente para a protease OmpT
INDUZIDA POR BACTERIÓFAGO LAMBDA
• BL21(DE3) – foi modificada para carregar o gene da T7RNA
polimerase sob o controle do promotor LacUV = carrega o lisogene
lambda DE3
INDUZIDA POR IPTG
• BL21(SI) – contém o gene da T7RNA polimerase integrado em seu
genoma sob o controle do promotor proU, que é induzida quando a
célula é submetida a uma alta osmoralidade
INDUZIDA POR SAL (NaCl)
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Tipos de cepas de E. coli utilizadas para expressão
• SUBTIPOS DA BL21(DE3)
• BL21(DE3) pLysS ou E – produz lisozima T7
• BL21(DE3) Star
• BL21(DE3) Codon-Plus ou Rosette – codon usage
• BL21(DE3) trxB ou gor – para proteínas com
muitas pontes dissulfeto
Tipos de cepas de E. coli utilizadas para expressão
• SUBTIPOS DA BL21(DE3)
• BL21(DE3) pLysS ou E – produz lisozima T7
Carrega o plasmídeo pLysS ou pLysE, que expressa constitutivamente pequenos níveis de lisozima T7, que por sua vez inibe os níveis basais da T7 RNA polimerase
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Tipos de cepas de E. coli utilizadas para expressão
Tipos de cepas de E. coli utilizadas para expressão
• SUBTIPOS DA BL21(DE3)
• BL21(DE3) Star
Contém uma mutação no gene rne, que codifica para a RNAseE, aumentando a estabilidade do mRNA.
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Tipos de cepas de E. coli utilizadas para expressão
• SUBTIPOS DA BL21(DE3)
• BL21(DE3) Codon-Plus ou Rosette – codon usage
Possui cópias extras de genes tRNAs, que são raros em E. coli, mas frequentemente usados em outros organismos.
Ex: RIL - organismos ricos em AT Arg (AGA/AGG), Ile (AUA) e Leu (CUA)
RP - organismos ricos em CGArg (AGA/AGG) e Pro (CCC)