(19) 한민 특허청(KR)

(12) 등 특허공보(B1)

(45) 공고 2012 06월26

(11) 등 10-1160095(24) 등 2012 06월20

(51) 특허 (Int. Cl.)

C12N 15/82 (2006.01) A01H 1/00 (2006.01)

C12N 15/29 (2006.01) C07K 19/00 (2006.01)(21) 원 10-2009-0125389

(22) 원 2009 12월16

심사청 2009 12월16

(65) 공개 10-2011-0068431

(43) 공개 2011 06월22

(56) 행 사 헌

US20030165543 A1

KR1020040087094 A

KR1020070007582 A

US20030204864 A1

(73) 특허

경 도

경 도 원시 달 원 1 (매산 3가)

(72)

경 도 시 진안동 935 지 월드 앙APT104-807

한

경 도 원시 달 지 314 73 (지동)

(뒷 에 계 )

(74) 리

신 건, 경

체 청 항 : 7 항 심사 :

(54) 사병 신 하는 질 벼 그 생산

(57) 약

본 사병 신 하는 질 벼 그 생산 에 한 것 , 욱 상 하게는

사병 주 원 균 라균과 균 래 재 합 에 해 벼에 삽

하여 는 질 벼 생산 , 상 얻어지는 질 벼, 상 질 벼 얻

어지는 사병 신 한 합단 질 그 득 에 한 것 다.

본 에 , 사병 신 하는 질 벼 생산하여 식 사료 가 에

게 공함 산산업에 항생 질 사 하게 감 시 가 산 비 는 경

과 얻 다.

러한 항생 질 사 량 감 는 경 과 에 비 건강에도 여할 다.

도 - 도4

등록특허 10-1160095

- 1 -

(72)

지

울특별시 악 7 16, 302동 1004( 천동, 낙 타운)

재욱

경 도 원시 31, 신안 303동1002 ( 동, 림아 트)

경열

경 도 시 우동 55 지 동탄 당마 슬아 트 145동 1803

경 도 원시 통 청 33, 삼 미안433동 1204 ( 통동)

경 도 원시 매실 70, LG삼 아 트113동 605 ( 매실동)

양 식

라 도 주시 진 내 120, 4차아트 402동 504 ( 천동1가)

경 도 원시 매실 70, LG삼 아 트107동 1803 ( 매실동)

한

경 도 원시 달 양 50 30, 벽산블루APT 121동 404 ( 동)

등록특허 10-1160095

- 2 -

특허청

청 항 1

1) 열 1 시 는 Vibrio cholerae 독 B 브 니트 , 열 2 시 는

Escherichia coli 독 B 브 니트 bar pMJ103 에 삽 하여 재 합

하는 단계;

2) 상 pMJ103 재 합 아그 리움에 삽 하여 질 균주 얻는 단계;

3) 러 도 벼 에 상 단계 2)에 얻어진 질 아그 리움 하여 공동 양하는

단계;

4) 상 단계 3) 생 러 별하여 2차 양한 후, 2차 양 러 별하는 단계;

5) 별 2차 양 러 양하여 재 식 체 MS0 지에 근시키는 단계;

6) 상 단계 5)에 얻어진 근 식 체 시 양에 앙하여 벼 질 체 하는 단계 포

함하는 것 특징 하는 사병 신 하는 질 벼 생산 .

청 항 2

1항에 생산 는 사병 신 하는 질 벼.

청 항 3

2항에 벼에 는 합단 질.

청 항 4

3항에 어 , 상 합단 질 사병 신 가지는 것 합단 질.

청 항 5

3항 또는 4항에 어 , 상 합단 질 가 사병 신 가지는 것 합단 질.

청 항 6

5항에 어 , 상 합단 질 돼지 또는 사병 신 가지는 것 합단 질.

청 항 7

3항에 합단 질 하는 사병 신 .

상 한

야

본 사병 신 하는 질 벼 그 생산 에 한 것 , 욱 상 하게[0001]

는 사병 주 원 균 라균과 균 래 재 합 에 해 벼에

삽 하여 는 질 벼 생산 , 상 얻어지는 질 벼, 상 질 벼

얻어지는 사병 신 한 합단 질 그 득 에 한 것 다.

경

(Vaccination)에 사 는 질 신 라 하 , 근에는 열에 안 하고 경 여가 가능할 뿐만[0002]

아니라 보다 하게 보 는 신 개 연 가 진행 고 다.

재 신 개 시 가지고 는 가지 고가 생산 비, 과 시에 하는 냉[0003]

등록특허 10-1160095

- 3 -

비 경 담 신 여 어 움, 주사 맞는 것에 한 사람들 보편 거 감 등 다.

라 , 상 같 해결하고, 택 거 누리지 못하고 는 개 어린

해 라도 체 신 개 고 는 것 계 다.

러한 체 신 개 연 에 질 통한 경 식 신 그 가능 아 신개[0004]

새 운 향 리 매 하고 다. 경 식 신 재 합 신 안 과 경 신 에 어

월 과 시킨 항원 식 체 , 식 체에 질 시

식 취하듯 경 여 시행함 역 도하게 다.

신 에 라 여러 가지 태 할 는 , 병원체에 항원 하는[0005]

만 하여 균 나 , 식 에 생산하는 재 합 신 가 진보 태 신

간주 고 다( 1999).

식 신에 한 연 에 해 담 에 B 간염 러 신 (Mason 등 1992, Thanavala 등 1995), 감[0006]

담 에 균 사병 신 (Haq 등 1995), 러 사병 신(Mason 등 1998) 등 생산하 다.

본 들 사 병에 주 원 균 라균 Vibrio cholerae (CTB) 내독 가진 균[0007]

(ETEC, enterotoxigenic E. coli ) 독 없 역 도가 가능한 B 브 니트(subunit)

라독 (CTB) 균 열 가변 내독 B 브 니트(LTB) 과 (over expression)하는

pMJ103 에 삽 시 벼 질 하여 사병 신 합단 질 할 는 질 벼 생

산하 해 본 행하 다.

내

해결 하고 하는 과

본 사병 주 원 균 라균과 균 역 도가 가능한 [0008]

재 합 벼에 질 시 는 사병 신 하는 질 벼 생

산 공하는 것 다.

또한, 본 상 생산 는 사병 신 하는 질 벼 공하는[0009]

것 다.

본 다 상 한 질 벼 는 사병 신 는 합단 질 공하는[0010]

것 다.

본 또다 상 한 합단 질 하는 사병 신 공하는 것 다. [0011]

과 해결 단

하, 본 상 하 다 과 같다.[0012]

본 [0013]

1) 열 1 시 는 Vibrio cholerae 독 B 브 니트 , 열 2 시 는[0014]

Escherichia coli 독 B 브 니트 bar pMJ103 에 삽 하여 재 합

하는 단계;

2) 상 pMJ103 재 합 아그 리움에 삽 하여 질 균주 얻는 단계;[0015]

3) 러 도 벼 에 상 단계 2)에 얻어진 질 아그 리움 하여 공동 양하는[0016]

단계;

4) 상 단계 3) 생 러 별하여 2차 양한 후, 2차 양 러 별하는 단계;[0017]

5) 별 2차 양 러 양하여 재 식 체 MS0 지에 근시키는 단계;[0018]

6) 상 단계 5)에 얻어진 근 식 체 시 양에 앙하여 벼 질 체 하는 단계 포[0019]

함하는 것 특징 하는 사병 신 하는 질 벼 생산 것 다.

등록특허 10-1160095

- 4 -

하, 본 욱 상 하 다 과 같다.[0020]

본 에 어 는, 사병 원 균 라균과 균 독 B 브 니트 CTB(Kang 등 2004a)[0021]

LTB(Kang 등 2004b) 학 에 양 았 들 가 삽 질 리

에는 CaMV 35S 프 , Nos 미 nptⅡ 가 는 pMY Glb 프 , pinⅡ 미

bar 가 는 pMJ103 하 다. 본 에 가능한 는, 람직하 는 pMJ103

다.

도 2는 열 1 시 는 CTB 열 2 시 는 LTB 포함하는 본 에 [0022]

질 벼 하 한 리 pMJ103 나타낸 것 다.

리 pMJ103에 상 한 CTB LTB 가 삽 것 PCR 검 하 다.[0023]

본 에 는 식 질 체 하는 아그 리움 시엔 (Agrobacterim tumefaciens)[0024]

하 다. 식 질 체 하는 주 는 아그 리움 시엔 는 Ti 플라 미드

(tumor-inducing plasmid) 가지고 다. Ti 플라 미드 에 아그 리아가 식 에 감염

crown gall 라고 하는 (tumor)가 생하게 다. Ti 플라 미드 살펴보 , T-

DNA라는 가 , 는 식 게 DNA에 동 재 합(homologous recombination)에 해

끼어들어가는 다. 라 에 식 에 도 하고 하는 고, Ti 플라 미드 아그

리아에 삽 하여 아그 리아 식 러 에 감염시 키우 진 식 만들어진다.

본 에 어 ‘ 내 양’ 란 균 상태 양 건 갖 어진 양 내에 식 양하는 것[0025]

미한다.

CTB LTB 포함하는 pMJ103 삽 아그 리아에 해 벼 러 감염시[0026]

질 벼 도, 별하 , 별 질 벼에 하여 블럿(Southern Blot) 실시한 결과,

벼 게 내에 도 LTB CTB 삽 상태 하 다.

또한, T-DNA 주변 염 열 (Flanking Region Analysis) 결과 LTB CTB 가 벼 염[0027]

색체 특 에 삽 었 하 다.

게 질 벼 아 가 87.5% 비하여 62.0% 아 나타내었 나, [0028]

80% 상 아 나타내어 질 도 벼 비 상 생산량 보할 다.

역 트립(Immuno Strip) 처리 격리 실 내에 앙 재 후 타 처리에 한 생 검 통하여[0029]

본 에 사병 신 하는 질 벼가 질 체 고 었 하 다.

본 에 든 질 계통에 한 GM1 강 리 사 드(ganglioside) 결과, 든 질 계통[0030]

사병에 한 신 역할 하는 pentamer 가지는 신 나타났다. 라 본

생산 는 사병 신 하는 질 벼 사병 신 합단 질 생산할

, 본 에 라 질 벼는 그 체 또는 합단 질 하여 신 사 할

다.

또한, 본 상 한 질 벼 함 하는 경 사병 신 사 [0031]

다.

본 는 질 벼 또는 합단 질 포함하는 사병 신 또는 신 [0032]

그 여 상에 한 없 나, 람직하 는 가 , 욱 람직하 는 돼지, , 돈, 또는 아지에게

여 다.

상 신 본 에 질 벼 그 사 하거나 건 시킨 후 말 태 사 할 [0033]

, 또한 다 식 또는 식 과 함께 통상 에 라 하게 사 다.

질 벼 합량 사 에 라 당하게 결 다.

과

사병 신 하는 질 벼 생산하는 본 에 안 한 에 해 [0034]

사병 신 단 질 얻 다.

본 에 , 사병 신 하는 질 벼 생산하여 식 사료 가 에[0035]

등록특허 10-1160095

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게 공함 산산업에 항생 질 사 하게 감 시 가 산 비 는 경

과 얻 다.

러한 항생 질 사 량 감 는 경 과 에 비 건강에도 여할 다.[0036]

실시 한 체 내

하, 본 실시 에 하여 욱 상 하 다 과 같다.[0037]

실시 1 질 [0038]

식 질 에 하 하여 CTB LTB 는 pMJ103 HB101 같 헬 플라 미드[0039]

함께 트리 런탈 (tri parental mating) 아그 리움에 들 함께 재 합시 다.

pMJ103 에 삽 균주 니는 트 마 신 100mg L-1

첨가 액체 YEP 지 3 ml에 하여 28℃[0040]

에 250rpm 2 간 진탕 양하여 식하 플라 미드 DNA 키트(AccuPrep, 니아)

하여 플라 미드 DNA 하 다.

프라 는 LTB 292bp 각, CTB 298bp 각, bar 302bp DNA 각 한 후 공[0041]

합 하 다.

96 ℃에 10 동안 변 처리하고, 변 96℃ 30 , 프라 합 54℃ 30 , 프라 72℃[0042]

2 , 35 등 과 같 PCR 프 그램 시킨 후 1% 아가 에 한 동에 해 아그 리움

에 삽 었는지 하 다.

도 3 pMJ103 아그 리움에 시킨 후 LTB CTB 한 PCR 동[0043]

사진 다. 도 3에 아그 리움에 LTB CTB 할 다.

실시 2 벼 질 질 체 내 [0044]

2-1) 러 도[0045]

미벼 양벼 상태가 양 한 것만 별하 다. 별 50 ml 브에 고[0046]

100% 에탄 에 30 간 진탕하 다. 진탕 하여 1/2 락 에 40 간 진탕한 후, 균 3 상 10

동안 척하여 (3M사 ) 에 가 마 지 건 시 다.

2N6 지에 (씨눈) 향하게 플 트 당 10 내지 13개 상한 후 27 ℃에 3 내지 4주간 암 양하[0047]

다. 3주가 1 내지 2 mm 크 고 갈변 지 않 , 연 랑색 또는 아 보리색 띠는

지는 것들만 하여 2N6 지에 다시 3 간 식 양하 다.

2-2) 공동 양[0048]

아그 리움 AB-SpT 지에 하여 28℃에 4 내지 5 동안 암 양하 다. 상 아그 리움 균[0049]

주 AAM 지에 운 후 50ml 브에 다 660nm O.D.값 1.5 내지 2.0 게 하 다.

러 브에 당 담고 20 내지 30 간 하 다. 후에 액 라내고 에 살짝

건 한 다 , 건 러 1/2 2N6-AS 지에 상하고, 러 에 균 3M 여과지 어주었다.

여과지 상태 26.5 ℃에 1 , 23.5 ℃에 4 내지 8 간 상 러 공동 양하 다.

2-3) 질 러 [0050]

5 상 양 러 균 시험 에 담고 균 척해 폭탁심 (Cefotaxime) 250 ug 첨가한[0051]

균 50 ml 10 상 척하 다. 거 에 살포하여 건 한 후, 2N6-CP 지에 겨 27 ℃

암 건에 3주간 양하 다. 살아남 러 2N6-CP 지에 동 건 2주 동안 양하여 2차

하 다.

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2-4) 질 러 재 식 체 도 근[0052]

2차 러 는 MSR-CP 지에 상후 25 ℃에 양하고, 재 식 체는 MS0 지에 겨 근시[0053]

다.

2-5) 질 식 체 실재[0054]

상 2-4에 얻어진 근 식 체 1,000 hyponex 액에 7 내지 10 간 지 하고, 14 간 지 [0055]

한 식 체 60 × 40 cm 닥 막 상 안에 는 32공 트 에 식하여 실에 리하여 앙

후 14 시비 재 하 다.

상 한 벼 러 도(1) 식(2), 질 러 재 (3) 그리고 질 체 계 양(4) 도[0056]

4에 나타내었다.

실시 3 PCR에 한 질 체 검[0057]

K3030( 니아) 키트 하여 식 체 DNA 하 다.[0058]

상 실시 2에 재 벼 gDNA 20 pM 4 ul 균 4 ul, 프라 4 ul, 안티 프라 4[0059]

ul Toptaq PCR premix ( 아 )에 첨가한 후 합하여 PCR 행하 다.

PCR 변 처리 96 ℃에 10 , 변 96 ℃에 30 , 프라 어닐링(annealing) 54[0060]

℃에 30 , 프라 연 72 ℃에 2 동안 35 시키고, 72 ℃에 15 시킨 후

마쳤다.

얻어진 PCR 1% 아가 에 한 동 하고 그 결과 도 5에 나타내었다.[0061]

도 5에 보 는 같 , 질 pMJ103 래한 LTB CTB 가 질 벼[0062]

T01 내지 T25에 었다.

실시 4 블 에 한 질 체 DNA 검[0063]

4-1) 한 에 한 게 DNA 단[0064]

하고 하는 벼 게 DNA 10 ug과 액 합하여 18 ul 하여 4 ℃에 2시[0065]

간 도 하 다. 한 (ug/20unit) 가하고 심 럽게 합하여 37 ℃에 12시간 동안 보 한 후,

액 1 ul 1% 동 하 다.

4-2) 블 한 동[0066]

겔 3차 균 , 70% 에탄 , 3차 균 척한 후, 한 단 게 DNA 시료 0.8%[0067]

(0.64g/80ml) 아가 겔에 하 다. 50mA (30V) 압 12시간동안 하 다.

4-3) 겔 [0068]

1×TAE 액 4 ℃ 냉 보 하고, fiber pad, 여과지, 겔, 브 상 액에 15 에 1시간[0069]

동안 지하 다. 동 끝난 겔 심 럽게 리 에 고, 겔 아래쪽 리 단하여

향 하여 변 액에 45 간 하 다.

겔 플라 틱 통에 겨 균 에 5 간 척하고 액에 30 간 한 후, 액[0070]

체한 후 다시 15 동안 하 다.

Trans-Blot (Bio-Rad사 ) 겔 겨 트 그고 트랜 액(1×TAE) 탱크 가득[0071]

채운 후, super cooling coil과 후 에 고 15 V, 0.2 A에 12시간

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시 다.

다 날 (transfer-blot) 해체하여 겔과 브 집 후 컴(comb)과 브 에 연필 [0072]

시하고 10X SSC 5 간 척하 다. 브 30 동안 압착 건 하 다.

UV 크 링커(XL-1000)에 브 DNA 착 하여 후 DNA 고 시키고, 브[0073]

하 브리다 에 사 하 다.

4-4) 지 프 브 DNA [0074]

삽 특 프라 PCR한 후 키트에 리하여 동 량 실시하 다.[0075]

프 브 DNA 2 ul, TE(8.0) 액 43 u 100 ℃에 5 간 끓 후 얼 에 5 간 한 다 , 프 브[0076]

DNA Primer labeling kit 액 (Amersham RPN 1633)에 합하고, P32

사 동 원 5 ul 액

합 에 첨가하여 합한 후, 다시 았다. 액 37 ℃에 30 동안 시킨 후 얼 에

보 하 다.

해 컬럼 (illustra ProbeQuant G-50 MicroColumn) 비하여 1.5 ml 미 브에 컬럼[0077]

삽 하고 동 원 지 DNA 첨가하 다. 3,000 rpm에 30 간 원심 리한 후 컬럼 거하고,

상 동 원 지 DNA 액 100 ℃에 5 간 하고 얼 에 5 간 한 후 하 브리다

실시하 다.

4-5) 프리하 브리다 (pre-hybridization) 하 브리다[0078]

100 ug/ml 연어 DNA 100 ℃에 5 간 끓 후 다시 얼 에 5 간 보 하여 프리하 브리다[0079]

액 하 다. 사각 에탄 과 3차 균 척하여 여 에 프리하 브리다 액 50

ml 첨가하 다. Hybond-N+

브 액에 지하여 65 ℃에 40 rpm 진탕 큐 2시

간 동안 시키고, 2시간 후 프리하 브리다 액 거하 다.

지 단 가닥 프 브 DNA 하 브리다 액 50 ml에 첨가하고, 프리하 브리다 브[0080]

프 브가 첨가 하 브리다 액에 하여 65 ℃에 40 rpm 진탕 큐 에 16

시간 상 시 다.

4-6) 검[0081]

하 브리다 액 리고 1차 척 액 5 간 5 도 척하고, 2차 척 액 [0082]

척 후 상 에 15 간 40 rpm 척, 3차 척 액 척 후 37 ℃에 30 간 40 rpm 척, 3

차 척 액 2 척 후 68℃에 30 간 40rpm 척, 4차 척 액 척하 다.

브 여과지(3MM)에 린 후 눌러 건 시키고, X-ray 필 트 연 후 2 균비닐 고[0083]

비닐 사 에 브 고 후 고 시 다.

상 X- 필 트에 착한 후 -70 ℃에 5 후 상하여, 그 결과 도 6에 나타내었다. [0084]

실시 5 RT-PCR에 한 질 체 mRNA 검[0085]

5-1) 체 RNA 리 : easy-spinTM

(Intron 17221)[0086]

20 내지 50 mg 마쇄한 후, 포 액 1 ml 고 강하게 10 동안 하고, 클 포 200[0087]

ul 첨가하여 13,000 rpm, 4℃에 10 간 원심 리하 다. 상등액 400 ul 새 운 1.5 ml 브에 겨

결합 액 400 ul 드럽게 2 내지 3 에 나누어 합하여 상 에 1 간 하 다.

컬럼에 상 액 하여 13,000 rpm에 30 간 원심 리한 후 액 보내고, 척 액 A[0088]

700 ul 고 13,000 rpm에 30 간 원심 리 후 액 다. 여 에 척 액 B 700 ul 고

등록특허 10-1160095

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13,000 rpm에 30 간 원심 리 후 액 다.

13,000 rpm에 1 내지 2 간 원심 리한 후 액 50 ul 고 상 에 1 간 하고 13,000 rpm[0089]

에 1 간 원심 리하 다.

5-2) RT-PCR [0090]

프라 는 LTB 292bp 각 한 후 공 합 하 다. [0091]

식 체 체 RNA 20 pM 4 ul 균 4 ul, 프라 4 ul, anti-sense primer 4 ul Toptaq[0092]

RT-PCR premix ( 아 )에 첨가한 후 하여 RT-PCR 행하 다. RT-PCR 50 ℃에 1 시간

동안 역 사 시킨 후, 변 처리 94 ℃에 5 , 변 94 ℃에 30 , 프라 합 55

℃에 30 , 프라 72 ℃에 1 하고, 30 시킨 후 72 ℃에 7 가 한 후

마쳤다.

PCR 1% 아가 에 한 동 하고, 그 결과 도 8에 나타내었다.[0093]

실시 6 트립 (Strip bar)에 한 질 체 단 질 검[0094]

질 벼 나 SEB4 시료 ( 산 )에 고 쇄하여 30 동안 상 에 보 하[0095]

다.

시료 미 브에 후, 트립 키트 상단 고 미 브에 직 담가 3 내지 5[0096]

경과 후 결과 하 다.

그 결과, 도 9에 보 는 같 한 든 T1 질 체가 PAT 단 질 하여 [0097]

항 나타내었다.

실시 7 처리에 한 질 체 [0098]

1L에 포탁 0.5 ml 한 후 벼 24시간 한 후 건 척하 다. 100 ml에[0099]

25 ℃에 2 내지 3 간 지하고 하루에 1 씩 하 다. 거 트리 에 상 한 벼

고 30 내지 33 ℃에 2 내지 3 동안 다습하게 하여 아시 다. 싹 나 건 내어 라포

트에 12cm 도 채운 후 식하 다.

식 후 20 과 27 에 Basta 0.3%(3mL/L) 2 살포하여 3 에 10 사 고사 사하 다.[0100]

실시 8 플랭킹 역 (Flanking region analysis)에 한 질 체 검[0101]

질 식 gDNA (2ug/20ul) 특 한 (HaeIII) 단하고, 어 하여 진 DNA[0102]

각 라 게 (ligation)하 다.

어 A1 프라 T-DNA 쪽 보 (RB1) 프라 트 A2 프라 쪽 보 (RB2) 프라[0103]

사 하여 PCR 폭 실시하고, PCR 산 에 하여 쪽 보 (RB2) 프라 사 하여 2차 PCR

행한 후 직 염 열 (Direct sequencing, GG ) 실시하 다.

시퀀싱 결과 하여 삽 열 하 다.[0104]

계통[0105] 삽

염색체

삽 삽

계통 삽

염색체

삽 삽

- - - T13 5, 9 2 -

T01 3, 5 2 - T14 2 -

T02 3 플라 미드 T15 2 플라 미드

T03 8 1 트 T16 2 -

T04 7 2 상 - T17 3 1 트

T05 3 1 엑 T18 1 1 트

등록특허 10-1160095

- 9 -

T06 3 1 트 T19 미검 플라 미드

T07 6 1 사 T20 미검 -

T08 3, 9 2 - T21 5 플라 미드

T09 1 - T22 5 -

T10 2 1 B T23 2 -

T11 12 1 B T24 1 상 -

T12 미검 - T25 8 1 플라 미드

실시 9 GM1-강 리 사 드(ganglioside) ELISA에 한 질 체 신 단 질 검[0106]

9-1) GM1-강 리 사 드 [0107]

GM1-강 리 사 드(860065P) 3 ul/ml ( 탁 1 mg/ml) 보 트 액( 산과학) 15 ml에 해하[0108]

다. 상 액 4 ℃ 냉 고에 16시간 동안 한 후, PBST 액 3 벽하게 척하 다.

9-2) 블 킹[0109]

4% 지 거 건 크 200 ul 웰에 하여 GM1 결합 지 않 곳 블 킹하 다. 37 ℃ 큐[0110]

에 2시간 동안 시킨 후, PBST 액 3 척하 다.

9-3) 시료 [0111]

균 LTB 0.2?12.8 ng과 신 벼에 한 단 질(100 μg) IdSEB 액 100 ul에 해[0112]

하여 96 웰 플 트에 하 다.

※ IdSEB 액 : 1.6 ml 6.25 × PVP40 + 8.6 ㎖ 보 트 액 ( 산과학)[0113]

상 액 4 ℃ 냉 고에 16시간 동안 한 후, PBST 액 3 벽하게 척하 다.[0114]

9-4) 1차 항체 (Anti-Rabbit LTB, 1/5,000, Abcam) 첨가[0115]

보 트 액 ( 산과학)에 1차 항체 첨가(2ul/10ml)하 다. 37 ℃ 큐 에 2시간 동[0116]

안 시킨 후, PBST 액 200 ul 3 복하여 벽하게 척하 다.

9-5) 2차 항체 (Goat Anti Rabbit IgG-AP, 1/1,000, SantaCruz) 질 첨가[0117]

ECI 액 ( 산과학)에 2차 항체 첨가하여 (1 ul/ml), 37 ℃ 큐 에 2시간 동안 시 다.[0118]

PBST 액 200 ul 3 벽하게 척하고, PNP 질 액 첨가(1개 PNP/5ml)한 다 , 37 ℃

큐 에 30 에 1시간 동안 시 다.

ELISA 검 하여 405 nm에 도 하 다.[0119]

상 한 실시 도 내 상 하 한 뿐, 사상 한[0120]

하고 하는 아니 , 상에 한 본 본 하는 야에 통상 지식 가진

에 어 본 사상 어나지 않는 내에 여러 가지 , 변 변경 가능하므

상 실시 첨 도 에 한 는 것 아님 , 후 하는 청 뿐만 아니라 청

함께 균등 포함하여 단 어야 한다.

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도 간단한

도 1 열 1 시 는 라 신 B 브 닛 하는 CTB 염 열과 열 2 [0121]

시 는 E. coli Heat-Labile 엔 신 B 브 닛 LTB 염 열 함께 나타낸 것 다.

도 2는 본 에 벼 질 체 하 한 리 pMJ103 나타낸 개략도 다.[0122]

도 3 본 에 라 pMJ103 아그 리움에 시킨 후 LTB CTB [0123]

한 PCR 동 사진 다.

도 4는 본 pMJ103 질 아그 리움 한 벼 에 한 러 도(1) [0124]

식(2), 질 러 재 (3) 그리고 질 체 계 양(4) 나타낸 사진 다.

도 5는 벼에 도 LTB CTB 하 한 PCR 결과 나타낸 동사진 다.[0125]

여 에 M 1kb 크 마커 고, C는 pMJ103 리 , W는 질 지 않 벼 고, T01 내지

T25는 질 벼 다.

도 6 벼에 도 LTB CTB 가 감 게 내 도 개 하 한 블 결과[0126]

나타낸 동 사진 다.

도 7 벼에 도 LTB CTB 사 여 하 하여, 상 mRNA RT-PCR[0127]

결과 나타낸 동 사진 다.

도 8 질 벼 T1 에 한 타 트립 검 결과 나타낸 동 사진 다.[0128]

도 9는 질 벼 T1에 한 GM1-ganglioside ELISA에 한 신 단 질 함량 결과 나타낸 그래프[0129]

다.

도 10 사병 신 하는 질 벼 단 질과 LTB 신 단 질 함량 [0130]

다.

도 11 본 에 사병 신 하는 질 벼 생산하 한 지 들[0131]

다.

도

도 1

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도 2

도 3

도 4

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도 5

도 6

도 7

도 8

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도 9

도 10

등록특허 10-1160095

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도 11

열

<110> GyeongGi-Do

<120> TRANSFORMED RICE FOR EXPRESSING GENES HAVING VACCINE ACTIVITY OF

DIARRHEA AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME

<160> 2

<170> KopatentIn 1.71

<210> 1

<211> 396

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<212> DNA

<213> Vibrio cholerae

<400> 1

atggtgaagc tcaagttcgg agtgttcttc acagttctcc tctcctccgc ttacgctcat 60

ggaacaccac agaacattac tgatttgtgc gctgagtacc acaacacaca aattcatact 120

ctcaacgata agatcttctc ctacacagag tccctcgctg gaaagaggga gatggctatc 180

attactttca agaacggagc tactttccaa gttgaggttc caggaagcca acatattgat 240

tcccagaaga aggctattga gaggatgaag gataccctca ggattgctta cctcactgag 300

gctaaggtgg agaagttgtg cgtttggaac aacaagactc cacatgctat tgctgctatt 360

agcatggcta actactctga gaaagatgag ctataa 396

<210> 2

<211> 396

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 2

atggtgaagg tgaagtgcta cgttttgttc accgctttgc tctcctctct ctgcgcttac 60

ggagctccac agtccattac agagctctgc tccgagtaca ggaacacaca aatctacacc 120

atcaacgata agatcctctc ctacaccgag tccatggctg gaaagaggga gatggttatc 180

attacattca agagcggagc tacattccag gtggaggtgc caggaagcca acatattgat 240

tcccagaaga aggctattga gaggatgaag gatacattga ggatcacata cctcaccgag 300

accaagattg ataagttgtg cgtgtggaac aacaagaccc caaactccat tgctgctatc 360

agcatggaga actactctga gaaagatgag ctataa 396

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