中国组织工程研究 第 18卷 第 37期 2014–09–03出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research September 3, 2014 Vol.18, No.37

ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5955

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张娟，女，1988年生，河北省玉田县人，汉族，内蒙

古医科大学免疫学在读硕

士，医师，主要从事干细胞

的基础与临床应用研究。 通讯作者：王彩生，硕士，

主任医师，内蒙古医科大

学研究生学院，内蒙古自

治 区 呼 和 浩 特 市 010110；呼和浩特市第二医院，内蒙古自治区呼和

浩特市 010031 并列通讯作者：魏来，博

士，教授，北京大学人民

医院，北京大学肝病研究

所，丙型肝炎和肝病免疫

治疗北京市重点实验室，

北京市 100044 doi:10.3969/j.issn.2095-4344.

2014.37.009 [http://www.crter.org] 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)37-05955-06 稿件接受：2014-07-31 Zhang Juan, Studying for master’s degree, Physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China Corresponding author: Wang Cai-sheng, Master, Chief physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China; the Second Hospital of Hohhot City, Hohhot 010031, Inner Mongolia Autonomous Region, China Corresponding author: Wei Lai, M.D., Professor, Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases, Beijing 100044, China Accepted: 2014-07-31

人脐血间充质干细胞来源的外泌体：分离鉴定及生物学特性 张 娟1，刘 峰2，张 薇2，丛 旭2，王彩生1，3，魏 来2(1内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010110；2北京大

学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京市 100044；3呼和浩特市第二医院，内蒙古自

治区呼和浩特市 010031)

文章亮点： 1 研究发现间充质干细胞是通过旁分泌有效生物学活性物质外泌体在细胞间进行信息传递，进而通过某种机制发挥组织损伤修复作用。外泌体是间充质干细胞分泌的膜性小囊泡，含有来源细胞的膜蛋白成分，可以选

择性地将含有的蛋白质、RNA等递送至受体细胞，调节细胞间的信号传导。故可将间充质干细胞来源的外泌体开发成为一种既具有间充质干细胞的作用特点，又能规避其不良分化和肿瘤形成缺陷的新型治疗手段。因

此，通过间充质干细胞来源的外泌体促进组织损伤修复是今后具有重要探讨价值的研究方向。 2 分离提取及鉴定外泌体是进行深入研究的基础，实验主要通过超滤及差速离心法分离出外泌体，通过透射电镜及流式鉴定相结合来鉴定，为后续的外泌体功能研究奠定基础。 3偏倚或不足：人脐血间充质干细胞源性外泌体生物学功能及相关机制还需要进一步分析；人脐血间充质干细胞的外泌体最终要移入体内研究，所以尚需建立动物模型。 关键词： 干细胞；脐带脐血干细胞；外泌体；人脐血间充质干细胞；分离鉴定；活性 主题词： 胎血；间质干细胞；外泌体；膜蛋白质类 摘要 背景：外泌体是间充质干细胞分泌的膜性小囊泡，越来越多的研究表明，间充质干细胞可能通过旁分泌外泌

体而发挥对组织损伤的修复作用，目前人脐血间充质干细胞来源的外泌体分离鉴定尚未见报道。 目的：分离纯化人脐血间充质干细胞来源的外泌体，并鉴定其生物学特性。 方法：收集人脐血间充质干细胞培养上清，采用超滤及梯度离心法分离并纯化外泌体，通过透射电镜观察其

形态，流式细胞术检测其表面标志 CD63、CD81、CD90、CD73、CD105、CD29、CD166。 结果与结论：人脐血来源的间充质干细胞能够分泌外泌体，电镜下呈椭圆或碟状的囊泡结构，直径 40-100 nm。外泌体表达其共性表达标志 CD63、CD81 及间充质干细胞表面黏附分子 CD90、CD73、CD105、CD29、CD166。结果表明采用超滤及梯度离心法可以成功从间充质干细胞培养上清中分离纯化外泌体，间充质干细胞分泌的外泌体具有外泌体的胞膜蛋白组分。 张娟，刘峰，张薇，丛旭，王彩生，魏来. 人脐血间充质干细胞来源的外泌体：分离鉴定及生物学特性[J].中国组织工程研究，2014，18(37):5955-5960.

Exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells: isolation, identification and biological characteristics

Zhang Juan1, Liu Feng2, Zhang Wei2, Cong Xu2, Wang Cai-sheng1, 3, Wei Lai2 (1Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China; 2Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases, Beijing 100044, China; 3the Second Hospital of Hohhot City, Hohhot 010031, Inner Mongolia Autonomous Region, China)

Abstract BACKGROUND: Exosomes are membrane vesicles secreted by mesenchymal stem cells. Increasing studies have shown that mesenchymal stem cells can secrete exosomes via paracrine function to play a role in tissue injury. However, reports on how to isolate and identify exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells are few. OBJECTIVE: To extract, purify and identify exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells. METHODS: The cell culture supernatant of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells was collected. Exosome was extracted and purified with ultrafiltration and gradient centrifugation methods. The morphology of exosome was observed by transmission electronic microscope, and the expressions of CD63, CD81, CD90, CD73, CD105, CD29, and CD166 in exosome of mesenchymal stem cells were analyzed by fluorescent activated cell sorting. RESULTS AND CONCLUSION: Mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood secreted exosome

张娟，等. 人脐血间充质干细胞来源的外泌体：分离鉴定及生物学特性

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which exhibited elliptic or saucer-like shape and its diameter ranged from 40 to 100 nm with membrane structure. Exosome could express the common surface adhesion molecules CD63, CD81 and the surface adhesion molecules CD90, CD73, CD105, CD29, CD166 of mesenchymal stem cells. These findings indicate that exosome may be secreted by mesenchymal stem cells of human umbilical cord blood, which contains plasma membrane proteins of umbilical cord blood mesenchymal stem cells. Subject headings: fetal blood; mesenchymal stem cells; exosomes; membrane proteins Zhang J, Liu F, Zhang W, Cong X, Wang CS, Wei L. Exosomes derived from human umbilical cord blood mesenchymal stem cells: isolation, identification and biological characteristics. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(37): 5955-5960.

0 引言 Introduction 干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能特性

的细胞，可以作为治疗性克隆的研究与治疗资源，并用于糖

尿病、帕金森病和心脑血管病等复杂人类疾病模型的研究，

成为了世界上最受人瞩目的前沿科技领域之一。干细胞按其

发生学来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞，胚胎干细胞来

源于早期胚胎内细胞团，具有全能性，但存在伦理学争议及

取材困难等问题，在研究方面受到一定限制；成体干细胞是

指已分化组织中的未分化细胞，包括造血干细胞、间充质干

细胞、神经干细胞、皮肤干细胞等。目前中国对成体干细胞

的研究较为广泛，尤其是对间充质干细胞的研究。 间充质干细胞是一群中胚层来源的具有多向分化潜能

的多能干细胞，现阶段已经证明间充质干细胞存在于骨髓、

肝脏、脾脏、成人和老年人的骨骼肌、外周血、脂肪、韧

带、胎盘、脐带、脐血、皮肤等组织中[1]。人脐血间充质

干细胞是一类来源于脐血，具有自我更新和多向分化潜能

的成体干细胞，这类细胞与其他来源的间充质干细胞相比，

具有来源丰富，易于采集和运输，增殖能力强，移植后无异

体排斥反应、不涉及伦理问题等诸多优点，近年来逐渐成为

倍受关注的成体干细胞。目前研究显示，人脐血间充质干细

胞可作为多种疾病治疗的细胞来源，修复组织损伤[2-3]，但

是长期移植入体内后，存在着不良分化或致瘤的缺点[4]，

限制了其在临床广泛应用。 外泌体(exosomes)是一种由真核细胞的多泡内涵体

(multivesicular bodies，MVBs)与细胞膜融合后释放到细胞外环境中的纳米量级的膜性小囊泡，可由多种类型细胞分

泌，其内含有不同种类的蛋白质、脂质、mRNAs、microRNAs、信号分子等具有生物学活性的物质，较易与邻近细胞的细胞膜发生融合，将生物学活性物质选择性地

递送至受体细胞，在不同细胞间进行信息传递，调节细胞

间的信号传导，发挥多种生物学功能[5-6]。有文献报道，移

植间充质干细胞能够通过旁分泌有效生物学活性物质-外

泌体，从而在组织损伤中起到修复效果[7-9]。因此，若能深

入研究人脐血间充质干细胞来源的外泌体的功能，将其开

发成为一种既具有间充质干细胞特点而又能克服其缺陷的

新型治疗方式，是今后具有重要探讨价值的研究方向。 为此，本研究提取人脐血间充质干细胞来源的外泌体，

并通过透射电镜和流式细胞术鉴定外泌体的特点，旨在为

进一步研究人脐血间充质干细胞来源的的外泌体在组织损

伤修复中的生物学功能和相关机制提供实验基础。 1 材料和方法 Materials and methods

设计：细胞学体外实验。 时间及地点：于2013年9月至2014年4月在北京大学人

民医院肝病研究所完成。 材料： 脐血：取自北京大学人民医院产科足月剖腹产或足月

正常产健康产妇，产妇平均年龄(28±5)岁，均经当事人知情同意并签订协议书。实验经医院伦理委员会同意，符合

医学伦理学标准。 实验方法：

人脐血间充质干细胞原代分离培养：参考文献方法提

取人脐血间充质干细胞[10-12]，无菌条件下采集(60±20) mL

脐静脉血到一次性无菌塑料采血袋中，于采集后12 h内进行脐血单个核细胞分离。将脐血按1∶1比例沿管壁缓慢加入含有Ficoll-Paque分离液上层，尽可能保持界面清晰，进

人脐血间充质干细胞来源的外泌体分离鉴定及生物学特性检测试剂与仪器：

试剂及仪器 来源

Ficoll-Paque分离液 美国GE Healthcare公司

间充质干细胞培养基 美国ScienCell公司

BCA蛋白定量试剂盒 美国Pierce公司

0.05%Trypsin-EDTA 美国Gibcol公司

PE标记小鼠抗人 CD166、CD44、CD73、CD90、CD81、CD63；FITC标记小鼠抗人CD29、CD45；APC标记小鼠抗人CD73、CD105、CD34、CD90

美国Ebioscience公司

ND-2000 超微量紫外可见分光光度计 美国Therom公司

5810R台式高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司

HITACHI 55P-72超速冷冻离心机 日本HITACHI公司

流式细胞仪 美国BD公司

二氧化碳孵育箱 美国Forma scientific公司

OLYMPUS-IX71倒置显微镜 日本Olympus公司

透射电子显微镜 德国Leica公司

分离磁珠Exosome-Human CD63 美国Invitrogen公司

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行梯度离心，1 900 r/min离心30 min，离心后液体分为4层，从上到下依次为血浆层、单个核细胞层、Ficoll层、红细胞层，小心缓慢吸取中间界面层白色云雾状或团状单个

核细胞层到PBS中，1 600 r/min，低温离心15 min，然后加于PBS重悬，1 200 r/min，低温离心8 min，按此操作重复2次，计数单个核细胞的数量，将单个核细胞以1×106/cm2

的密度接种于25 cm2的培养瓶中。

人脐血间充质干细胞的培养、纯化及传代：将细胞培

养瓶置于37 ℃，体积分数为5%CO2饱和湿度孵育箱中培

养，72 h首次全量换液，以后每隔三四天换液。换液用间充质干细胞培养基。倒置显微镜下观察细胞生长情况及形

态变化，待细胞长至培养瓶底80%-90%面积时，用0.05%胰酶常规进行细胞消化，传代培养。 人脐血间充质干细胞的形态学观察及鉴定：取第4代人

脐血间充质干细胞，用0.05%胰酶消化1.0-2.0 min，待细胞变圆加入血清培养基中和胰酶作用，吹打管壁至细胞脱

落，制成细胞悬液，以1 200 r/min，离心5 min，使细胞沉淀，PBS冲洗细胞，室温下分别与 CD34、CD45、CD166、CD44、CD105、CD29、CD73、CD90单克隆抗体避光孵育60 min，PBS清洗细胞，洗去未结合抗体，离心，弃去上清液，用同型对照单克隆抗体作为阴性对照组，流式细

胞仪检测各标志的表达。 外泌体的分离和纯化：选择增殖能力强、状态好的第

3-5代人脐血间充质干细胞，无血清培养48 h后，收集培养上清液30 mL，1 000×g离心15 min除去细胞碎片等，再经0.45 μm无菌滤膜过滤到20 mL规格的超滤离心管中，4 ℃条件下1 000×g离心70 min，得到含外泌体的浓缩液，将浓缩液移至加有200 μL质量浓度为300 g/L蔗糖的超速离心管中，4 ℃条件下，100 000×g离心70 min，收集底部沉淀用PBS稀释后，再次100 000×g离心70 min，洗涤 1次，最后将收集的外泌体浓缩液蛋白定量，0.22 μL滤膜过滤除菌，分装，于-80 ℃冷藏备用。 外泌体的形态学观察：取上述PBS悬浮液50 μL，向样

品中滴入染色剂醋酸铀水溶液(1%，pH=4.0)，混匀，用移液枪滴加1滴在复膜铜网上，自然干燥后在透射电子显微镜上进行观察，并拍摄电镜照片。 外泌体蛋白质浓度测定：采用BCA蛋白定量试剂盒，

ND-2000超微量紫外可见分光光度计检测外泌体总蛋白量。参数：标本 0.1 mL+试剂 2.0 mL；反应时间30 min；反应温度37 ℃；波长为562 nm。 流式细胞术检测人脐血间充质干细胞来源的外泌体表

面标志：将20 μL磁珠(CD63)加入到1.5 mL EP管中，混匀，加入200 μL 0.1%BSA溶液冲洗磁珠，将EP管置于磁极上 1 min，吸取上清，加入100 μL分离纯化后的外泌体浓缩液，混匀，4 ℃过夜。加入300 μL 0.1%BSA清洗，置于磁极上1 min，吸掉上清，所得悬液与CD81、CD63、CD166、CD90、CD73、CD105、CD29单克隆抗体温育，同时用

同型IgG作阴性对照，经流式细胞仪检测。 主要观察指标：①倒置显微镜观察人脐血间充质干细

胞形态变化。②流式细胞仪鉴定人脐血间充质干细胞表面

相关抗原。③透射电镜观察外泌体形态。④流式细胞仪鉴

定外泌体表面相关抗原。

2 结果 Results 2.1 人脐血间充质干细胞的形态学观察 用Ficoll-Paque分离液密度梯度离心后，从脐血中分离出单个核细胞，将

之接种于间充质干细胞培养基中，观察发现，原代分离的

脐血单个核细胞经过6 h的体外培养后仅有极少量细胞贴壁，早期贴壁的细胞形态异质性较大，以梭形和多角形为

主，有的细胞甚至接近圆形，细胞体积较大。72 h首次换液后，细胞呈单层贴壁生长，形态主要为梭形、圆形，梭

形细胞呈短纤维状或纺锤形，数量少，分布稀疏。14 d后基本达70%融合。经传代培养后，细胞分布均匀，呈成纤维样细胞形态，四五天后可达80%融合(图1)。

2.2 脐血间充质干细胞表面标记物的表达 流式细胞仪检测结果显示，培养的第4代人脐血间充质干细胞均一表达CD166、CD44、CD105、CD29、CD73、CD90，阳性率分别为97.29%、94.54%、93.20%、97.77%、98.69%、99.27%，而CD34、CD45呈阴性，阳性率分别为1.86%、2.48%(图2)。 2.3 人脐血间充质干细胞来源的外泌体的形态特征 透射电镜下可见一群大小具有较明显异质性，直径介于 40-100 nm，呈圆形或椭圆形的膜性小囊泡，囊泡外周可见其膜性结构，中央为低电子密度成分(图3)。 2.4 人脐血间充质干细胞分泌外泌体的含量 30 mL人脐血间充质干细胞无血清培养上清可分离获得约500 mL外泌体悬液，其蛋白质浓度为(2.50±0.05) g/L。 2.5 人脐血间充质干细胞来源的外泌体表面标记物的表达 流式细胞仪检测结果显示，人脐血间充质干细胞来源的外泌体表达外泌体共性标志CD63、CD81，及间充质干细胞的表面黏附分子CD90、CD73、CD105、CD166、CD29(图4)。 3 讨论 Discussion 外泌体最初是Johnstone等[13]在网织红细胞向成熟红

细胞分化过程中发现的。早期被认为是网织红细胞在成熟

过程中调整膜功能而释放的一些多余的质膜蛋白。随着对

外泌体的来源、功能和作用机制进一步的深入研究发现，

外泌体并不是简单的细胞残片，而是一种特异性的亚细胞

结构。外泌体的主要特性有：①由多种细胞分泌，包括B细胞

[14]、T细胞[15]

、树突细胞[16]、上皮细胞

[17]、肿瘤细胞

[18]、

许旺细胞[19]，也存在于血浆、尿液、恶性腹水、唾液，母

乳、滑膜液、肺泡灌洗液等多种体液中[20-23]。②电镜下外观

为具有双层脂质围绕的碟形小体，直径介于40-100 nm。③

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图 1 人脐血间充质干细胞形态变化 Figure 1 Morphological changes of human umbilical cord blood mesenchymal stem cells 图注：A为人脐血间充质干细胞培养 7 d，呈梭形(倒置显微镜，×200)；B为人脐血间充质干细胞培养 14 d，排列呈网状、辐射状(倒置显微镜，×100)；C为第 4代人脐血间充质干细胞，细胞分布均匀，呈成纤维样细胞形态(倒置显微镜，×200)。

A B C

图 2 第 4代人脐血间充质干细胞表面标志物的表达 Figure 2 Surface marker expression of passage 4 human umbilical cord blood mesenchymal stem cells 图注：培养的第 4代人脐血间充质干细胞均一表达 CD166、CD44、CD105、CD29、CD73、CD90，而 CD34、CD45呈阴性表达。

图 4 流式细胞仪检测外泌体表面标志物的表达 Figure 4 Surface marker expression of exosome 图注：人脐血间充质干细胞来源的外泌体表达外泌体共性标志 CD63、CD81，及间充质干细胞的表面黏附分子 CD90、CD73、CD105、CD166、CD29。

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具有来源细胞的胞质和脂质胞膜成分。④可通过蔗糖梯度密

度超速离心获得，在30%蔗糖溶液中密度梯度离心时，外泌体以脂质囊形式漂浮在1.13-1.19 g/mL密度层之间[24]

。⑤典

型的外泌体膜蛋白主要有 CD63、CD81，MFGE8，GAPDH 以及热休克蛋白，不同细胞来源的外泌体含有其来源细胞

关键的蛋白标记物[25-27]，例如源于网织红细胞的外泌体富

含转铁蛋白受体，源于抗原提呈细胞的外泌体含有主要组

织相容性复合体Ⅰ、Ⅱ类分子及其共刺激分子，肿瘤细胞

自身分泌的外泌体表面富含主要组织相容性复合体分子，

伴侣分子热休克蛋白和肿瘤相关抗原。 本实验首先通过密度梯度离心法分离出人脐血间充质

干细胞，表面抗原鉴定结果显示，阴性表达造血细胞系

CD34，CD45，阳性表达间充质干细胞特征性标志CD44，CD105。因此认为以上方式提取到的细胞为人脐血间充质干细胞。采用超滤及梯度离心法分离纯化得到人脐血间充质干

细胞分泌的外泌体，透射电镜对其形态学观察可以发现，其

为圆形或椭圆形膜性小囊泡，直径介于在40-100 nm，有完整的包膜结构。流式细胞术检测显示，外泌体表面共性

表达标志CD63、CD81为阳性，说明此实验分离得到间充质干细胞来源外泌体，其表面CD90、CD73、CD105、CD166、CD29均为阳性，表明其含有间充质干细胞的膜表面标志，提示本方法分离的人脐血间充质干细胞来源的

外泌体含有其来源间充质干细胞的成分及特征。 间充质干细胞已被证实具有明确的组织再生修复作用

以及潜在的免疫调节调控细胞生长分化等功能[28-31]，但是

间充质干细胞长期移植入体内，存在着异常分化及肿瘤形

成等问题[32]，这促使学者寻求新的治疗途径。研究发现间

充质干细胞是通过旁分泌有效生物学活性物质外泌体在细

胞间进行信息传递，进而通过某种机制发挥组织损伤修复

作用。间充质干细胞来源的外泌体与间充质干细胞相比，

具有易于保存，避免细胞复苏等优点，同时也克服了间充

质干细胞移植后异常分化及肿瘤的问题，故可将间充质干

细胞来源的外泌体开发成为一种既具有间充质干细胞作用

特点而又能规避其缺陷的新型治疗手段。 2010年Camussia等[33]

研究发现，间充质干细胞可通

过微泡介导的基因信息从而起到修复肾损伤的作用。Lai等

[34]研究发现骨髓间充质干细胞来源的外泌体能改善心肌

缺血再灌注损伤，减小梗死心肌的范围[35]，胚胎干细胞分

泌的外泌体可以缩小猪缺血再灌注模型中心肌梗死的范

围，改善心功能[36]。2013年，研究人员发现脐带间充质干

细胞来源的外泌体可以修复肝脏纤维化，恢复肝功能[7]。

目前，对人脐血间充质干细胞来源的外泌体的研究尚无相

关报道。脐血间充质干细胞较脐带、骨髓、脂肪等来源的

间充质干细胞易取材、分化能力更强、免疫原性低，对供

者无影响，避免伦理争议等优势[37-38]，所以深入研究人脐

血间充质干细胞来源的外泌体，有望能取代间充质干细胞

在组织损伤修复中发挥重要作用。 实验通过简单实用的方法分离出人脐血间充质干细胞

来源的外泌体。后续实验将进一步探讨外泌体在组织损伤

修复中的的生物学功能及相关机制，从而为外泌体在临床

医学等方面的应用提供有力的理论依据。 作者贡献：实验设计为刘峰、王彩生、魏来，实验实施为张

娟、刘峰，实验评估为其他作者共同完成，资料收集为张娟。张

娟成文，刘峰审校，所有作者对文章负责。

利益冲突：文章及内容不涉及相关利益冲突。

伦理要求：脐血取自北京大学人民医院产科足月剖腹产或足

月正常产健康产妇，均经当事人知情同意并签订协议书。实验经

医院伦理委员会同意，符合医学伦理学标准。

学术术语：外泌体(exosome)-活细胞吞噬异源物质后，在细

胞内形成内吞泡，其中一部分内吞泡可以与溶酶体结合而降解，

另一部分则在相关刺激因子的作用下，以出芽的方式向内凹陷，

形成一个膜包围的结构，内含多个小囊泡，称其为多泡内涵体

(multivesicular bodies，MVBs)，小囊泡里主要成分是细胞质，

由脂质双分子层包绕。多泡内涵体泡膜最终与细胞膜融合，通过

胞吐作用释放其中的小囊泡至泡外空间，即成 exosome。

A B C

图 3 透射电镜下脐血间充质干细胞来源的外泌体形态 Figure 3 Characterization of exosome from umbilical cord blood mesenchymal stem cells under transmission electron microscope 图注：透射电镜下可见一群大小具有较明显异质性，直径介于 40-100 nm，呈圆形或椭圆形的膜性小囊泡，囊泡外周可见其膜性结构，中央为低电子密度成分。A图标尺为 100 nm，B图标尺为 200 nm，C图标尺为 500 nm。

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专利争议，内容及数据真实，文责自负。

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