2.04.06_bse encefalopatia espongiforme bovina

NB: Versin adoptada en la Asamblea Mundial de Delegados de la OIE en mayo de 2010

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2012 1

C A P T U L O 2 . 4 . 6 .

E N C E F A L O P A T A E S P O N G I F O R M E B O V I N A

RESUMEN

La encefalopata espongiforme bovina (EEB) es una enfermedad neurolgica mortal del ganado bovino adulto, que fue reconocida por primera vez en el Reino Unido (RU). Es una enfermedad transmisible causada por priones. El arquetipo de este grupo de enfermedades es el prurigo lumbar de las ovejas y las cabras (vase el captulo 2.7.12. Prurigo lumbar).

La epizootia de la EEB se puede explicar por la exposicin oral a un agente semejante al del prurigo lumbar en las protenas derivadas de rumiantes que se incluan en las harinas de carne y hueso incluidas como ingrediente de alimento para animales. Los casos iniciales de EEB en algunos pases se consideraron consecuencia de exportaciones de ganado bovino procedente del RU infectado o de harina de carne y hueso contaminada, aunque ahora estn implicadas exportaciones de otros pases. En otros, los casos iniciales no presentan una asociacin clara con harina de carne y hueso importada, lo cual sugiere que pueden haber tenido lugar casos locales anteriores no detectados y posiblemente espontneos. La epizootia est en declive gracias a las medidas de control. Se han detectado casos de EEB en la mayora de pases europeos, en Norteamrica y en unos pocos pases asiticos.

Se ha demostrado la transmisibilidad experimental de la EEB al ganado bovino. Se sospecha que el agente de la EEB, es la fuente comn, por la va alimenticia, de encefalopatas espongiformes transmisibles (EET) en otras especies de rumiantes y de flidos. Existen indicios de una relacin causal entre el agente causante de la EEB y la variante enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (vECJ) del ser humano. Las recomendaciones para el manejo de material infectado con EEB parten de la base de que la EEB es una zoonosis y se ha adscrito a la categora 3 de contencin (con derogacin).

Identificacin del agente: La EEB clnica tiene un pico de incidencia en el ganado bovino de entre 4 y 5 aos. La duracin clnica es variable pero puede prolongarse hasta durar varios meses. Los signos clnicos manifiestos son caractersticos si pueden descartarse los dems diagnsticos diferenciales. Los primeros sntomas clnicos pueden ser sutiles y principalmente conductuales, y pueden llevar a la eliminacin de animales afectados antes de que se dispare la sospecha de EEB. En pases con una poltica establecida contra la enfermedad, los animales clnicamente sospechosos deben sacrificarse, analizarse los encfalos y destruirse las correspondientes canales. Hoy en da, en la mayora de pases la vigilancia activa que se lleva a cabo en los mataderos permite identificar las cabezas de ganado bovino infectadas sacrificadas antes de que empiecen los signos clnicos, y el anlisis del ganado que ha muerto en la explotacin permite identificar casos en los que puede haber habido signos clnicos que hayan pasado desapercibidos. Actualmente no se dispone de ninguna prueba de diagnstico para animales vivos. La naturaleza de los agentes que causan las EET no est clara. En la patogenia de estas enfermedades, presenta una importancia crtica una isoforma de una protena de membrana PrPc (originalmente denominada PrPSc) que es especfica de la enfermedad y parcialmente resistente a las proteasas, y que, segn la hiptesis del prin, constituye el nico o el principal componente del agente infeccioso. La confirmacin del diagnstico, que anteriormente se haca mediante examen histopatolgico del encfalo, se lleva a cabo ahora mediante la aplicacin de mtodos inmunohistoqumicos (IHC) y/o inmunoqumicos al tejido enceflico para la deteccin de la PrPSc. La PrPSc se puede detectar en puntos neuroanatmicos especficos del SNC del ganado bovino afectado mediante IHC en material fijado en formalina o por inmunoelectrotransferencia u otros mtodos de enzimoinmunoensayo en los que se usan extractos de encfalo no fijados.

Captulo 2.4.6. Encefalopata espongiforme bovina

2 Manual de la OIE sobre animales terrestres 2012

La transmisin mediante tejido enceflico infectado es el nico mtodo actualmente disponible para la deteccin de infectividad y es importante para la caracterizacin de las cepas del agente patgeno. Se han detectado variantes o formas atpicas de EEB en todos los continentes en los que ha tenido lugar la EEB clsica. Aunque en la mayora de los casos los fenotipos atpicos se han basado en modelos de bandas de inmunoelectrotransferencia, la caracterizacin de algunas cepas mediante bioanlisis respalda el concepto de diversidad de cepas en la EEB.

En muchos pases se utilizan para el diagnstico de la EEB kits comerciales; de forma similar, un conjunto de anticuerpos anti-PrP constituye la base de muchos mtodos de diagnstico. Algunos se comercializan, o bien pueden obtenerse en los Laboratorios de Referencia de la OIE u otros laboratorios con programas activos contra las EET.

Pruebas serolgicas: En las EET no se han detectado respuestas inmunitarias especficas.

Requisitos para las vacunas: Actualmente no se dispone de ninguna vacuna.

A. INTRODUCCIN

La encefalopata espongiforme bovina (EEB), una enfermedad mortal del ganado bovino causada por priones puede cursar clnicamente con temor, hiperreactividad y ataxia. Sin un agente causal aislable, los casos solo se pueden confirmar de manera definitiva post-mortem mediante observacin de la acumulacin, en el sistema nervioso central (SNC) de protena de prin (PrPSc, PrPd o PrPres), una isoforma parcialmente resistente a la proteasa de una protena codificada por el hospedador (PrPC). La hiptesis del prin propone que el agente est formado totalmente por PrPSc, que es capaz de inducir conversin de PrPC. No est claro cul es la funcin de PrPC. Otras hiptesis, como la del origen vrico o bacteriano o la de la intervencin de cofactores como desequilibrios de minerales, siguen sin haberse demostrado. La razn de la variacin entre cepas todava no est clara, pero en la hiptesis del prin, las "cepas" estn codificadas en distintas conformaciones de la protena.

La caracterizacin anatomopatolgica y mediante bioanlisis mostr que la epidemia estaba causada por una sola cepa, y el hecho de obtener resultados siempre caractersticos en la neurohistopatologa y en las pruebas moleculares de deteccin de la PrPSc en animales afectados clnicamente constituy el criterio de definicin de un caso de EEB. Desde 2003, informes de una anatomopatologa (Casalone et al., 2004) y/o de unas caractersticas moleculares distintas en ganado bovino viejo de varios pases han indicado una posible variacin de la cepa del agente causal (se proporcionan ejemplos en las referencias Jacob et al., 2007 y Yamakawa et al., 2003). La mayora de casos se identificaron mediante un seguimiento activo de poblaciones no sospechosas utilizando mtodos rpidos de inmunodeteccin de la PrP. Hasta ahora, en unos 50 casos de EEB se ha observado, mediante inmunoelectrotransferencia, que difieren en cuanto a sus perfiles moleculares de los habitualmente hallados en la epidemia. Debido al hecho de que en la mayora de los casos se han detectado mediante vigilancia activa, se carece de historiales clnicos debidamente correlacionados y la mayora se centran nicamente en datos obtenidos por inmunoelectrotransferencia (3, 44. Un rasgo comn interesante es que la mayora de estas caractersticas variantes se originan en ganado bovino de ms edad. Los datos del bioanlisis inicial respaldan la hiptesis de que estas cepas son, desde el punto de vista biolgico, claramente distintas de las de la EEB clsica (Beringue et al., 2006; Lombardi et al., 2008). No se sabe si los casos atpicos tienen alguna importancia para las formas de enfermedades humanas causadas por priones. Actualmente, estos casos atpicos aparecen como dos tipos claramente distintos clasificados por la masa molecular de la banda de la protena PrPres no glicosilada respecto a la de la EEB clsica. Un tipo tiene una masa molecular mayor (tipo H) y el otro presenta una masa molecular menor (tipo L).

En estudios epidemiolgicos se ha establecido que la EEB tena lugar como una gran epizootia de origen comn, por exposicin al agente presente en el alimento (Anderson et al., 1996). La EEB tuvo lugar en muchos pases con una incidencia inferior que en el RU. Muchos casos ms probablemente han derivado directa o indirectamente de la exportacin de ganado bovino infectado o de harina de carne y hueso infectada, con la posterior propagacin local por piensos contaminados. No obstante, en algunos pases, algunos casos han indicado exposicin local (OIE: Situacin sanitaria mundial Encefalopata espongiforme bovina [http://www.oie.int/eng/info/en_esb.htm]).

No existen indicios de transmisin horizontal y pocos datos respaldan la transmisin materna (Prince et al., 2003). Los estudios realizados no han hallado indicios de riesgo de transmisin por el semen, la leche ni los embriones (Prince et al., 2003).



Las epizootias de EEB han disminuido, y se observa el xito de los controles en forma de cambios en la incidencia en cada grupo de edad. La interpretacin del estado de las epizootias ha mejorado mediante una vigilancia activa que ha permitido detectar animales infectados que no eran clnicamente sospechosos.

La aparicin de vECJ en seres humanos se ha asociado a la ingesta de EEB (Bruce et al., 1997). Las precauciones de seguridad recomendadas para manipular el agente se basan en el supuesto de que la EEB es una zoonosis. Las medidas de biocontencin para las necropsias y la manipulacin de tejido deben basarse en un anlisis del riesgo y cumplir la normativa nacional pertinente; todo procedimiento que genere aerosoles debe llevarse a cabo en las condiciones del nivel 3 de contencin (vase el Captulo 1.1.2. Bioproteccin y seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiologa y en las instalaciones de los animales), y el laboratorio debe cumplir con la normativa nacional de bioseguridad y biocontencin para proteger a los operarios de la exposicin al agente patgeno. Los procedimientos recomendados para la descontaminacin pueden no ser completamente eficaces cuando se trata con material de un ttulo alto o cuando el agente queda protegido en el interior de materia orgnica seca). La inactivacin fsica que se recomienda es un tratamiento en autoclave de carga porosa a 134C 138C durante 18 minutos a una presin de 208 kPa o 2,2 bar (30 lb/in2). No obstante, las temperaturas del extremo superior del intervalo pueden ser menos eficaces que las del extremo inferior y podra no lograrse la inactivacin total en ciertas condiciones, como cuando el material analizado est en forma de macerado. Los procedimientos recomendados de descontaminacin podran no ser del todo eficaces en ciertas circunstancias. La desinfeccin de posibles fomites se lleva a cabo utilizando hipoclorito de sodio que contenga un 2% de cloro disponible, o con hidrxido de sodio 2N, aplicado durante ms de 1 hora a 20C en el caso de las superficies, o durante toda la noche en el caso del equipo.

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO

1. Identificacin del agente

No existe ningn mtodo til para confirmar la presencia de EEB en el animal vivo. La identificacin del "agente" empieza con la sospecha clnica de la enfermedad, o bien con la demostracin post-mortem de una acumulacin de PrPSc en un animal no sospechoso mediante programas de vigilancia activa. La naturaleza del "agente" en s sigue siendo hipottica, y por tanto no puede aislarse con fines de diagnstico. Sin embargo, est ampliamente aceptado que la PrPSc es un marcador fiable de la enfermedad, y, a excepcin de la exploracin fsica y de la histopatologa, todos los mtodos actuales de diagnstico se basan en la demostracin de esta protena.

La EEB clnica "clsica" tiene lugar en el ganado bovino adulto (de entre 20 meses y 22 aos en el RU). Durante la epidemia principal, la mayora de casos se observaron en ganado bovino lechero de entre 4 y 6 aos. Posteriormente, se ha observado el impacto de los eficaces controles en un aumento de la edad de aparicin de la enfermedad clnica. La EEB aparece de forma aparentemente benigna y normalmente un curso que avanza lentamente (Konold et al., 2004; Wilesmith et al., 1992). La aparicin de los signos clnicos no se asocia a la estacin ni a la fase del ciclo reproductivo. En ocasiones, habr un caso con signos agudos y a continuacin se deteriorar rpidamente, aunque la frecuencia de observacin es un factor importante para determinar los primeros signos clnicos. Los signos iniciales, aunque son variables suelen consistir en cambios de comportamiento y de carcter, hiperreactividad y falta de coordinacin. Las vacas afectadas podran ser reacias a entrar en la sala de ordeo o bien dar enrgicas coces durante el ordeo, lo cual suele ser el primer signo observado. En el caso de las vacas secas en concreto, una falta de coordinacin y debilidad en las patas traseras puede ser el primer signo clnico detectado. Los signos nerviosos observados con ms frecuencia han sido el temor, la ataxia de los miembros pelvianos y la hiperestesia al tacto y al sonido. Los sobresaltos ante estmulos externos, repetibles, son frecuentes y por tanto se utilizan para respaldar el diagnstico clnico en los casos en que se sospecha de EEB (Konold et al., 2004). El intenso prurito caracterstico de la mayora de ovejas con prurigo lumbar no es destacado en el ganado bovino con EEB. Las vacas afectadas a veces llevarn la cabeza baja y el cuello extendido al estar de pie, y arquearn el lomo o separarn las patas traseras. Tambin es posible observar un temblor de la cabeza. Las anomalas de la marcha, como la falta de coordinacin o la hipermetra, a menudo se limitan a las patas traseras y se aprecian ms fcilmente al observar el ganado bovino pastando. A medida que avanza la intensidad de los signos locomotores, una debilidad generalizada, que da lugar a cadas y decbito, puede dominar el cuadro clnico. Los signos nerviosos a menudo cursan con rasgos clnicos generales de prdida de condicin corporal y reduccin de la produccin de leche a medida que la enfermedad avanza. No se han producido cambios en el cuadro clnico de la EEB a lo largo del curso de la epizootia del RU (Konold et al., 2004; Wilesmith et al., 1992). Los signos clnicos son bsicamente similares en otros pases en los que ha tenido lugar EEB. El curso clnico largo, que suele durar semanas o meses, terminara requiriendo el sacrificio por motivos de bienestar animal. Sin embargo, una poltica establecida por ley para determinar el estatus de un pas en relacin con la EEB exige la declaracin obligatoria y la investigacin diagnstica de los casos clnicamente sospechosos, as como su sacrificio y examen post-mortem del encfalo. Al inicio del curso de la enfermedad, los signos pueden ser sutiles, variables e inespecficos, y por tanto pueden impedir el diagnstico clnico en una exploracin inicial. La observacin continuada de estos casos ambiguos, junto con procedimientos adecuados de anatomopatologa clnica para eliminar diagnsticos diferenciales, sobre todo trastornos metablicos, permitirn



establecer el avance de los signos. Algunos sntomas tempranos de la EEB pueden mostrar similitudes con rasgos de cetosis nerviosa, hipomagnesemia, listeriosis enceflica y otras enfermedades del sistema nervioso central. Los signos sutiles a veces se pueden exacerbar debido al estrs, como el causado por el transporte. Se pueden descargar videos de ganado bovino afectado por EEB de la web del Laboratorio de Referencia de la OIE para la EEB que se encuentra en el RU1, que tambin proporciona secuencias de DVD o cintas de video sobre pedido, o el Laboratorio de Referencia de la OIE de Suiza2.

El escaso nmero de formas variantes de EET en el ganado bovino, funcionalmente definida como EEAB (encefalopata espongiforme amiloidtica bovina) o tipo L y EEB tipo H en funcin de la masa del fragmento de la PrP no glicosilada en inmunoelectrotransferencias (Casalone et al., 2004; Jacob et al., 2007) han dado poca informacin clnica porque la mayora se han identificado en ganado bovino aparentemente sano o en animales muertos en la explotacin.

Los diagnsticos de laboratorio de la EEB han evolucionado al avanzar en los conocimientos sobre la patogenia de la enfermedad y a medida que se han producido avances tcnicos (Gavier-Widen et al., 2005). En ausencia de mtodos in-vitro para el aislamiento del agente causal, histricamente la enfermedad se ha confirmado mediante la observacin de los rasgos morfolgicos de encefalopata espongiforme mediante examen histopatolgico, a varios niveles del encfalo. La histopatologa sigue siendo el nico mtodo mediante el cual puede identificarse esta caracterstica vacuolacin especfica de las EET. El diagnstico original de EEB se bas en la identificacin de los rasgos histopatolgicos compatibles con encefalopata espongiforme tipo prurigo lumbar. Esto se facilit con la visualizacin, mediante microscopa electrnica, de fibrillas, denominadas fibrillas asociadas al prurigo lumbar (SAF), que estn formadas en gran parte por PrPSc, en extractos detergentes de encfalo afectado. El material examinado siempre proceda de casos clnicos sospechosos. Durante la epizootia de rpida propagacin de finales de los aos 1980, el diagnstico histopatolgico basado en el examen de un nico corte de bulbo raqudeo (a nivel del bex) se valid frente a un examen ms extenso del tronco cerebral. Este enfoque simplificado permiti modificar el muestreo de encfalo fresco; en lugar de retirar todo el encfalo, el corte necesario se tomaba de tronco cerebral extrado por el agujero occipital, utilizando instrumental adaptado. A medida que se estableci la especificidad diagnstica de PrPSc, se utilizaron mtodos inmunohistoqumicos de deteccin de la PrP especfica de la enfermedad, como tcnicas de IHC y transferencia Western/SAF-inmunoelectrotransferencia, adems de histopatologa, para confirmar el diagnstico y mejorar la sensibilidad en los casos tempranos o autolisados. La introduccin de mtodos in-vitro ms rpidos, principalmente basados en el enzimoinmunoensayo (ELISA), para la deteccin de la PrPSc ha conllevado gran variedad de pruebas "rpidas", que ahora constituyen las principales herramientas de deteccin sistemtica para la vigilancia activa. Este tipo de pruebas proporcionan un diagnstico preliminar, cuyos resultados positivos o inconcluyentes se someten a exmenes mediante IHC o a mtodos confirmativos por transferencia Western. Las pruebas rpidas actualmente constituyen el principal mtodo de deteccin de casos y se ha llegado al acuerdo de que se utilicen ms como parte del proceso confirmativo (Laboratorio de Referencia de la OIE del Reino Unido). Todas las formas de EEB actualmente reconocibles son detectables mediante estos mtodos, aunque no se ha llevado a cabo una evaluacin completa de las formas atpicas (tipo H y L).

La eleccin de cualquier mtodo en concreto depender del contexto en el que se utilice. Los contextos abarcan desde la confirmacin de casos clnicos sospechosos a la deteccin sistemtica de indicios de enfermedad subclnica o preclnica en poblaciones sanas. La definicin de caso adoptada tambin diferir en funcin de si el mtodo de diagnstico va a aplicarse para confirmacin o para deteccin. Debe tenerse cuidado con la interpretacin de los datos de diagnstico cuando se utilizan metodologas que no permiten una referencia cruzada con los estndares para el diagnstico confirmativo que se definen aqu. Sin una comparacin adecuada con criterios publicados previamente que definan el fenotipo de la EEB, y en ausencia de estudios de transmisin, los resultados de diagnstico que defiendan la identificacin de una nueva cepa pueden ser prematuros. El control de calidad (QC) y la garanta de calidad (GC) son partes fundamentales de los procedimientos analticos y los Laboratorios de Referencia de la OIE (http://www.oie.int/eng/OIE/organisation/en_LR.htm) pueden dar consejo. Tanto si los animales infectados por EEB se identifican mediante vigilancia pasiva como si se identifican mediante vigilancia activa, es aconsejable detectar y confirmar la enfermedad mediante una combinacin de al menos dos mtodos analticos. La prueba principal puede ser uno de los mtodos analticos confirmativos descritos abajo o una prueba rpida, pero es importante aplicar una prueba secundaria para confirmar un posible resultado positivo o inconcluyente de la prueba principal. Cuando hay un conflicto entre los resultados de las pruebas principal y secundaria, deben aplicarse otras pruebas utilizando inmunohistoqumica o inmunoelectrotransferencia de fibrillas asociadas a prurigo lumbar (SAF) (o una prueba alternativa aprobada), o bien deben enviarse las muestras a un Laboratorio de Referencia de la OIE para su resolucin.

1 Este laboratorio tambin es el Laboratorio Comunitario de Referencia de la Comisin Europea (CE) para las

Encefalopatas Espongiformes Transmisibles (EET). Todas sus pginas web pueden encontrarse en: http://www.vla.gov.uk/science/sci_tse_rl_tests.htm

2 www.neurocenter-bern.ch



a) Preparacin de la muestra

El estatus de EEB de un pas, la implementacin relativa de programas de vigilancia pasiva y activa y los mtodos de diagnstico aplicados influirn en la estrategia de muestreo.

En todas las circunstancias de vigilancia pasiva de la enfermedad neurolgica en el ganado bovino adulto cuando no se haya establecido la aparicin de EEB en un pas o estado o la incidencia sea baja, se recomienda someter los casos clnicamente sospechosos a un enfoque neuropatolgico estndar en el que se muestreo todo el encfalo, y se examinen partes representativas de todo el encfalo. El ganado bovino sospechoso de tener la enfermedad debe sacrificarse con una inyeccin intravenosa de una solucin de barbitrico concentrado precedida, si es necesario, de sedacin. El encfalo debe extraerse cuanto antes tras la muerte, por los mtodos estndar. No existen lesiones macroscpicas asociadas a la EEB, de modo que si se observa alguna al extraer el encfalo, estas debern muestrearse especficamente para facilitar el diagnstico diferencial.

Debe tenerse cuidado de conservar muestras de encfalo fijado y fresco adecuadas para la deteccin de PrPSc mediante inmunohistoqumica y mediante inmunoqumica. El incumplimiento de este enfoque de toma y conservacin de todo el encfalo podra impedir la adecuada caracterizacin del caso, para confirmar si es o no tpico de la EEB.

Se llevan a cabo exmenes mediante histopatologa e IHC inicialmente con un bloque nico (0,5-1,0 cm de espesor) cortado en el bex del bulbo raqudeo (Fig. 1a y b, nivel A-A que representa el centro del bloque para el examen), que debe fijarse durante un mnimo de 3-5 das (en funcin del espesor del bloque) en solucin del formaldehdo al 4% (es decir, solucin salina con formol al 10% o formalina normal tamponada al 10% [NBF]). El posterior procesado histolgico debe realizarse mediante mtodos convencionales de inclusin en parafina para tejido neural. (Un ejemplo de mtodos adecuados de procesado puede consultarse en el Laboratorio de Referencia de la OIE del Reino Unido.

Inicialmente debe tomarse material fresco para la inmunodeteccin de PrPSc en forma de semicorte del bulbo raqudeo a nivel del bex, o en forma de corte coronal completo (2-4 g), inmediatamente rostral, o caudal, al bloque de bex tomado para la fijacin. Todas las dems zonas del encfalo deben subdividirse mediante un corte paramediano sagital (3-5 mm alejado de la mediana). La parte menor se guarda para la deteccin de la PrPSc mediante mtodos inmunoqumicos (como la inmunoelectrotransferencia) y se guarda congelada antes del anlisis (si el anlisis no se realiza de inmediato tras el muestreo). Tras el muestreo de la zona del bex para la fijacin y del muestreo de tejido fresco, la parte ms grande del tejido enceflico se coloca, de hecho, en unos 4-6 litros del fijador formalina al 10%, que deben cambiarse dos veces a la semana. Tras la fijacin durante 2 semanas, si es necesaria ms investigacin, pueden realizarse cortes coronales del encfalo. Puede reducirse el tiempo de fijacin cortando en trozos transversales ms pequeos el tronco enceflico fresco (separado del resto del encfalo), de forma similar a la extraccin inicial de la regin del bex, pero dejando intactas las reas transversales que son importantes para el diagnstico a nivel de los pednculos cerebelares y los tubrculos cuadrigminos superiores (figura 1a y b. niveles BB y CC, respectivamente). En funcin de otros factores (temperatura, agitacin, espesor del bloque de tejido, utilizacin de microondas) el tiempo de fijacin de estos trozos ms pequeos de encfalo puede reducirse. No obstante, la evaluacin de los efectos de estos tipos de procesos de fijacin acelerada en los protocolos posteriores de IHC tiene que satisfacer los estndares de eficiencia analtica. Las otras partes del encfalo fijadas en formol pueden utilizarse para el diagnstico diferencial tras terminar la fijacin estndar de 2 semanas.



Fig 1. El tronco enceflico tras retirar el cerebelo, caras a) dorsal, y b) lateral. Niveles recomendados a los que deben tomarse los cortes:

A-A = bulbo raqudeo, en el bex; B-B = bulbo raqudeo a travs de los pednculos cerebelares caudales; C-C = mesencfalo a travs de los tubrculos cuadrigminos superiores.

Cuando en un pas en particular se detecta la presencia de EEB en la poblacin de ganado bovino autctono, con evidencias de que la distribucin de las lesiones y otros determinantes fenotpicos coinciden con los descritos para la EEB clsica, a efectos de confirmacin y control de la enfermedad es adecuado, aunque no ideal, extraer tan solo el tronco enceflico.

Esto puede realizarse por el agujero occipital sin extraer la bveda craneal (Fig. 2). Esto reducir la cantidad de fijador necesario y el tiempo y equipo exigidos, disminuyendo as los costes y mejorando la seguridad. De esta forma se pueden mantener las principales zonas objeto del examen histolgico. Este mtodo permite recoger y examinar un gran nmero de muestras para la vigilancia pasiva o para un programa de vigilancia activa en mataderos. El tronco enceflico se disecciona por el agujero occipital sin abrir el crneo por medio de un instrumento en forma de cuchara especialmente diseado, con bordes afilados alrededor del cuenco poco profundo. Este tipo de instrumentos se comercializan. Es posible que sean necesarias variaciones en la tcnica, como la orientacin, en funcin de las distintas formas de instrumental, y es importante formar a los tcnicos sobre la utilizacin del equipo convenido. Esta formacin deber incluir informacin sobre de la distribucin de la PrPSc en los cortes transversales del tronco enceflico, y la necesidad de realizar un muestreo exacto y de conservar las zonas objeto de diagnstico (vase abajo). En condiciones de matadero se ha observado que tambin es posible obtener la expulsin del tronco enceflico intacto por el agujero occipital, en buenas condiciones para el examen histolgico, aplicando presin (aire o agua) (Hejazi & Danyluk, 2005) por la herida de entrada en el crneo cuando se utiliza aturdimiento penetrante en el sacrificio. Es evidente que la viabilidad y eficacia de este mtodo dependern del mtodo de sacrificio, y que antes de implementarlo de modo sistemtico se precisar un anlisis local del riesgo.

Cuando el caso inicial se identifique mediante una vigilancia activa, probablemente no se disponga de las zonas enceflicas necesarias para una completa caracterizacin fenotpica. En la mayora de pases, solo se toma el tronco enceflico, incluso antes de que se confirme por primera vez la EEB. Deben guardarse cabezas muestreadas en el curso de la vigilancia activa hasta que se conozcan los resultados de las primeras pruebas. Ello permitira un muestreo exhaustivo del encfalo de animales positivos en retrospeccin para la caracterizacin de casos. Esto es especialmente importante si se utilizan pruebas internas que no estn sujetas a una garanta de calidad externa y cuando, en ausencia de una comparacin directa con los mtodos aqu descritos, se dice que se han identificado nuevos fenotipos. Cuando se utilizan inmunoanlisis rpidos como herramienta principal de vigilancia, es necesario disponer de material para un posterior examen morfolgico (incluida una inmunohistoqumica) y molecular que permitira la identificacin del fenotipo de la enfermedad en ausencia de un diagnstico de EEB previo en ese pas.



Fig. 2. Despus de separar la cabeza del cuerpo mediante un corte entre la vrtebra atlas y los cndilos occipitales del crneo, se coloca en un soporte con la superficie ventral hacia arriba (A), con el extremo

caudal del tronco enceflico (bulbo raqudeo) visible por el agujero occipital (vase B, un dibujo ampliado del crneo). Se inserta el instrumento (C) a travs del agujero occipital entre la duramadre y la cara

ventral/dorsal (dependiendo del enfoque especfico) del bulbo raqudeo y se desplaza hacia adelante en sentido craneal, manteniendo la parte convexa del instrumento apoyada contra el hueso craneal y realizando con ella un movimiento rotatorio de un lado a otro. Con ello se separan las races de los nervios craneales sin daar el tejido enceflico. De este modo se hace avanzar al instrumento en

sentido rostral hasta una distancia de aproximadamente 7 cm en esa direccin y luego se realiza un movimiento angular abrupto (es decir, hacia el plano dorsal/ventral del tronco enceflico, dependiendo

del enfoque) cortando y separando el tronco enceflico (con algunos fragmentos del cerebelo) del resto del encfalo. El instrumento, que se mantiene en ngulo, a continuacin se retira del crneo para extraer

el tejido por el agujero occipital.

Muestreo del tronco enceflico para la vigilancia activa utilizando pruebas rpidas

El muestreo y procesamiento de tejido enceflico para uso en pruebas rpidas debe ajustarse estrictamente a las especificaciones proporcionadas por el proveedor o fabricante del mtodo o kit de la prueba. Los detalles de ese procedimiento varan de un mtodo a otro, pero tales cambios no deben aplicarse sin datos de validacin facilitados por el fabricante que avalen la variacin de la metodologa. La muestra preferida para el enzimoinmunoensayo debe estar en el bex o a 1,0 cm de distancia anterior o posterior del mismo, situado en la zona anteroposterior a los lugares clave a estudiar (Fig. 3) para la demostracin de cmulos de PrPSc y la evaluacin del muestreo para las pruebas rpidas. Al elegir el punto objeto de estudio es necesario tener en cuenta el siguiente mtodo de confirmacin. Debe mantenerse intacto al menos un semicorte del bulbo raqudeo a nivel del bex para la fijacin para la inmunohistoqumica/histologa (como se describe anteriormente) por si un resultado positivo requiere confirmacin. El muestreo del bulbo raqudeo anterior o posterior al bex para las pruebas rpidas no compromete el examen mediante histologa o IHC. Sin embargo, para obtener muestras comparables para las pruebas rpidas y confirmativas, es preferible un muestreo mediante semicorte del bulbo raqudeo a nivel del bex. A pesar de la consecuente prdida de capacidad de evaluacin de la simetra de cualquier lesin histopatolgica (considerable vacuolacin), este enfoque es menos probable que comprometa el examen mediante IHC, que es ms importante. No obstante, si se opta por un semicorte, es fundamental garantizar que los puntos objeto de estudio no queden comprometidos en ninguna muestra. Por ejemplo, el ncleo solitario y el ncleo motor dorsal del nervio vago (zonas objeto de estudio para las lesiones del ganado bovino con EEB) son pequeos, y quedan relativamente cerca de la lnea media (Fig. 3). Si el tejido muestreado se autolisa hasta el punto de que no es posible orientarse anatmicamente, puede tomarse y analizarse una alcuota sin identificar. En estos casos, un resultado positivo sigue siendo un resultado vlido, pero un resultado



negativo no indicar que el animal es negativo, y deber interpretarse con cautela y comunicarse con la adecuada cualificacin.

Fig 3. Corte transversal del tronco enceflico bovino a nivel del bex identificando los puntos clave objeto de estudio para el

diagnstico mediante histopatologa e inmunohistoqumica en la EEB. Son principalmente el tracto solitario [1] y el ncleo de la va medular del nervio trigmino [2]; pero tambin el ncleo motor dorsal

del nervio vago [3]. Por tanto, el material tomado para la aplicacin de una prueba rpida tambin debe incluir estas zonas.

Un semicorte inexacto puede conllevar la prdida total de una zona objeto de estudio para la prueba confirmativa, y podra comprometer un programa de vigilancia. Una mala colocacin de las herramientas de muestreo correspondientes tambin podra conllevar un muestreo inadecuado de las zonas objeto de estudio. Por tanto, estos enfoques deben implementarse con una poltica muy clara y un programa de seguimiento para la formacin y la garanta de calidad de los procedimientos de muestreo, incluida la posicin anatmica, y no solo el peso de la muestra. Debido a la distribucin especficamente buscada de PrPSc, el tamao y ubicacin de la muestra deben ser los descritos en el kit de diagnstico o, si no se especifica, al menos deben tomarse 0,5 g de las zonas objeto de estudio diagnstico para todas las pruebas confirmativas, como se detalla en la Fig 3. Las caractersticas de rendimiento de las pruebas podran resultar comprometidas por la autolisis, en concreto debido a la prdida de capacidad de garanta de inclusin de las zonas objeto de estudio en la muestra tomada de las zonas objeto de estudio diagnstico detalladas en la Fig 3.

b) Examen diagnstico

b) Examen histolgico

La histopatologa ya no es el mtodo diagnstico de eleccin para el estudio de animales sospechosos ni para la deteccin de casos en poblaciones sanas. Sin embargo, es importante tener en cuenta los cambios histopatolgicos, a fin de facilitar la deteccin de casos durante la realizacin de exmenes histolgicos para el diagnstico sistemtico de encfalos bovinos muestreados por motivos distintos del anlisis de la EEB. Para el diagnstico diferencial, se realizan cortes de bulbo raqudeo-bex de 5 m de espesor y se tien con hematoxilina y eosina (H&E). Si la calidad del tejido lo permite, el examen histopatolgico de cortes teidos con H/E permite la confirmacin de las alteraciones neuropatolgicas de la EEB (Simmons et al., 1996; Wells & Wilesmith, 1995) mediante el cual la enfermedad se detect por primera vez como encefalopata espongiforme. Esos cambios influyen, sobre todo, en el cambio espongiforme y la vacuolizacin neuronal, y son muy similares a los de otras EET de los animales, pero la frecuente vacuolizacin neuroparenquimatosa en ciertos ncleos anatmicos del bulbo raqudeo a nivel del bex proporciona una forma satisfactoria de establecer un diagnstico histopatolgico con un solo corte de bulbo raqudeo. Como en otras especies, las alteraciones vacuolares del encfalo bovino, en concreto las vacuolas del interior de los pericariones de los ncleos rojo y oculomotor del mesencfalo son un hallazgo casual (Gavier-Widen et al., 2001). Por tanto, el diagnstico histopatolgico de la EEB debe basarse en la mera presencia de neuronas vacuoladas, en concreto en estas ubicaciones anatmicas.



Con independencia del diagnstico histopatolgico, tambin se utiliza sistemticamente la inmunohistoqumica, ya que pruebas no publicadas sugieren que incluso un 5% de los casos clnicos sospechosos (que son negativos a alteraciones vacuolares en el bex en el examen de los cortes teidos con H/E) pueden diagnosticarse mediante examen por IHC. Es evidente que el examen del bulbo raqudeo-bex no permite un examen neuropatolgico completo para el diagnstico diferencial, ni permite una caracterizacin fenotpica exhaustiva de ninguna EET. Por ello, se recomienda tomar encfalos enteros de todos los casos clnicos sospechosos. Todava no se dispone de datos suficientes para describir las caractersticas histopatolgicas concretas de la EEB tipo H o L. En la BASE (EEB tipo L) se dispone de algunos datos histolgicos de investigadores italianos (Casalone et al., 2004). En la vigilancia pasiva se encuentran unos pocos casos atpicos de EEB y no se pueden obtener encfalos enteros en la vigilancia activa para aumentar nuestros conocimientos en este campo. El mal estado del encfalo del ganado que ha muerto en la explotacin, entre el cual se han identificado la mayora de casos atpicos, tambin descarta un examen histolgico completo por los efectos de la autolisis. En algunos pases se estn llevando a cabo estudios de transmisin experimental de EEB tipos L y H a terneros y ganado bovino adulto, y ello debera posibilitar comparaciones histolgicas con los datos acumulados ya obtenidos para la EEB clsica.

ii) Deteccin de formas de PrP especficas de la enfermedad

La utilizacin universal de mtodos de deteccin de la PrP proporciona un medio de diagnstico de la enfermedad concreta independiente de las alteraciones morfolgicas definidas por histopatologa. Muchos laboratorios ahora completan o han sustituido el examen histopatolgico por la IHC y/u otros mtodos de deteccin de la PrP. La deteccin de acumulaciones de PrPSc es el enfoque de eleccin para los programas de vigilancia y el diagnstico confirmativo. Es posible (aunque no deseable) llevar a cabo una inmunohistoqumica para la PrP con material que se haya congelado antes de la fijacin (Debeer et al., 2002). La congelacin previa a la fijacin no comprometer la inmunoreactividad de una muestra, pero podra comprometer la identificacin de las zonas objeto de estudio. Un caso positivo dar positivo en el inmunomarcaje especfico de enfermedad (Casalone et al., 2006) en al menos una de las zonas objeto de las pruebas diagnsticas. Para diagnosticar un caso como negativo, debe ser posible identificar la presencia de las zonas objeto de estudio y demostrar que la ejecucin de la IHC funcionaba tcnicamente en controles adecuados. Si no hay inmunomarcaje especfico de la enfermedad, y no pueden identificarse zonas objeto de estudio, el caso se deber clasificar como "no confirmado", por oposicin a negativo. Tanto las variantes tipo H como las variantes tipo L presentan acumulacin de PrPSc en el bulbo raqudeo a nivel del bex (Casalone et al., 2006; Gavier-Widen et al., 2008; y el Laboratorio de Referencia de la OIE del Reino Unido). El intervalo y el aspecto morfolgico del inmunomarcaje por todo el eje cerebromedular difieren, en concreto en el tipo L, cuando la PrPSc es ms abundante en las zonas corticales frontales, y tiende a tener lugar en forma de mltiples depsitos tipo placas pequeas.

Mtodos inmunohistoqumicos (IHC)

La determinacin de una acumulacin de PrPSc mediante IHC se lleva a cabo en el mismo material incluido en parafina y fijado en formalina que el utilizado para el diagnstico histopatolgico. Se han aplicado con xito distintos protocolos a la deteccin de PrPSc mediante IHC para el diagnstico de la EEB y aunque parecera deseable disponer de un mtodo de IHC estandarizado, podra ser ms importante reconocer mtodos robustos que logren un resultado estandarizado, ya que se realiza un seguimiento de los mismos mediante la participacin en ejercicios de anlisis de la eficiencia, y mediante la comparacin con los resultados de un mtodo modelo estandarizado en un Laboratorio de Referencia. La tcnica genrica establecida para la histopatologa sigue aplicndose y funciona bien en tejidos autolisados en los que ya no puede realizarse una evaluacin morfolgica (Monleon et al., 2003). No obstante, es indispensable reconocer la anatoma de la muestra para determinar si contiene o no zonas objeto de estudio. Esto es crucial para un diagnstico negativo, y tambin podra ser fundamental para interpretar correctamente un inmunomarcaje dudoso. La deteccin de acumulaciones de PrPSc mediante IHC tiene una sensibilidad cercana a la de la transferencia Western para la deteccin de PrPSc (Schaller et al., 1999). Junto con unas buenas preparaciones histolgicas, la inmunohistoqumica permite la deteccin de acumulaciones de PrPSc y estas, como la patologa vacuolar, presenta un patrn de distribucin y un aspecto tpicos. Esto permite la evaluacin o confirmacin simultnea de este aspecto del fenotipo de la enfermedad. En los Laboratorios de Referencia de la OIE se dispone de los mtodos actuales.

Contrariamente a lo que ocurre con el diagnstico del prurigo lumbar de las ovejas, la escasa deteccin de PrPSc en tejidos linfoides en la EEB no proporciona ninguna oportunidad de utilizar este tipo de tejidos para el diagnstico preclnico mediante biopsia.

Mtodos de transferencia Western

Las tcnicas de inmunoelectrotransferencia se llevan a cabo con tejido fresco (sin fijar), y pueden aplicarse con xito incluso cuando el tejido est autolisado (Hayashi et al., 2004). La inmunoelectrotransferencia SAF (Laboratorio de Referencia de la OIE del Reino Unido) fue el primero de este tipo de mtodos utilizado en el diagnstico de la EEB. Tiene una sensibilidad diagnstica similar a la de las tcnicas de IHC, y sigue siendo el mtodo de eleccin, junto con la inmunohistoqumica, para la confirmacin de la EEB. Es un mtodo muy



sensible cuando se utiliza una gran masa (lo ideal es que sea de entre 2 y 4 g) del material de partida, y varios pasos para concentrar la PrPSc. Ahora se dispone de mtodos alternativos ms rpidos y baratos. Estos precisan menos material y son ms prcticos, pero en los casos en que la cantidad de PrPSc se encuentra a muy bajas concentraciones, pueden ser menos sensibles. La mayora de estas tcnicas se basa en una precipitacin de la PrPSc utilizando cido fosfotngstico (PTA) u otras sustancias qumicas, y algunas se comercializan. En la pgina web del Laboratorio de Referencia de la OIE del Reino Unido o de otros Laboratorios de Referencia de la OIE para la EEB se detallan varios mtodos de inmunoelectrotransferencia Western.

Aunque la metodologa de la transferencia Western ahora en general se utiliza en todo el mundo, cuando se utiliza para detectar PrPSc la sensibilidad analtica vara de forma importante entre mtodos y laboratorios. Cuando a efectos de confirmacin del diagnstico se prefieren mtodos internos a los publicados, es importante que se evalen para comprobar si son adecuados para el fin deseado y que se validen previa consulta a un Laboratorio de Referencia de la OIE.

Mtodos analticos rpidos

Se han elaborado tcnicas de transferencia Western, dispositivo de flujo lateral (LFD) y ELISA rpidas que permiten analizar un gran nmero de muestras de encfalo y que se comercializan. Estas tcnicas se pueden ejecutar en pocas horas (vanse las evaluaciones EC de pruebas rpidas para la deteccin de EEB realizadas en grupos de muestras que se saba que eran positivas o negativas segn la IHC [Laboratorio de Referencia de la OIE en el Reino Unido]). Las pruebas que se han evaluado y aprobado para la vigilancia de la EEB dentro de la UE se detallan en la lista del Anexo C Captulo X del Reglamento sobre las EET (Reglamento CE n 999/2001 y enmiendas siguientes). En la pgina web del Laboratorio de Referencia de la OIE del Reino Unido se detalla el mtodo de utilizacin de estas pruebas.

Aunque muchos pases, as como un Grupo ad hoc de la OIE sobre pruebas de EEB, acepta la aprobacin de la UE como indicador del rendimiento analtico, otros han establecido sus propios mecanismos de evaluacin, entre los que destacan EE.UU., Canad y Japn (Laboratorio de Referencia de la OIE en el Reino Unido; protocolos de Canad para la vigilancia de la EEB3; National Veterinary Ensayo Laboratory, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries, Outline of Regulation System of Veterinary Drugs in Japan4). La OIE tambin dispone de un proceso de aprobacin, y los protocolos para estas evaluaciones se indican en la pgina web de la OIE: Validacin y certificacin de Pruebas de Diagnstico5), y el proceso de aprobacin por parte de la UE se ha aceptado como mtodo de referencia para futuras evaluaciones por su sensibilidad y especificidad.

Las sensibilidades relativas de las pruebas rpidas, la inmunohistoqumica y otros mtodos confirmativos no se han determinado por completo porque, por definicin, no todas las pruebas pueden aplicarse a muestras idnticas, y la distribucin anatmica de la PrPSc es variable. (Existe el acuerdo de que pueden utilizarse homogenados de tejido o mezclas de tejido finamente troceado y proporcionar cierta informacin, para determinados tipos de pruebas). Reconocer esto es especialmente importante al evaluar el rendimiento de las pruebas rpidas cuando se analizar animales que no presentan signos clnicos de EEB y probablemente tienen depsitos de PrPSc inferiores, que el ganado bovino con la enfermedad ms avanzada. Las evaluaciones que se llevaron a cabo inicialmente en la UE se limitaron a una comparacin del examen de una muestra de encfalos de ganado bovino identificados como animales clnicamente sospechosos con alteraciones histopatolgicos caractersticas de EEB y una muestra de encfalos de ganado bovino de Nueva Zelanda que no haban estado expuestos a la EEB y que eran histopatolgicamente negativos. En estudios posteriores se ha llevado a cabo la evaluacin mediante estudios de campo de posibles nuevas pruebas en comparacin con mtodos que ya estn aprobados. Todos los resultados incongruentes se resolvieron mediante varios enfoques confirmativos en un Laboratorio de Referencia de la OIE. Las pruebas rpidas proporcionan un medio de deteccin inicial para animales que se encuentran en los ltimos meses del periodo de incubacin (Arnold et al., 2007), por ejemplo en estudios de material post-mortem recogido de ganado bovino sacrificado de la forma habitual. En pases que llevan a cabo vigilancia para la deteccin de casos nuevos de EEB y en los que se considera necesario un medio de evaluacin de la prevalencia de la EEB independiente del sistema de notificacin de casos sospechosos, estas pruebas de deteccin ofrecen un enfoque eficiente. Desde su introduccin para la deteccin activa en Europa desde enero de 2001, estas pruebas han sido las responsables de la identificacin de la mayora de animales infectados por EEB y constituyen la prueba principal de eleccin. No obstante, la confirmacin de un diagnstico de EEB tericamente requiere el examen de encfalo fijado mediante inmunohistoqumica o la aplicacin de un protocolo de transferencia Western adecuado. En 2006, la OIE acept que mediante su utilizacin en programas de vigilancia activa, las pruebas rpidas comerciales han demostrado ser muy eficaces y constantes, siempre que se lleven a cabo por parte de personal adecuadamente formado. Ciertamente, a veces pueden ser superiores a las pruebas estndar reconocidas para la comparacin si la formacin y la

3 http://www.inspection.gc.ca/english/anima/disemala/bseesb/surv/protoce.shtml 4 http://www.maff.go.jp/nval/english/pdf/outline080514.pdf 5 http://www.oie.int/vcda/eng/en_background_vcda.htm



experiencia relativas a estas ltimas son deficientes. En tales circunstancias, ahora se considera aceptable, a efectos del diagnstico, aunque no sea lo ideal para la caracterizacin, utilizar las pruebas rpidas tanto para la deteccin primaria en programas de vigilancia activa o pasiva como para la posterior confirmacin. No obstante, es fundamental asegurarse de que la eleccin de las pruebas principal y secundaria son compatibles, y no suponen riesgo de generar falsos positivos por el hecho de compartir reactivos. Como consecuencia, en la pgina web del Laboratorio de Referencia de la OIE del Reino Unido se mantendrn publicadas cules son las combinaciones analticas de preferencia, con el fin de ayudar a los que deseen utilizar este enfoque en lugar de la histopatologa y la inmunohistoqumica, o bien la inmunoelectrotransferencia SAF para la confirmacin. La combinacin de pruebas debe incluir un mtodo de transferencia Western para generar datos complementarios tiles que ayudarn en la caracterizacin fenotpica de la muestra en ausencia de un examen de tejido fijado. La confirmacin debe llevarse a cabo en un Laboratorio de Referencia Nacional.

La combinacin de las dos pruebas rpidas solo puede utilizarse para la confirmacin de un caso de EEB. Un resultado negativo en la prueba secundaria es insuficiente para definir un caso como negativo tras un resultado positivo en la prueba principal. Por tanto, los casos sospechosos de EEB con resultados discordantes en la prueba rpida deben volver a analizarse mediante la inmunoelectrotransferencia SAF (o una alternativa aprobada) o IHC para demostrar la PrPSc o, en el caso de que no se disponga de estos mtodos, mediante histopatologa. Si la histopatologa no es capaz de confirmar le resultado inicial, las muestras deben enviarse a un Laboratorio de Referencia de la OIE para que vuelvan a ser analizadas.

Aunque los programas de evaluacin de las pruebas llevados a cabo en Europa se realizaron para respaldar la legislacin europea sobre vigilancia de la EEB, las consecuencias tambin son importantes para otros pases. Las consecuencias de los falsos positivos o negativos son tan importantes que la introduccin de pruebas nuevas debe ir respaldada por una exhaustiva evaluacin del rendimiento de las mismas. Las pretensiones de los fabricantes deben basarse en datos, evaluados preferiblemente por terceros. Es importante destacar que el proceso de validacin completa de todos estos mtodos de diagnstico de la EEB ha sido limitado debido a la falta de un verdadero mtodo de referencia y la consecuente necesidad de aplicar estndares de comparacin basados en estudios relativamente pequeos. Por tanto, sigue habiendo una necesidad de publicacin de estudios a mayor escala de rendimiento de las pruebas, y ninguno de los datos publicados hasta ahora se puede equiparar con procedimientos reconocidos de validacin de las pruebas utilizadas para otras enfermedades.

d) Otras pruebas de diagnstico

La observacin de las fibrillas caractersticas, el homlogo bovino del SAF (vase el Captulo 2.7.12 Prurigo lumbar), mediante microscopa electrnica de tincin negativa en extractos detergentes de tejido de encfalo o medula espinal frescos o congelados se ha utilizado como mtodo adicional de diagnstico para la EEB y ha sido til en concreto cuando la histopatologa se haba descartado por la aparicin de descomposicin post-mortem. Con modificacin, el mtodo podra aplicarse con xito a tejido fijado con formalina (Chaplin et al., 1998). Se ha observado que la deteccin de fibrillas se correlaciona bien con el diagnstico histopatolgico de EEB, pero no ofrece la sensibilidad que ofrecen la IHC o la inmunoelectrotransferencia. Puede demostrarse infectividad por EEB mediante inoculacin de ratones con tejido enceflico de ganado bovino afectado y en fase terminal, pero el bioanlisis no es prctico para el diagnstico sistemtico por el largo periodo de incubacin. Sin embargo, en ausencia de un agente fsico aislable, es el enfoque ms cercano a un mtodo de referencia para la caracterizacin de las cepas el que tiene que basarse en las propiedades biolgicas secundarias en un hospedador estandarizado. Los ratones transgnicos, como los que sobreexpresan el gen bovino de la PrP, ofrecen bioanlisiss con periodos de incubacin cortos para la EEB, pero hasta ahora ninguno de ellos constituye una herramienta prctica de diagnstico.

Sigue habiendo la necesidad de una prueba en animal vivo para la EEB con una sensibilidad capaz de detectar la PrPSc a concentraciones bajas al principio del periodo de incubacin de la enfermedad. Por el momento no se ha comprobado la eficacia de los posibles mtodos. La UE sigue comprometida a evaluar pruebas in-vivo, y dispone protocolos para la evaluacin de estas pruebas (Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA). Opiniones del Comit Cientfico sobre Riesgos Biolgicos (http://www.efsa.europa.eu/EFSA/efsa_locale-1178620753812_1178620776473.htm). La deteccin de ciertos marcadores proteicos de neurodegeneracin, incluida la apolipoprotena E (Apo E), la protena 14-3-3 y las protenas S-100 en el lquido cefalorraqudeo no se ha comprobado que sean tiles para el diagnstico de casos preclnicos de EEB. El potencial de diagnstico de la observacin de cadenas ligeras de IgG como marcador sustitutivo de la infeccin por priones en la orina de hmsteres infectados por prurigo lumbar, no se ha estudiado a efectos del diagnstico de la EEB.

e) Disponibilidad de reactivos y kits de diagnstico



Como se ha explicado anteriormente, se han autorizado kits de diagnstico para su uuso en muchos pases, y se comercializan reactivos, que tambin pueden adquirirse en Laboratorios de Referencia de la OIE y otros que dispongan de un programa de EET.

2. Pruebas serolgicas

Los agentes infecciosos de enfermedades causadas por priones no pueden cultivarse fcilmente in vitro y no inducen una respuesta inmunitaria importante en el hospedador.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS

Actualmente no se dispone de ninguna vacuna.

BIBLIOGRAFA

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NB: There are OIE Reference Laboratories for Bovine spongiform encephalopathy (see Table in Part 3 of this Terrestrial Manual or consult the OIE Web site



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NB: Existen Laboratorios de Referencia de la OIE para la encefalopata espongiforme bovina (vase la tabla de la parte 3 de este Manual Terrestre o consltese la lista ms actualizada en la pgina web de la OIE:

www.oie.int).

2.04.06_bse encefalopatia espongiforme bovina

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