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Prolonged morphine administration alters protein
expression in the rat myocardium
Juliana MolinaCarolina MadridTercer semestre
INTRODUCTION
Morphine: is a potent opiate analgesic medication. agonist at μ opioid receptors coupled to G protein
Acts opening voltage-dependent potassium channel and closing calcium-dependent causing hyperpolarization and reduced excitability of the neuron.
Analgesia is due to changes in the perception of pain at the spinal level
Miocardyum: involuntary striated muscle
• Protein expression: DNA ProteinRNA
Morphine can induce changes in cell metabolism that coudl eventualy modify the expression of certain proteins, in this particular case, myocardium.
GENERAL OBJETIVE
The main aim of the study was to asses the presumed effect of prolonged treatment with high dosis of morphine in male rast on myocardial protein expression
METODOLIGÍA
MATERIALES
• acrilamida y bis-acrilamida• SYPRO: ruby stain from molecular probes• Membrana de nitrocelulosa• Inmobilune DryStrips • Buffer de pharmalyte• Anticuerpos secundarios anti-rabbit marcados con peroxidasa de rabano• Anticuerpos primarios rabbit
METODOLIGÍA
ANIMALES Y TRATAMIENTO CON MORFINA
Ratas albinas adultas
Cámaras de
plexiglas
Ciclo de 12 horas
luz/oscuridad
Agua y comida
3 a 4 por
camara
Inyección intramuscular
• Grupo CON: solución salina
• Grupo MOR: morfina- 10mg/Kg por 10 dias
• Naloxona: 10mg/Kg por 10 dias
• Naxolona + morfina: 10mg/Kg por 10 dias
METODOLIGÍA
ANIMALES Y TRATAMIENTO CON MORFINA
Sacrificio de animales Dislocación cervical- 24 horas después ultima dosis
Extirpación- disección corazón
Congelamiento en nitrógeno liquido y almacenado a -80°C
Experimento con retiro de la dosis Animales sacrificados 3 días después de ultima dosis
METODOLIGÍA
FRACCIONAMIENTO DE TEJIDO CARDIACO
Muestras congeladas de ventrículo izquierdo 10 volúmenes de TMES buffer+ coctel inhibidor de proteasa
Corte en pedazos y homogenización Suspensión
homogenización
Centrifugación
Supernadante postnuclear (PNS)
Para remover tejidos y fragmentos nucleares
METODOLIGÍA
FRACCIONAMIENTO DE TEJIDO CARDIACO
PNS Aplicado a solución percoll 18% en buffer TMES
Centrifugación Parte opaca
parte translucida centrifugación
Membrana del plasmaFracción citosolica
mitocondria
Dilución en buffer TMECentrifugaciónResuspensiónCongeladoAlmacén alícuotas
METODOLIGÍA
ELECTROFORESIS E INMUNOBLOT
Muestras de proteína Solubilizadas en laemmli buffer
Gel de poliacrilamida 10%
Transferencia a membranas de nitrocelulosa
Bloqueo de membranas con leche descremada seca al 3%
Sonda con anticuerpos Inmunoblot- análisis y cuantificación
METODOLIGÍA
ELECTROFORESIS E INMUNOBLOT
inmunoblot:
las proteínas de extractos celulares son separadas por electroforesis en gel según tamaño por medio de SDS-PAGE poliacrilamida gel electroforesis cargado negativamente. Después las proteínas van a un filtro incubado con anticuerpos que reaccionan con la proteína especifica. El anticuerpo unido al filtro se detecta.
METODOLIGÍA
ANALISIS PROTEOMICO
Precipitación de la fracción citosolica, mitocondrial, membrana
Proteínas se pusieorn en gradientes lineares de pH 4-7
Se separaron con multiphor apparatus
2 equilibrios con buffer EQ
Separación 2D en gel poliacrilamida 10% teñidos con SYPRO ruby
cuantificación de la densidad de los puntos con software PDQuest
Proteínas alteradas se identificaron con 4800 plus MALDI TOF/TOF análisis
METODOLIGÍA
MISCELANEA
La concentración de proteínas fue determinada por método BCA
Los geles proteomicos de referencia 2D se establecieron haciendo un por medio de 12 replicas de cada grupo
CONCLUSIONS
• Prolonged Morphine administration can caused oxidative stress and cardioprotective effect by binding with opioid receptor. The mechanism of action would be important at the time to seek for drug interactions that may increase or reduce the benefit.
• the myocardium responds to oxidative stress by increasing the synthesis of several proteins with a protective role.
• Morphine is used for treatment in many diseases, molecular studies provide insights into the behavior and cellular response of different tissues of the body in a prolonged administration, this knowledge allows a better approach in the treatment of patients.
• Molecular studies should be made in order to find a way to induce the same protective response in the cell without the need of the constant stim from the drug. this would be really important in the treatment of some patients beacuse dosis decreases or may even disappear