4 fluorescenza in stato stazionario
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4 Fluorescenza in stato stazionario. Condizioni fotostazionarie. k r. M+h n ’. k A. M+h n. M*. k nr. M. Si raggiunge (in pochi ns ) una condizione di equilibrio, in cui è eccitata una frazione costante di fluorofori . - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
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4Fluorescenza in stato
stazionario
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Condizioni fotostazionarie
M+hnM+hn’
M*M
kAkr
knr
rst
stArstrst
Anrr
A
st
st
stnrrstA
nrrA
kIMkkMkI
kkk
kMM
MkkMk
MkkMkdtMd
cost.
)(
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*
*
*
**
•Si raggiunge (in pochi ns) una condizione di equilibrio, in cui è eccitata una frazione costante di fluorofori.•L’intensità di fluorescenza è costante e proporzionale alla resa quantica.•Con le normali intensità delle lampade, questa frazione è sempre prossima a 0 (kA dipende dal flusso di fotoni)
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Il fluorimetroLampada
Monocromatore di eccitazione
Beam splitter
Lente
Lente
Monocromatore di emissione
lecc.
lem.
Campione
PMT“segnale”
PMT“riferimento”
Computer
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IStrumentazione
Fluorescenza in stato stazionario
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Sorgente
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Lampada ad arco ad alta pressione di xeno
• L’elevata tensione applicata agli elettrodi provoca una corrente.
• Il flusso di elettroni, urtando gli atomi del gas, li ionizza o li eccita.
• Il decadimento o la ricombinazione ione-elettrone generano l’emissione di luce.
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• Ad alta pressione (20-300 Atm). Può esplodere (non implodere).• Gli impulsi ad alta tensione (40000 V) necessari per accenderla
possono danneggiare l’elettronica. Va accesa per prima.• La lampada è in quarzo, per permettere il passaggio degli UV.
Questa radiazione però ionizza le molecole di ossigeno dell’aria, che a loro volta generano ozono (che va rimosso per non danneggiare l’ottica). Se la radiazione nel lontano UV non è necessaria, si aggiunge all’involucro uno strato in grado di bloccare questa radiazione (lampade ozone-free, molto comuni nei fluorimetri).
• Il picco a 467 nm viene comunemente utilizzato per calibrare il monocromatore di eccitazione.
0.0001
0.001
0.01
0.1
200 300 400 500 600 700 800
Inte
nsità
(u.a
.)
l(nm)
Lampada Xe (ozone-free)
467nm
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Rivelatore
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Rivelatore della fluorescenzaeffetto fotoelettrico
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Rivelatore della fluorescenzatubo fotomoltiplicatore (PMT)
•Effetto fotoelettrico•Emissione secondaria
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•I fotocatodi sono realizzati utilizzando metalli alcalini o semiconduttori.•L’efficienza fotoelettrica non è costante con l.
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Il PMT può rivelare un singolo fotone (106 e- per fotone)
Rivelazione analogica
Rivelazione digitale
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Rivelazione analogica
Rivelazione digitale
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Rivelazione digitale: maggiore sensibilità, intervallo dinamico più ristretto.
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Rivelazione digitaleSovrapposizione di impulsi
Durata impulsi 10-9-10-8 sLimite superiore 105-106 cps
nnn
NS
Per n=10000, S/N=100Limite inferiore 103-104 conteggi
Si può aumentare la sensibilità semplicemente aumentando il tempo di integrazione
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Distribuzione di Poisson• Consideriamo un fotomoltiplicatore esposto ad una sorgente di
intensità costante.• L’emissione (e la rivelazione) sono processi casuali.• Qual’è la distribuzione di probabilità dei fotoni rivelati in t secondi?• Definiamo Pn(t) come la probabilità che in un tempo t vengano
rivelati n fotoni. È questa la distribuzione che cerchiamo.• Definiamo k in base alla seguente equazione (sviluppo in serie):
P1(dt)=kdt+o(kdt)kdt
• Avremo P0(dt)=1-kdt• Calcoliamo ora la probabilità di non rivelare fotoni in un intervallo in
un intervallo finito t.
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Distribuzione di PoissonPer rivelare 0 fotoni in un tempo t, deve averne rivelati 0 nel tempo t-dt e 0 nel tempo dt
kt
dtdt
etP
kttPLnktLntPLn
ktPLntPLn
kdttPtdP
tkPdttdP
dttkPdt
dttPtP
dttkPdt
dttPtPkdtdttPdttPtP
kdtdttPdttPkdtdttPdtPdttPtP
)(
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0
0
0
00
0
0
00
0000
0
000
000
000000
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Distribuzione di PoissonTroviamo ora un’equazione analoga per Pn(t)
)()()(
)()()(
)()(lim)()(lim
)()()()()()()()(
)()()()()1)((
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1
1
100
1
1
1
1
110
tkPtkPdttdP
tPtPkdttdP
dttPdttPkdt
dttPtP
dttPdttPkdt
dttPtPkdtdttPkdtdttPdttPtP
kdtdttPkdtdttPdttPkdtdttPkdtdttP
dtPdttPdtPdttPtP
nnn
nnn
nndtnn
dt
nnnn
nnnn
nnn
nn
nnn
Quest’equazione differenziale lega Pn a Pn-1. Grazie ad essa ed al fatto che conosciamo P0, possiamo trovare la funzione di distribuzione.
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Distribuzione di PoissonIntegriamo l’equazione differenziale, moltiplicando per ekt
t
nktkt
n
t
nkt
nkt
t
nkt
nnkt
nktn
kt
nkt
nktnkt
nnn
dttPeketP
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tPkedttPde
tPketPkedttdPe
tkPtkPdttdP
01
'
01
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1
1
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kt
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0
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ktkt
tkt
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tP
2)(
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0
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2
ktn
n enkttP !)()(
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Distribuzione di PoissonCalcoliamo la media
ktektejktkte
nktktee
nktntnPtn ktkt
j
j
jkt
n
n
nktkt
n
n
nn
nn
01
1
10 )!()(
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!)()()(
k rappresenta il rate (medio) di rivelazione di fotoni!
Calcoliamo la deviazione standard
222
222
222
)()1()1(
)1(
ktktnnnnnn
nnnnnnnnnn
nn
n
n
22
0
2
2
22
20
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ktktj
j
jkt
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n
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n
nn
nn
nktktktktktktnnn 2222 )()()()1(
Media e deviazione standard sono uguali!
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nnn
NS
Il rapporto segnale-rumore aumenta con la radice di n
Se n è il numero medio di conteggi al secondo:
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