4. kromatografi
TRANSCRIPT
-
8/10/2019 4. Kromatografi
1/50
KROM TOGR FI
-
8/10/2019 4. Kromatografi
2/50
Literatur
Shriner, et.al, 2004, The SystematicIdentification of Organic Compounds,
edisi 8th,John Willeys & sons,
Singapore Sarker, S.D., et.al., 2006, Natural
Product Isolation, Humana Press,
New Jersey Gritter, R.J, et.al, 1991, Pengantar
Kromatografi, Penerbit ITB, Bandung
-
8/10/2019 4. Kromatografi
3/50
Pengertian
Stahl:
Kromatografi adalah metode fisiko-kimiauntuk memisahkan komponen
berdasarkan waktu tambat setiapkomponen diantara fase diam (FD) dan
fase gerak (FG)
Komponen A merambat lebih cepatdaripada komponen B karena waktu
tambat A lebih kecil dibandingkan waktutambat komponen B
-
8/10/2019 4. Kromatografi
4/50
Pengertian
Martin :
Kromatografi adalah metode fisikokimiauntuk memisahkan komponen
berdasarkan perbedaan pergerakansetiap komponen di antara fase diam
dan fase gerak
Komponen A merambat lebih cepat darikomponen B karena komponen A bergerak
lebih cepat daripada B
-
8/10/2019 4. Kromatografi
5/50
Pengertian
Kromatografi adalah pemisahan
komponen dalam larutan melaluidistribusi komponen secara selektif
di antara fase gerak (FG) dan fase
diam (FD).
-
8/10/2019 4. Kromatografi
6/50
Pemakaian kromatografi
Tujuan Kualitatif
Mendeteksi keberadaan senyawa dlm
sampel Menggambarkan kerumitan suatu
campuran
Dapat digunakan u/menetapakn pola
sidik jari suatu campuran
Co/ KKt, KLT, KG, KCKT
-
8/10/2019 4. Kromatografi
7/50
Tujuan Kuantitatif
Menunjukkan banyaknya masing2
komponen
Digunakan u/menetapkan kadar cuplikan Co/ KG dan KCKT
Tujuan Preparatif Digunakan untuk memperoleh komponen
dalam jumlah memadai (mgg) dalam
keadaan murni
-
8/10/2019 4. Kromatografi
8/50
Pengelompokkan
A. Berdasarkan FG
a) Kromatografi Cair
KLT KK
KKt
KCKT
b) Kromatografi Gas
GLC - GSC
B. Berdasarkan FD
a) Kromatografi Cair-
cair
KKt
b) Kromatografi Cair-
Padat
KLT KK
KCKT
-
8/10/2019 4. Kromatografi
9/50
Pengelompokkan..
C. Berdasarkan
Mekanisme
a) Krom. Partisi- KKt
b) Krom. Adsorpsi
- KLT - KGC
- KK - KCKT
D. Berdasarkan
Wadah FD
a) Krom. Cair Planar- KKt
- KLT
b) Krom. Cair Kolom
- KGC
- KK - KCKT
-
8/10/2019 4. Kromatografi
10/50
1. Kromatografi lapis tipis
2. Kromatografi kertas
-
8/10/2019 4. Kromatografi
11/50
1. Kromatografi lapis tipis
-
8/10/2019 4. Kromatografi
12/50
Mekanisme
Terjadi adsorpsisolut padaadsorben/FD
Terjadi kompetisi antara FG dan solut
untuk teradsorpsi pada adsorben/FD
Solut terdesorpsidari FD
Solut terelusi oleh FG/sistem cairan
pengembang (eluen)
-
8/10/2019 4. Kromatografi
13/50
Jenis lapis tipis
Plat penyangga
Kaca
Alumunium
Plastik
Adsorben
Silika gel
Alumina
Kiselguhr
Selulosa
-
8/10/2019 4. Kromatografi
14/50
Silika GEL (Si OH)
Bersifat Polar
Silika Gel G
Mengandungsenyawa pengikat
(Gypsum = CaSO4
5-15%)
Silika Gel S
Mengandung
pengikat (starch)
Silika Gel GF 254 Mengandung
pengikat (gypsum)
dan indikator
fluoresensi
anorganik yang dpt
berfluoresensi pada
254 nm
-
8/10/2019 4. Kromatografi
15/50
Silika gel H/silika
gel N
Tanpa senyawa
pengikat
Silika gel F 254 Mengandung
indikator fluoresensi
Silika gel PF254+365
Digunakan pada
pemisahan
preparatif danmengandung
indikator fluoresensi
-
8/10/2019 4. Kromatografi
16/50
Alumina
Bersifat kurang polar dibandingkansilika gel
Bisa bersifat basa, netral dan asam
Jenis: alumina G, F, H
-
8/10/2019 4. Kromatografi
17/50
Kiselguhr
Mgd SIO2> 89%,
Al2CO3, Fe2O3,
TiO2, CaO, MgO,Na2O, dll
Memiliki aktivitas
yang rendah
Selulosa
Mekanisme = KKt
Serat < KKt
Bercak < KKt
Waktu elusiAdsorben lain < selulosa< KKt
Tidak dapatmenggunakan
penampak bercak
H2SO4
-
8/10/2019 4. Kromatografi
18/50
Jenis adsorben / FD
Plat pra-lapis (Merck)
Serbuk silika gel
Plat dibuat dgn alat Stahl-Desaga
Dilakukan pada suhu kamar
Plat diaktifkan pada suhu 110oC,
selama 1 jam
-
8/10/2019 4. Kromatografi
19/50
Sistem Elusi / FG
Pelarut tunggal
Campuran pelarut
Hanya digunakan
untuk 1x
pengembangan /
elusi
Tjd perubahan
komposisi
Tgt kepolaransenyawa
-
8/10/2019 4. Kromatografi
20/50
Penampak Bercak
A. Pereaksi Semprot
Universal :
H2SO4 dgn konsentrasi 5-10% dalam
metanol
Uap I2
Ce2SO4
Spesifik
Dragendorff : u/alkaloid
AlCl3 : u/flavonoid
FeCl3 : u/ fenol
-
8/10/2019 4. Kromatografi
21/50
Penampak bercak
B. Lampu UV
Plat dg indikator fluoresensi
Solut dg ikatan rangkap
terkonjugasi menghslkan:
Backgroundberfluoresensi
Bercak gelap
Solut tanpa ikatan
rangkap terkonjugasimenghslkan :
Background
berfluoresensi
Warna bercak bbd dari
background
Plat tanpa indikatorfluoresensi
Beberapa solut
dapat
berfluoresensi
pada 254 & 366 nm
-
8/10/2019 4. Kromatografi
22/50
Arah Pengembangan/Elusi pada KLT
Menaik
Radial / Sirkular
-
8/10/2019 4. Kromatografi
23/50
Jenis Pengembangan/Elusi
Pengembangan
Tunggal
Sistem
pengembang: sama
ataupun berbeda
Pengembangan
Berganda
U/memperbaiki
pemisahan
Nilai Rf terlalu
rendah
Setelah plat dielusi
1x, dikeluarkan dari
bejana, keringkan,
elusi u/ke 2x
Sistem pengembang
: samaKepolaran pengembang meningkat
-
8/10/2019 4. Kromatografi
24/50
Jenis Pengembangan/Elusi
Pengembangan dua dimensi Sistem pengembang ke-1 bbd dari yang
ke-2
Arah pengembangan ke-2 berbeda 90odari arah pengembangan ke-1
Untuk menguji kemurnian isolat
1
2
-
8/10/2019 4. Kromatografi
25/50
WARNING !!
Untuk mengidentifikasi senyawajangan membandingkan harga Rf
hasil penelitian dengan Rf pada
literatur
-
8/10/2019 4. Kromatografi
26/50
Faktor yg Mempengaruhi Nilai Rf
Kejenuhan chamber
Adsorben
Suhu
Kelembaban Plat berupa pra-lapis
atau tidak
Ketebalan lapisan
Metode
u/mengaktivasi plat
Jarak bercak dari sisiplat
Jmlh plat dlm
chamber
Pengukuran bercak
Sistem pengembang
Kemurnian pelarut
pd sistempengembang
Konsentrasi sampel
(jmlh besar : tailing)
-
8/10/2019 4. Kromatografi
27/50
Penggunaan KLT
Analisis
Kualitatif
Pemantauan
komponen Kuantitatif
menentukan
jumlah /kadar
komponen
Preparatif
Mendapatkan
isolat murni
-
8/10/2019 4. Kromatografi
28/50
KLT-Preparatif
Menggunakan platpra-lapis untukpreparatif atau platyang dibuat dgn alat
Stahl-Desaga Ketebalan optimum :
11,5 mm
Sampel ditotolkan
sebesar 1-5 mmdalam bentuk pita
Hasil pemisahan:bbtk pita
-
8/10/2019 4. Kromatografi
29/50
KLT-Preparatif
Penampak bercak
Lampu UV
Pereaksi semprot
Pita yg mgdsenyawa kmdn
dikerok
Ekstraksi denganpelarut
Di bagian
pinggir plat Didapatkan isolat
-
8/10/2019 4. Kromatografi
30/50
2. Kromatografi Kertas
-
8/10/2019 4. Kromatografi
31/50
Mekanisme:
Partisisolut di antara FD dan FG
Fase Diam:
Berupa lapisan cairan tipis padapenyangga
Penyangga:selulosa (kertas whatman)
-
8/10/2019 4. Kromatografi
32/50
Fase gerak
B A W (4 : 1 : 5)
Air
Forestal
(HCl : asam asetat : air = 3:10:30)
Asam Asetat 250%
-
8/10/2019 4. Kromatografi
33/50
Penampak bercak
Pereaksi semprot spesifik atau lampuUV
Tidak dapat menggunakan pereaksi
semprot H2SO4
Arah Pengembangan
Pengembangan menaik (ascendingdevlpm)
Pengembangan menurun (descending
devlpm)
-
8/10/2019 4. Kromatografi
34/50
-
8/10/2019 4. Kromatografi
35/50
KLT vs KKt
Pemisahan padaKLT lebih baik dari
KKt
Waktu elusi KLT
KKt
-
8/10/2019 4. Kromatografi
36/50
1. Kromatografi kolom klasik2. Kromatografi cair vakum
3. Kromatografi cair tekanan menengah
4. Kromatografi cair tekanan tinggi
-
8/10/2019 4. Kromatografi
37/50
Hal2 yang penting:
Faktor kapasitasBerhubungandengan kemampuankolom untuk
menahan suatukomponen
Faktor pemisahan
Berhubungan dgn
selektivitas kolomuntuk memisahkansatu komponen dankomponen lainnya
Efisiensi kolomberhubungan dgnjumlah plat teoritisuntuk memisahkan
satu komponen dankomponen lainnya.
Resolusi
berhubungan dgn
kemampuan kolomuntuk memisahkansatu senyawa dansenyawa lainnya
-
8/10/2019 4. Kromatografi
38/50
Contoh Kromatogram HPLC
-
8/10/2019 4. Kromatografi
39/50
1. Kromatografi Kolom Klasik
Proses/mekanisme:
Adsorpsi, desorpsi, elusi (=
KLT), dan gravitasi
-
8/10/2019 4. Kromatografi
40/50
Adsorbent
Silika gel
Alumina
Selulosa Poliamida
Ukuran partikel
KK : 63250 m
KLT : < 63 m
Pemilihan eluen :
Berdasarkan literatur
Data hsl
pemantauan KLT
-
8/10/2019 4. Kromatografi
41/50
Menggunakan data pemantauan
KLT
Pilih eluen untuk KLT (2sistem pengembang:
lebih polar & kurang
polar)
Pilih eluen yg
menghasilkan Rf 0,2
0,3 pada KLT
Pilih eluen yg bersifat
kurang polar untuk
digunakan dalam KK
M t d P i K
-
8/10/2019 4. Kromatografi
42/50
Metode Penyiapan Krom
Kolom Metode kering
Adsorbent
dimasukkan ke
dalam kolom
Baru kmdn eluen
dimasukkan ke
dalam kolom
Metode basah
Masukkan
sebagian eluen ke
dalam kolom Tambahkan
lumpuran adsorben
ke dalam kolom
-
8/10/2019 4. Kromatografi
43/50
Penyiapan Kolom
Ketinggian Kolom
Pemisahan Normal:
10100 x dlm kolom
Pemisahan Sulit :
> 100 x dlm kolom
-
8/10/2019 4. Kromatografi
44/50
Penyiapan Sampel
Sampel dilarutkan dalam eluen
Sampel dilarutkan dalampelarut yang kurang polardibdgkan eluen
Dibuat serbuk
sampel+adsorbent
-
8/10/2019 4. Kromatografi
45/50
Jumlah sampel
Pemisahan Kasar
sampel : adsorben = 1:
10
Pemisahan Normal
sampel : adsorben = 1:
30
Pemisahan Sulit
sampel : adsorben = 1: 100 -
300
-
8/10/2019 4. Kromatografi
46/50
Metode Elusi
Elusi isokratik Menggunakan 1
pelarut
Elusi gradien Menggunakan
bermacam eluen
dgn kepolaran
meningkat
Pengumpulanfraksi
Warna
Volume Waktu
Pemantauan
Komponen
KLT/KKtfraksi yg mgd
senyawa yg sama
digabungkan
-
8/10/2019 4. Kromatografi
47/50
2. Kromatografi Cair Vakum
Proses/mekanisme:
Adsorpsi, desorpsi,
elusi danperbedaan
tekanan
?
-
8/10/2019 4. Kromatografi
48/50
AdsorbentKK : 63250 m
KCV : 4063 m
Eluen
menggunakaneluen dgn
kepolaran yangmeningkat
Contoh komposisi eluen:
N-hexEtOacMeOH
9 : 1 25 mL
8 : 2 25 mL
Dst
1 : 9 25 mL
10 : 0 25 mL9 : 1 25 mL
dst
0 : 10 25 mL
P i Ad b +
-
8/10/2019 4. Kromatografi
49/50
Penyiapan Adsorben +
Sampel Masukkan
adsorben ke dalam
kolom
Ketinggianadsorben 5-6 cm
(setelah divakum)
Sampel dibuat
serbuk bersamadgn adsorben
Pengumpulanfraksi
Setiap fraksi
dikumpulkan
Pemantauan :
KLT/KKt
fraksi yg mgdsenyawa yg sama
digabungkan
-
8/10/2019 4. Kromatografi
50/50
Alhamdulillah