BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan

perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada

kromatografi, komponen – komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase

yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran

sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen

yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen

yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat.

Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903, mencoba

memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom

yang berisi kapur (CaSO4). lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk

melukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada

waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan kromatografi

untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama

diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses kromatografi.

Penyelidikan tentang kromatografi menurun untuk beberapa tahun sampai

digunakan suatu teknik dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC).

Kemudian pada akhir tahun 1930-an dan permulaan tahun 1940-an,

kromatografi mulai berkembang. Dasar kromatografi lapisan tipis (KLT)

diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian

diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik sekali dari

Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel)

tidak hanya mengubah dengan cepat kroinatografi cair tetapi seperangkat

1

umum langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi

kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama

mengenai kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an

kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih.

Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas

berdiameter besar, pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis

lama dan segala prosedur biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun

1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan kromatografi

cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High Performance

Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi

atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed =

Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari

usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom

terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk

hasil keahlian membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan

tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik yang sudah matang dan dengan

cepat KCKT mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas.

Sekarang ini, kromatografi sangat diperlukan dalam memisahkan suatu

campuran senyawa.  HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang

dilakukan dengan memakai fase diam yang terikat secara kimia pada

penyangga halus yang distribusi ukuranya sempit ( kolom ) dan fase gerak

yang dipaksa mengalir dengan laju alir yang terkendali dengan memakai

tekanan tinggi sehingga menghasilkan pemisahan dengan resolusi tinggi dan

waktu yang relative singkat.

HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara

luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada

sejumlah bidang, antara lain : farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan

industri- industri makanan. Dalam makalah ini akan dijelaskan beberapa

2

keterangan tentang penggunaan HPLC ( High Performance Liquid

Chromatography).

B. Tujuan

Tujuan dari pembuatan makalah ini adalah untuk :

Untuk mengetahui prinsip kerja dari HPLC.

Untuk mengetahui kelebihan dan kekurangan metode analisis dengan

HPLC.

Untuk mengetahui tentang HPLC Fluoresensi.

Mengetahui tentang eksitasi molekul.

Untuk mengetahui bagaimana suatu senyawa dapat di deteksi dengan

detektor flourescen.

Untuk mengetahui senyawa apa saja yang dapat di analisa dengan

menggunakan detektor flourescen.

3

BAB II

TEORI DASAR

A. Pengertian Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga

disebut dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada

akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan

teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik

dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik. 

Sistem Peralatan HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak,

pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor,

wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau

perekam.

Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

4

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong

ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini

biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat

bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya

elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase

diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih

polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya

polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada

fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk

menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak

juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain

terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama

elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama

elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi

bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks

terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik

adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan

asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering

digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang

terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan

fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik

2. Pompa

Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang

mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert

5

terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja

tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu

memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan

kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus

mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.

Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah

untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat,

reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC

yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang

konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih

umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan

3. Tempat penyuntikan sampel

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase

gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat

penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi

dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.

Posisi pada saat memuat sampel                 Posisi pada saat menyuntik sampel

4. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom

mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk

berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

6

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan

kolom konvensional, yakni:

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil

dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor

kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).

Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor

lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,

karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas

misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan

kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin. Kebanyakan fase

diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang

tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan

silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).

Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen

seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan

menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain. Oktadesil silika (ODS

atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu

memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun

tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang

polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai

pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan

memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan

air yang digunakan. 

5. Detektor HPLC

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor

universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan

tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri

7

massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit

secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan

elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.

2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada

kadar yang sangat kecil.

3. Stabil dalam pengopersiannya.

4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan

pelebaran pita.

5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada

kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).

6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

7. Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan

karakteristik detektor seperti berikut :

Detektor Sensitifitas

(g/ml)

Kisaran

linier

Karakteristik

Absorbansi Uv-

vis

Fotometer filter

Spektrofotomete

r

spektrometer

photo-diode

array

5 x 10-10

5 x 10-10

> 2 x 10-10

104

105

105

Sensitivitas bagus, paling

sering digunakan, selektif

terhadap gugus-gugus dan

struktur-struktur yang

tidak jenuh.

Fluoresensi 10-12 104 Sensitifitas sangat bagus,

selektif, Tidak peka

terhadap perubahan suhu

8

dan kecepatan alir fase

gerak.

Indeks bias 5 x 10-7 104 Hampir bersifat universal

akan tetapi sensitivitasnya

sedang. Sangat sensitif

terhadap suhu, dan tidak

dapat digunakan pada

elusi bergradien

Elektrokimia

Konduktimetri

Amperometri

10-8

10-12

104

105

Peka terhadap perubahan

suhu dan kecepatan alir

fase gerak, tidak dapat

digunakan pada elusi

bergradien. Hanya

mendeteksi solut-solut

ionik. Sensitifitas sangat

bagus, selektif tetapi

timbul masalah dengan

adanya kontaminasi

elektroda.

B. Pengertian Flourosensi

Emisi cahaya terjadi karena proses absorbsi cahaya oleh atom yang

mengakibatkan keadaan atom tereksitasi. Keadaan atom yang tereksitasi akan

kembali keadaan semula dengan melepaskan energi yang berupa cahaya

(deeksitasi). Fluoresensi merupakan proses perpindahan tingkat energi dari

keadaan atom tereksitasi (S1 atau S2) menuju ke keadaan stabil (ground states).

Proses fluoresensi berlangsung kurang lebih 1 nano detik sedangkan proses

9

fosforesensi berlangung lebih lama, sekitar 1 sampai dengan 1000 mili detik.

Fluoresensi spektroskopi menggunakan foton energi yang lebih tinggi

untuk merangsang sampel, yang kemudian akan memancarkan foton energi yang lebih

rendah. Teknik ini telah menjadi populer untuk biokimia dan aplikasi medis,

dan dapat digunakan untuk mikroskopi confocal, fluoresensi mentransfer

resonansi energi, dan pencitraan fluoresensi seumur hidup.

Spektroskopi Fluoresensi Atom. Pada metode ini seperti pada

spektroskopi absorpsi atom untuk membentuk partikel-partikel atom

diperlukan nyala api. Energi radiasi yang diserap oleh partikel atom akan

dipancarkan kembali ke segala arah sebagai radiasi fluoresensi dengan panjang

gelombang yang karakteristik. Sumber radiasi ditempatkan tegak lurus

terhadap nyala api sehingga hanya radiasi fluoresensiyang dideteksi oleh

detektor setelah melalui monokromator. Intensitas radiasi fluoresensi ini

berbanding lurus dengan konsentrasi unsur.

Fluoresensi adalah jenis tertentu dari luminescence, dicirikan bahwa zat

yang mampu menyerap energi sebagai bagian radiasi elektromagnetik dan

kemudian memancarkan energi itu sebagai radiasi elektromagnetik dari

panjang gelombang yang berbeda. Total energi yang dipancarkan oleh cahaya

selalu kurang dari total energi yang diserap dan perbedaan antara energi

tersebut yang hilang sebagai panas. Dalam kebanyakan kasus, panjang

gelombang yang dipancarkan lebih besar, dan karena itu, energi yang lebih

rendah daripada yang diserap, namun, jika radiasi eksitasi adalah intens, maka

mungkin saja elektron menyerap dua foton, dalam penyerapan bifotonic.

Panjang gelombang yang dipancarkan lebih pendek dari yang diserap, namun

dalam kedua kasus total energi yang dipancarkan lebih kecil dari total energi

yang diserap. Umumnya zat neon menyerap energi dalam bentuk radiasi

elektromagnetik berbentuk gelombang pendek (P misalnya radiasi gamma,

sinar-x, UV, biru muda, dll), dan kemudian lagi memancarkan gelombang yang

lebih panjang, misalnya dalam spektrum terlihat paling mencolok dari

fluoresensi terjadi ketika cahaya yang diserap berada dalam kisaran ultraviolet

10

dari spektrum tak terlihat oleh mata manusia dan cahaya yang dipancarkan

berada di kawasan yang terlihat.

Mekanisme fluoresensi melibatkan tiga langkah berurutan, masing-

masing disebut penyerapan (1), non-radiasi disipasi (2) dan emisi (3). Siklus

penyerapan ini sangat singkat, lamanya waktu berlalu dalam urutan nanodetik.

Mekanisme fluoresensi juga berkaitan erat dengan proses

chemiluminescence. Zat yang mampu memancarkan cahaya ketika menyala

oleh berbagai jenis radiasi yang disebut fluorophores. Hal ini dimungkinkan

untuk mendapatkan berbagai macam warna dengan fluoresensi, tergantung

pada panjang gelombang memancarkan senyawa neon. Dalam fenomenanya

fluoresensi memungkinkan penyerapan energi oleh elektron, dari keadaan

dasar (S0) untuk keadaan tereksitasi (S1), kemudian elektron kembali dalam

keadaan dasar disertai dengan pelepasan kelebihan energi oleh radiasi yang

dipancarlan. Dalam seluruh proses fluoresensi terjadi dalam waktu kurang dari

0,00001 detik sama dengan pendar, tapi dengan proses yang cepat. Perbedaan

sehubungan dengan pendar, yaitu fluoresensi berlangsung hanya selama

stimulus. Fenomena fluoresensi memiliki banyak penggunaan di antaranya

digunakan dalam mineralogi, gemology, sensor kimia (fluoresensi

spektroskopi), pigmen dan pewarna, detektor biologis dan lampu neon. Kita

ambil contoh Penggunaan dari fenomena fluoresensi ini adalah lampu neon,

fluoresensi bekerja saat di mana zat putih yang menutupi kristal dalam

memancarkan cahaya ketika arus listrik yang dibuat di dalam tabung.

Penggunaan lainnya adalah mendeteksi tiket palsu, karena hanya dicetak aktual

membawa pewarna fluorescent yang terlihat hanya dengan bantuan sebuah

"cahaya hitam".

11

BAB IIIPEMBAHASAN

A. Suatu Senyawa Dapat di Ukur Dengan Detektor Flouresensi

Proses fluoresensi dapat terjadi pada partikel dalam

suatu medium. Hal tersebut terjadi akibat respon terhadap

cahaya eksitasi dari elemen-elemen penyusunnya (kumpulan-

kumpulan molekul atau atom yang relatif homogen) dengan

mengasumsikan bahwa dimensi partikel sangat tipis sehingga

proses absorbsi terhadap cahaya eksitasi tidak mengalami

hambatan atau gangguan. Pada saat cahaya eksitasi datang

menuju medium yang berisi partikel-partikel, cahaya tersebut

akan diabsorbsi oleh partikel-partikel sebesar IA dan sebagian

diteruskan (tanpa absorbsi) sebesar IT (persamaan 2.13).

Cahaya yang diabsorbsi selanjutnya dikonversi menjadi emisi

cahaya fluoresensi (IF) oleh faktor efisiensi kuantum ΦF.

Hubungan antara intensitas fluoresensi dan absorbansi

suatu partikel akibat eksitasi dari suatu sumber cahaya

dinyatakan dengan menggunakan hukum Beer-Lambert.

Intensitas cahaya eksitasi yang ditransmisikan oleh sejumlah

konsentrasi partikel N sebesar IT(λE) pada luasan medium a

dan sepanjang arah rambat cahaya eksitasi.

Fluoresensi merupakan proses perpindahan tingkat energi dari keadaan

atom tereksitasi (S1 atau S2) menuju ke keadaan stabil (ground states). Proses

fluoresensi berlangsung kurang lebih 1 nano detik sedangkan proses

fosforesensi berlangung lebih lama, sekitar 1 sampai dengan 1000 mili detik.

Fluoresensi spektroskopi menggunakan foton energi yang lebih tinggi

12

untuk merangsang sampel, yang kemudian akan memancarkan foton energi yang lebih

rendah. Teknik ini telah menjadi populer untuk biokimia dan aplikasi medis,

dan dapat digunakan untuk mikroskopi confocal, fluoresensi mentransfer

resonansi energi, dan pencitraan fluoresensi seumur hidup.

Menurut diagram Jablonski (Gambar 7.1), energi emisi lebih rendah

dibandingkandengan eksitasi. Ini berarti bahwa emisi fluoresensi yang lebih

tinggi terjadi padapanjang gelombang dari penyerapan (eksitasi). Perbedaan

antara eksitasi dan panjanggelombang emisi dikenal sebagai pergeseran Stoke.

Langkah pertama (1) adalah eksitasi, di mana cahaya diserap oleh

molekul,yang ditransfer ke keadaan tereksitasi secara elektronik yang berarti

bahwa sebuahelektron bergerak dari keadaan dasar singlet S0, ke keadaan

singlet tereksitasi S1. I n i diikuti dengan relaksasi getaran atau konversi

internal (2), dimana molekul inimengalami transisi dari elektronik atas ke yang

lebih rendah S1, tanpa radiasiapapun. Akhirnya, emisi terjadi (3), biasanya 10 -

8 detik setelah eksitasi, ketika kembali elektron kekeadaan dasar lebih stabil,

S0 memancarkan cahaya pada panjanggelombang yang sesuaidengan perbedaan

energi antara kedua negara elektronik.Dalam molekul, masing-masing kondisi

elektronik memiliki beberapa kondisibagian getaran terkait. Dalam keadaan

dasar, hampir semua molekul menempatitingkat vibrasi terendah. Dengan

eksitasi dengan sinar UV atau terlihat, adalahmungkin untuk mempromosikan

molekul yang tertarik ke salah satu tingkat getaranbeberapa tingkat tereksitasi

secara elektronik yang diberikan. Ini berarti bahwa emisifluoresensi tidak

hanya terjadi pada satu panjang gelombang tunggal, melainkanmelalui

distribusi panjang gelombang yang sesuai untuk transisi vibrasi

beberapasebagai komponen dari transisi elektronik tunggal. Inilah sebabnya

mengapa eksitasidan spektrum emisi diperoleh untuk menggambarkan secara

rinci karakteristik molekul fluoresensi.

B. Senyawa Yang Dapat di Deteksi Dengan Detektor Flouresensi

Hanya sedikit ion anorganik yang berpendar, yang paling dikenal adalah

ionuranil, UO22+. Umumnya alanisis fluorometrik melibatkan molekul organik.

13

Ada beberapa senyawa kelat logam yang berpendar yang memberikan metode yang peka

untuk beberapa ion logam. Seringkali kelat logam diekstraksi dari dalam

larutan berair menjadi suatu pelarut organik sebelum pengukuran, suatu proses

dan sekaligus memisahkannya dari ion-ion pengganggu dan

mengkonsentrasikan spesies yang berpendar. Misalnya, banyak terdapat

reagensia flourometrik untuk Aluminium dan Berilium. Logam-logam yang

lebih berat seperti Fe2+, Co2

+, Ni2+ dan Cu2

+ sebaliknya cenderung mematikan

flourosens yang diperagakan oleh banyak zat pengkelat itusendiri, hadinya

logam itu dalam kompleks mendorong dibuangnya energi yangdiserap secara

tak radiantif. Kadang suatu analit yang tidak berpendar dapat diubah menjadi

suatu molekulyang berpendar kuat, dengan suatu reaksi yang cepat dan kuantitatif, yang

denganmuadah digabungkan ke dalam suatu prosedur analitik keseluruhan.

Misalnya, hormon epinefrin (adrenalin) mudah diubah menjadi adrenolutin.

Dalam larutan basa,anion folat dari adrenolutin berpendar dengan kuat (eksitasi

360 nm, pancaran 530 nm). Pasien dengan tumor tertentu pada kelenjar

adrenalin dan juga beberapa penderita tekanan darah tinggi menunjukkan kadar

efinefrina yang meningkat dalamair seninya. Hormon yang terdapat pada kadar yang

sangat rendah dapat dipekatkan dari dalam volume besar air seni dengan suatu

prosedur penukar ion pada suatu pHdimana nitrogen amino diprotonkan untuk

membentuk suatu kation R-NH2-CH2, dielusi dalam sedikit volume dengan

ditukar-ganti dengan H+ dan diolah seperti diatas untuk membentuk flourofor.

Beberapa vitamin dapat ditetapkan secara fluorometrik. Oksidasi lembut

tiamina (vitamin B1) oleh Fe(CN)63-, misalnya akan menghasilkan suatu

produk yang disebut tiokrom yang memperagakan fluoresens biru pada kondisi

yang tepat. Jika pancaran pendaran itu diukur terhadap dua porsi sampel, satu

diolah dengan ferisianida dan yang lain tidak, orang dapat mengurangi

kontribusi pengganggu non-tiamina yang berpendar untuk meningkatkan

selektivitas. Riboflavin (vitamin B1) dan piridoksin (B6) merupakan vitamin

lain yang dapat ditetapkan oleh fluoresensi. Meskipun kebanyakan asam amino

tidak berpendar, tetapi mudah bereaksi dengan reagen fluoresamina untuk

membentuk senyawa yang sangat berpendar yangtelah digunakan dalam biokimia

14

untuk mendeteksi kuantitas. Metode fluoresensi sangat baik untuk menetapkan

beberapa hidrokarbon aromatik polisiklik yang telah dikelompokkan sebagai

“polutan prioritas” oleh Jawatan Perlindungan Lingkungan Amerika Serikat

(EPA), yang mengatakan bahwafluoresens memberi deteksi yang sangat peka

terhadap komponen-komponen sampeltertentu dalam kromatografi cairan.

Misalnya pada produk Susu : Produk-produk susu mengandung beberapa

fluorophores intrinsik. Misalnya asamamino aromatik dan asam nukleat,

triptofan, tirosin dan fenilalanin dalam protein, vitamin A dan B2,

Nikotinamida adenin dinukleotida (NADH) dan klorofil, dan berbagai senyawa

lainnya yang dapat ditemukan pada konsentrasi rendah atau sangat rendah di produk

makanan.

C. Proses Terjadinya Eksitasi Molekul

Molekul zat menyerap energi cahaya yang dipancarkan panjang

gelombang ultraviolet, terlihat (inframerah) wilayah spektrum fluoresensi,

sesuai dengan karakteristik spektral dan intensitas analisis kualitatif dan

kuantitatif zat, analisis ini adalah analisis fluoresensi molekul.

1. Proses yang terjadi molekul fluoresensi

Molekul neon terjadi terutama mencakup tiga proses: 1, eksitasi molekul, 2

molekul untuk mengaktifkan, 3, fluoresensi terjadi.

Termasuk singlet bersemangat dan triplet tereksitasi keadaan tereksitasi,

sebagian besar molekul berisi bahkan jumlah elektron dalam keadaan dasar,

pasangan elektron dari atom atau molekul hadir dalam setiap orbit, berputar

dipasangkan dalam arah yang berlawanan, elektron spin bersih nol: S = ½ (- ½)

= 0, multiplisitas M = 2S 1 = 1 (M adalah bilangan kuantum magnetik), oleh

karena itu, molekul anti-(anti-) magnet, itu bisa tingkat tanpa medan magnet

eksternal dan divisi, yang disebut "keadaan singlet." Ketika sepasang molekul

keadaan dasar menyerap radiasi sinar elektron sangat tertarik untuk energi yang

lebih tinggi transisi orbital, biasanya tidak mengubah arah spin, yaitu Ä S = 0,

maka masih keadaan tereksitasi singlet, yaitu, "tunggal (re) bersemangat

15

negara", jika proses transisi elektron, juga disertai dengan perubahan arah spin,

maka akan memiliki dua elektron tidak berpasangan berputar, spin bersih tidak

sama dengan nol, dan sama dengan 1: S = 1/2 1 / 2 = 1 multiplisitas: M = 2S 1

= 3, yaitu molekul yang dipengaruhi oleh medan magnet menghasilkan

membelah energi, negara ini bersemangat disebut "tiga baris (berat) keadaan

tereksitasi "triplet exciton" daripada "singlet bersemangat negara" energi yang

lebih rendah.

Tingkat terluar elektron energi molekul, termasuk S0 (keadaan dasar), dan

S1 keadaan tereksitasi, S2, ....., ..... T1, dan masing-masing mencakup

serangkaian tingkat energi elektronik sangat dekat dengan tingkat getaran.

Molekul dalam keadaan tereksitasi tidak stabil, dalam waktu singkat melalui

berbagai saluran dalam kelebihan melepaskan energi (radiasi atau transisi

radiasi) menyatakan Kembali bersemangat, proses yang dikenal sebagai "de-

aktivasi", saluran tersebut adalah: (1) relaksasi getaran, (2) konversi internal,

(3)konversi eksternal, (4) lompatan antar sistem, (5) emisi fluoresensi, (6)

emisi berpendar.

Molekul dalam keadaan tereksitasi, saluran yang berbeda melalui ke

keadaan dasar, yaitu, terjadinya fluoresensi. Cara yang lebih cepat, yang berarti

terjadi istimewa. Jika - begitu bersemangat molekul proses penonaktifan

fluoresensi lebih cepat dibandingkan dengan proses lainnya, kemungkinan

terjadinya fluoresensi tinggi dan kekuatan. Jika begitu cepat proses

penonaktifan molekul fluoresensi lambat dibandingkan dengan proses lainnya,

fluoresensi lemah atau tidak terjadi.

2. Eksitasi spektrum dan spektrum fluoresensi

Fluoresensi cahaya eksitasi dengan monokromator spektral, terus

mengubah panjang gelombang eksitasi, emisi panjang gelombang tetap,

penentuan panjang gelombang eksitasi yang berbeda dari cahaya yang

dipancarkan oleh zat solusi fluoresensi intensitas (F), sebagai F-l mengatakan

spektrum eksitasi. Dari spektrum eksitasi dapat ditemukan pada intensitas

fluoresensi yang terkuat eksitasi panjang gelombang lex, pilihan terbesar

16

intensitas fluoresensi lex dapat diperoleh. Pilih lex sebagai sumber eksitasi,

monokromator dengan zat lain dipancarkan spektroskopi fluoresensi, merekam

setiap panjang gelombang F, F-l disebut spektrum spektroskopi fluoresensi.

Panjang gelombang fluoresensi intensitas fluoresensi dari lem terkuat. lex dan

lem umumnya digunakan dalam analisis kuantitatif dari panjang gelombang

yang paling sensitif.

3. Fluoresensi dan Struktur Molekul

Hanya mereka dengan p-p molekul terkonjugasi ikatan ganda untuk

memancarkan fluoresensi kuat, terkonjugasi besar tingkat p-elektron, semakin

besar intensitas fluoresensi (lex dan pergeseran panjang lem) yang berisi

sebagian besar cincin aromatik, heterosiklik senyawa fluoresensi, dan p-

elektron terkonjugasi lagi, F adalah. Cincin Benzena tersubstitusi

menyumbangkan elektron-kelompok, peningkatan konjugasi p-à intensitas

fluoresensi meningkat: as-CH3,-NH2,-OH,-OR, dll (Benzena) menggantikan

kelompok penarik elektron, bahkan ketika intensitas fluoresensi menurun Off:

misalnya:,-COOH,-CHO,-NO2,-N = N. Tinggi atom nomor atom,

meningkatkan terjadinya sistem persimpangan intersystem, neon melemah atau

bahkan padam. Seperti: Br, I. Juga fluorescein planar konfigurasi, struktur

memiliki kekakuan yang sangat substansi neon, sedangkan fenolftalein

molecular structure planar mudah untuk mempertahankan, substansi neon

tidak.

17

BAB IV

PENUTUP

Kesimpulan

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan

perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada

kromatografi, komponen – komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase

yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran

sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen

yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen

yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat.

Fluoresensi merupakan proses perpindahan tingkat energi dari keadaan

atom tereksitasi (S1 atau S2) menuju ke keadaan stabil (ground states). Proses

fluoresensi berlangsung kurang lebih 1 nano detik sedangkan proses

fosforesensi berlangung lebih lama, sekitar 1 sampai dengan 1000 mili detik.

Proses yang terjadi molekul fluoresensi :

Molekul neon terjadi terutama mencakup tiga proses: 1, eksitasi molekul, 2

molekul untuk mengaktifkan, 3, fluoresensi terjadi.

18

DAFTAR PUSTAKA

Watson, David G. 2009. Analisis Farmasi : Buku Ajar untuk Mahasiswa Farmasi dan Praktisi Kimia Farmasi. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC.

Herman, Blaschke G. 1994. Analisis Farmasi. Yogyakarta : Gadjah Mada University Press.

Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan. 1979. Farmakope Indonesia Edisi III. Departemen Kesehatan RI Jakarta. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Departemen Kesehatan RI Jakarta.

Lindsay, S. 1992. High performance liquid chrotomagraphy Edisi II. UI Press.

Rucker, G. 1988. Analisa Farmasi Instrumen : Spektroskopi, Kromatografi. UI Press.

19