4/19微生物の培養

本日の流れ

　微生物の増殖（講義）

　殖菌ー生育曲線

　固体培地殖菌

　プラスミド抽出のための大量培養

　後片付け

細胞増殖の概要

定義:　「個体群における微生物の細胞数の増加」

　増殖における合成プロセスには2000種以上の反応が含まれる

　二分裂（バイナリ分裂）

　増殖に必要な時間は様々．遺伝的要因と栄養的要因，環境的要因（温度，pH，酸素 etc.）

　　大腸菌は，最も栄養性のよい条件下では( )分で一回分裂．

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個体群の増殖

増殖速度: 　単位時間あたりの細胞数，細胞集団の変化

世代時間:　細胞の個体数が2倍になるための時間

個体群の増殖サイクル (1)

個体群の増殖サイクル (2)

遅滞期 (lag phase)　殖菌後，増殖が停止している時期．

対数増殖期 (logarithmic phase)　最も健康な状態にある細胞．細胞数は単位時間ごとに2倍．

定常期 (stationary phase)　栄養素の消耗，あるいは，有毒代謝物の蓄積によって対数増殖期がおわる．郡中の細胞が増殖する一方で，一部は死ぬため，正味の数に増減は起こらない（潜在増殖）．

死滅期 (death phase)　細胞が死滅し，細胞数が減少していく．多くの場合，死亡速度は増殖速度よりもはるかに遅い．

対数増殖期時間（h） 細胞の総数

0 10.5 21 41.5 82 162.5 323 643.5 1284 2564.5 5125 10245.5 20486 4096.. .... ..10 1048576

　細胞数は単位時間ごとに2倍．

　細胞数が増加する速度は，　　　はじめが遅くて　　　徐々にはやくなる

　環境条件だけではなく，遺伝子的な特徴によっても影響をうける

1) 培地のチェック

2) 無菌環境を作る。

3) 滅菌済L字管の栓を開ける。

4) 100mlメディウムビンに入った50mlのLB から5mlとって入れる(3本)。

5) すぐに栓をする。班番号と温度を書いたラベルを貼る。

6) 分光光度計で培養前の濁度を測定する。

7) 大腸菌培養液から100μl (1/50量) ，マイクロピペットで取り、L字管

に入れる。

8) 濁度を測定する。（０分）

9) 27度，37度，47度の各温度の恒温培養槽で振る。

10) 20分ごとに測定をしていく。

増殖の測定 (1)-- 吸光度(absorbance)測定

細胞の懸濁液が濁って見えるのは，光を細胞が分散させるため．存在する細胞が多いほど光が分散されるため，濁ってみえる．

単細胞生物の場合，absorbance は細胞数に比例する

Abs. = log I0 / I

プリズム光電池Iを測定 レコーダ

入射光 I0 透過光 I

増殖の測定 (2) -- 生細胞数の計測

寒天培地上にコロニーを形成できる細胞数を計測

生細胞：分裂して子孫を形成することができる細胞

37℃Abs. > 0.5

10μl 10μl

LB 990μl LB 990μl LB 990μl

10μl

+ 10μl + 10μl + 10μl

Plating (10μl) Plating (100μl)

Plating (10μl)

実習を始める前に

・机回りを整頓する

・白衣を着用する

・時計，アクセサリーを外す

・手洗いをする