document4

№ 8-2003

Анализ микроделеций в локусе AZF у мужчин сбесплодием: совместный опыт исследованийЧЕРНЫХ В.Б., КУРИЛО Л.Ф., ШИЛЕЙКО Л.В., ШИРШОВА Л.С., ЧУХРОВА А.Л.,КОВАЛЕВСКАЯ Т.С., ПОЛЯКОВ А.В.;1

ГОГОЛЕВСКИЙ П.А., КАЛУГИНА А.С., МОРИНА Г.В.;2

ТОГОБЕЦКИЙ А.С., ЗДАНОВСКИЙ В.М.;3

ГОГОЛЕВСКАЯ И.К., КРАМЕРОВ Д.Н.4

1 — ГУ Медико-генетический научный центр РАМН, Москва2 — Центр планирования семьи и репродукции, Москва3 — Центр лечения бесплодия «ЭКО», Москва4 — Институт молекулярной биологии им. Энгельгардта, Москва

Одной из наиболее частых генетических причин бесплодия у мужчин являются делеции в локусе AZF*,локализованном на длинном плече Y-хромосомы (Yq11), которые приводят к различной степени наруше-ния сперматогенеза, от сниженной его активности до синдрома клеток Сертоли, проявляясь чаще всегоазооспермией или олигозооспермией тяжелой степени. Б ходе крупномасштабного клинико-генетиче-ского обследования 514 мужчин с бесплодием проведен анализ микроделеций в локусе AZF. В 43 случаяхвыявлены делеции Y-хромосомы: 2 микроделеции AZFa, 8 делеций AZFb-c и 33 микроделеции в субрегионеAZFc. Частота обнаруженных делеций Y-хромосомы среди мужчин с азооспермией и олигозооспермиейтяжелой степени составила соответственно 12,7% и 8%. Детальный молекулярно-генетический ана-лиз позволил уточнить границы делеций и выявить их различную протяженность. Данные комплексногообследования пациентов с различными типами AZF-делеций подтверждают гено-фенотипические кор-реляции, выявленные другими исследователями.

ВведениеРезультаты многочисленных исследований роли

генетических факторов в этиологии бесплодия убе-дительно доказывают их ведущее место в структуренарушений репродуктивной функции как у мужчин,так и у женщин. Так, генетические факторы обу-славливают, по крайней мере, 30—50% всех случаевтяжелых форм бесплодия у мужчин. Помимо анома-лий кариотипа наиболее частой генетической при-

*Словарь терминов и сокращений:Азооспермия — отсутствие сперматозоидов в эякуляте.AZF (Azoospermia Factor) - "фактор азооспермии" - участок

длинного плеча Y-хромосомы, содержащий гены, контролирующиесперматогенез.

DAZ (Deleted in Azoospermia) — кандидатный ген субрегиона AZFcна фактор азооспермии ("делетированный при азооспермии").

ИКСИ (ICSI, Intracytoplasmic Sperm Injection) — один из методовЭКО путем введения единичного сперматозоида в цитоплазмуяйцеклетки.

КА НПК — количественный анализ незрелых половых клеток изэякулята.

Олигозооспермия — сниженное количество сперматозоидов вэякуляте (менее 20 млн/мл); при олигозооспермии тяжелой степени -менее 5 млн/мл.

СКС (синдром клеток Сертоли, или синдром «только клеткиСертоли») — гистологический синдром, характеризующийсяотсутствием половых клеток во всех (CKCI) или части семенныхканальцев (СКСII.

ТЕЗА (TESA, Testicular Sperm Aspiration) — аспирациясперматозоидов из ткани яичка.

ТЕЗЕ (TESE, Testicular Sperm Extraction) — экстракциясперматозоидов из ткани яичка.

ЭКО — экстракорпоральное оплодотворение.

чиной бесплодия у мужчин являются делецииY-хромосомы, захватывающие локус AZF. ДелецииAZF-локуса связаны с различной степенью наруше-ния сперматогенеза от умеренного снижения его ак-тивности (гипосперматогенез) или блока спермато-генеза до практически полного отсутствия половыхклеток в семенных канальцах — СКС [2, 3, 9, 10, 26,34, 45, 57].

Азооспермия и олигозооспермия тяжелой степе-ни являются одними из наиболее тяжелых форм на-рушения сперматогенеза и составляют 10—20% и15—20% соответственно от всех нарушений репро-дуктивной функции у мужчин при измененных по-казателях спермограммы. С помощью имеющихся внастоящее время методов цитогенетической и моле-кулярно-генетической диагностики макро- и мик-роделеции Y-хромосомы, захватывающие локусAZF, удается обнаружить у 10—15% мужчин с азо-оспермией и у 5—10% мужчин с олигозооспермиейтяжелой степени [3, 10, 26, 45, 51, 57].

Впервые роль делеций локуса Yq11 в этиологиинарушения сперматогенеза и бесплодия у мужчинбыла показана в 1976 г. Tiepolo и Zuffardi [55]. Даль-нейшие цитогенетические и молекулярно-генетиче-ские исследования позволили с помощью STS-тех-нологии (sequence-tagged sites) построить детальнуюкарту Y-хромосомы, включающую 43 делеционныхинтервала [58]. Было подтверждено наличие в дис-тальной части длинного плеча Y-хромосомы локуса

Медицинская генетика. Т. 2. № 8. 2003 367

НАУЧНЫЕ ОБЗОРЫ

AZF, делеции которого ответственны за нарушениесперматогенеза. В 1996 г. Vogt и соавт. на основе по-лученных данных о локализации и размере делеций,выявленных у 26 мужчин, предложили выделить влокусе Yq11.21-q11.23 три неперекрывающихся суб-региона: AZFa, AZFb и AZFc [57].

Впоследствии для каждого субрегиона были вы-делены кандидатные гены, ответственные за нару-шение сперматогенеза: для AZFa — USP9Y(DFFRY) и DBY, для AZFb - RBMY, для AZFc-pe-гиона — DAZ [24, 39, 45]. Для каждого гена быливыявлены гомологи, локализованные как на Х-хро-мосоме, так и на аутосомах. Определены нуклеотид-ная последовательность и размер каждого субрегио-на: AZFa около 800 т.п.н., AZFb — 3,2 млн.п.н. иAZFc - 3,5 млн.п.н. [13, 20, 32, 36, 47, 51, 53, 54].

Строгой зависимости степени и стадии наруше-ния сперматогенеза от локализации и размера деле-ций локуса AZF получено не было, однако ряд об-щих генофенотипических корреляций удалось выя-вить [2, 10, 26, 34, 57]. Было установлено, что болеекрупные делеции, захватывающие два или три суб-региона, а также AZFa-микроделеции ассоциирова-ны с более тяжелым нарушением сперматогенеза(СКС); наиболее частые делеции субрегиона AZFcи AZFb+c характеризуются различной степенью на-рушения сперматогенеза от снижения сперматоген-ной активности или блока сперматогенеза до СКС[3, 9, 26, 34, 45, 57].

В настоящее время для мужчин с тяжелой фор-мой олигозооспермии единственно эффективнымметодом преодоления бесплодия является ИКСИ, адля пациентов с азооспермией — ИКСИ в сочета-нии с извлечением тестикулярных сперматозоидов спомощью ТЕЗА или ТЕЗЕ [3]. В ряде случаев испо-льзование репродуктивных технологий позволяетиметь собственных детей мужчинам, несущим деле-ции Y-хромосомы [41, 42, 50]. Однако следует отме-тить наличие у них риска передачи данной делецииY-хромосомы мальчикам (в 100% случаях), а такжеповышенного риска рождения детей с мозаициз-мом 45,X/46,XY (с синдромом Шерешевского—Тер-нера, смешанной дисгенезией гонад или другойформой гермафродитизма) [33, 44, 49]. Поэтомувсем пациентам с азооспермией или олигозооспер-мией тяжелой степени, а также мужчинам, которымпланируется программа ЭКО в рамках комплексно-го клинико-генетического обследования, необходи-мо обязательное проведение анализа микроделецийY-хромосомы и последующего медико-генетическо-го консультирования [3, 9].

Материалы и методы

С 1997 г. лабораторией генетики нарушений ре-продукции совместно с лабораторией ДНК-диагно-стики ГУ МГНЦ РАМН, а с 1998 г. — Центром полечению бесплодия «ЭКО », а также Центром пла-нирования семьи и репродукции г. Москвы впервые

в России была начата программа по генетическомускринингу мужчин с бесплодием на наличие микро-делеций Y-хромосомы. Ниже будут приведеныобобщенные данные, полученные по этим меди-цинским центрам.

За истекший период было обследовано 514 паци-ентов с первичным бесплодием. На основании резу-льтатов спермиологического исследования все муж-чины с бесплодием были разделены на 3 группы(табл. 1). В первую группу отобрали 213 пациентов сазооспермией, во-вторую — 198 с олигозооспер-мией тяжелой степени, в третью — 103 с другимиформами патозооспермии (при количестве сперма-тозоидов более 5 млн/мл). Контрольную группу об-следованных составили 57 здоровых (фертильных)мужчин.

Обследование, проведенное пациентам, включа-ло общеклиническое, общее и специальное андро-логическое исследование, сперматологическое(стандартное спермиологическое исследование,КА НПК и в некоторых случаях — гистологическоеисследование биоптата яичка), цитогенетическое(анализ кариотипа по лимфоцитам периферическойкрови) и молекулярно-генетическое исследование(анализ микроделеций Y-хромосомы).

Спермиологический анализ эякулята выполнялипо стандартной методике, рекомендованной ВОЗ(WHO, 1992; 1999) [59]. КА НПК из осадка эякулятапроводили по методу, предложенному проф.Л.Ф. Курило и соавт. [6]. Гистологическое исследо-вание биоптата яичка было выполнено по общепри-нятой методике, описанной ранее [9]. Цитогенети-ческое исследование проводили по общепринятойметодике, используя GTG-окрашивание [4]. Резу-льтаты цитогенетического исследования приведенысогласно Международной системе номенклатурыцитогенетики человека [28].

Объект исследования

Исследованы образцы ДНК, выделенной из кро-ви 514 мужчин с бесплодием, а также 57 фертиль-ных мужчин.

Кровь получали методом венепункции в однора-зовые пластиковые пробирки с консервантом (0,5Мраствор ЭДТА) в соотношении консервант/кровь —1:10. ДНК была выделена из лимфоцитов перифе-рической крови по стандартной методике [38].

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) прово-дили на программируемом термоциклере МС2 про-изводства фирмы «ДНК-технология» (Россия) с ис-пользованием Taq-полимераз.

В ходе исследования было проанализировано28 STS-маркеров, специфичных для Y-хромосомы.Анализ микроделеций локуса AZF был проведен всоответствии с руководством по молекулярной диа-гностике микроделеций Y-хромосомы (1999 г.) [51].Для обнаружения делеций применяли мультиплекс-ную амплификацию (МПА), предложенную дан-

368

№ 8-2003

ным руководством в собственной модификации. Напервом этапе анализа выполняли детектированиеделеций в трех субрегионах AZF. Набор праймеров,использованных на данном этапе, позволял иссле-довать 15 STS-маркеров, специфичных для AZF-ло-куса:

1) для субрегиона AZFa (интервал 5С-5Е): sY86;sY84; DBY1; DBY2; sY615; sY182 (KALY);

2) для субрегиона AZFb (интервал 5N-6B): sY124,sY127, sY130, sY134, sY143;

.3) для субрегиона AZFc (интервал 6D-6E): sY242,sY254 (DAZ), sY255 (DAZ), sY157.

Кроме того, в качестве «внутреннего» контроляна присутствие в геномной ДНК фрагментов корот-кого плеча Y-хромосомы использовали два маркера— SRY (sY14) и ZFX/ZFY, — что позволяло выявитьналичие данных локусов и определить соответствиефенотипического пола генотипическому. В качестве«внешнего положительного» контроля использова-ли ДНК фертильного мужчины (контроль специ-фичности и чувствительности реакции), а внешнегоотрицательного (контроль наличия загрязнения об-разцов ДНК) — смесь реагентов, в которой вместоДНК присутствовала вода.

В случаях обнаружения делеций на втором этапеисследования определяли их границы, исследуя ло-кусы, которые располагались в прилегающих про-ксимальных и дистальных областях каждого субре-гиона AZF, предложенные руководством Simoni исоавт. [51].

1. Субрегион AZFa:sY82 (+), sY83 (-) (проксимальная граница);sY87 (-), sY88 (+) (дистальная граница).

2. Субрегион AZFb:sY135 (+), sY114 (-) (проксимальная граница);sY143 (-), sY152 (+) (дистальная граница).

3. Субрегион AZFc:sY143 (+), sY152 (-) (проксимальная граница);sY157 (-), sY158 (+) (дистальная граница).

4. Дистальный гетерохроматин длинного плечаY-хромосомы (Yql2) - SY160/DYZ1.

Реакционная смесь включала: 20 нг геномнойДНК, 0,25 мкМ каждого олигопраймера, 250 мкМкаждого dNTP в 25 мкл однократного буфера дляПЦР (67 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4,0,01% Twin-20), добавляли 1,5 единицы термофиль-ной ДНК-полимеразы, 20—30 мкл минеральногомасла. ПЦР проводили в следующем режиме: пер-воначальная денатурация 95°С — 2 мин, 94°С — 45с,65°С — 45 с, 72°С — 45 с, финальная достройка 72°С— 7 мин.

Результаты амплификации оценивали методомэлектрофореза в 7%-ном ПААГ с последующимокрашиванием в растворе бромистого этидия(0,1 мкг/мл в IxTBE).

Результаты

Среди 514 обследованных мужчин с бесплодиемделеции локуса AZF были обнаружены у 43 (в 8,4%случаев) (табл. 1; рис. 1,2). Делеции Y-хромосомыбыли выявлены только у пациентов с азооспермиейили олигозооспермией тяжелой степени. В группемужчин с азооспермией делеции были обнаруженыу 27 пациентов (в 12,7% случаев), в группе с олиго-зооспермией тяжелой степени — 16 (в 8 % случаев).Ни одной Y-делеции не было обнаружено в контро-

Таблица 1Частота делеций локуса AZF в обследованных группах мужчин

Группы пациентов

1. Азооспермия

2. Олигозооспермиятяжелой степени- кол-во сперматозоидов менее 1 млн/мл- кол-во сперматозоидов 1—5 млн/мл

3. Астенотератозооспермия и другие формы патозоос-пермии (при кол-ве сперматозоидов более 5 млн/мл)

Контрольная группа(фертильные мужчины)

Всего пациентов 1— 2-й групп

(при кол-ве сперматозоидов 0—5 млн/мл)

Всего пациентов 1— 3-й групп

Количествообследованных

мужчин

213

19812771

103

57

411

514

Число обнаруженныхделеций

AZF-локуса

27 (12,7%)

16 (8%)

14 (11%)2 (2,8%)

0(0%)

0(0%)

43 (10,5%)

43 (8,4%)

Суммированные данныепо частоте делеций

AZF-локусаForesta (2001)

11%

8,2%

0,7%

0,4%

10,5%

7,5%*

* — показатель для «неотобранных» мужчин с бесплодием



льной группе фертильных мужчин, атакже среди пациентов с астенотера-тозооспермией или другими форма-ми патозооспермии.

Чаще всего делеции располагалисьв AZFc-субрегионе (76,7% делецийY-хромосомы) (табл. 2; рис. 2). Навтором месте по частоте встречаемо-сти были делеции, захватывающиесубрегионы AZFb и AZFc (AZFb+c)(9,3% случаев от всех обнаруженныхделеций Y-хромосомы). В четырехслучаях AZFb+c делеций с помощьюпроведенного ранее цитогенетическо-го анализа было показано наличиетерминальных делеций длинного пле-ча Y-хромосомы. Микроделеции суб-региона AZFa были выявлены толькоу двух пациентов (4,7% случаев от всехобнаруженных делеций локуса AZF).Спермиологическая и гистологиче-ская картина, выявленная нами уСпермиологическая и гистологиче-ская картина, выявленная нами умужчин с делециями локуса AZF,была сходна с результатами других ис-следований.

У обоих пациентов с микроделе-циями AZFa-субрегиона отмечалиазооспермию. Гистологическое ис-следование биоптата яичка, прове-денное у одного из них, позволиловыявить СКС I (табл. 3; рис. 3). Порезультатам молекулярного анализа уэтих пациентов область делеции за-хватывала оба кандидатных гена суб-региона AZFa - USP9Y и DBY.

У всех мужчин с делециямиAZFb+c, за исключением одного слу-чая (код 40), по данным спермиологи-ческого анализа отмечали азооспер-мию. При гистологическом исследовании, выпол-ненном у одного из данных пациентов, половыеклетки удалось обнаружить только в некоторых се-менных канальцах (СКС II) (табл. 3; рис. 3). Прове-дение количественного КА НПК позволило выя-вить блок сперматогенеза на стадиях прелептоте-ны-зиготены профазы I мейоза. В четырех (коды 3,4, 10, 32) из восьми случаев отсутствие субрегионовAZFb и AZFc было обусловлено наличием макроде-леций — терминальных делеций длинного плечаY-хромосомы с точками разрыва в локусе Yq11.2(табл. 3). Уточнение границ делеций AZFb+c у дан-ных пациентов показало отсутствие всех исследо-ванных локусов данных субрегионов (sY114-sY160)(рис. 3).

У мужчин с делециями субрегиона AZFc количе-ство сперматозоидов варьировало от 5 млн/мл (оли-гозооспермия тяжелой степени) до полного их от-сутствия (азооспермия). При анализе гистопрепара-

Характер нарушения

Общее количество обнаруженных делеций AZF-ло-куса

Микроделеции AZFa-субрегиона

Микроделеции субрегионов AZFb+c (AZFb-c)

Микроделеции AZFc -субрегиона

Делеции локуса AZF, выявленные как молекулярно-генетическими, так и цитогенетическими методами(«макроделеции» Y-хромосомы)

43

2

8

33

4

%

100%

4,7%

18,6%

76,7%

9,3%

тов биоптата яичка, выполненного у двух пациен-тов, было установлено, что у одного из них (код 31)половые клетки отсутствовали в большинстве се-менных канальцев (СКС II), у другого (код 6) - от-мечали признаки частичного блока в митозе и мейо-зе (табл. 3; рис. 3). Кроме того, в двух случаях мик-роделеций AZFc-субрегиона (коды 27, 37) было от-мечено повышение доли неразошедшихся сперма-тид, что указывало на частичный блок сперматоге-неза на стадиях деления созревания.

Обсуждение

Частота обнаружения микроделеций Y-хромо-сомы среди мужчин с бесплодием значительно ва-рьирует в различных исследованиях (от 1% до35%) [26, 34, 51]. Широкий разброс частот деле-ций обусловлен влиянием ряда факторов, средикоторых наибольшее значение имеют критерииотбора пациентов для проведения микроделеци-

370

Таблица 2Структура делеционных нарушений Y-хромосомы среди

мужчин, у которых были обнаружены делеции локуса AZF.

№ 8-2003

Таблица 3

Кодпациента

1

17

25

3

4

8

10

32

40

30

5

27

1

6

7

11

13

14

24

2

22

Спермиологиче-ский диагноз (ко-

личество спермато-зоидов)

2

Азооспермия







Олигозооспермият.ст. (0,1-0,5

млн/мл)



Олигозооспермият.ст. (0,4-1,0

млн/мл)

Олигозооспермият.ст. (0,5 млн/мл)


Олигозооспермият.ст.

(0 - единичные)


Олигозооспермият.ст. (0 - единичные)

Олигозооспермият.ст. (0 - единичные)




Гистологиче-ское исследо-

вание

3

СКС I

н.и.н.и.

СКС II; блокв прелептоте-не -зиготе непрофазы I

мейоза

Н.И.

Н.И.

н.и.

н.и.

н.и.н.и.н.и.

н.и.

СКС II;частичный

блок в митозеи мейозе

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Гормоны крови

ЛГ

4

Н.И.

Н.И.

N

Н.И.

н.и.

н.и.N

Н.И.

н.и.н.и.н.и.

н.и.

н.и.

н.и.

н.и.н.и.

н.и.

н.и.н.и.н.и.

ФСГ

5

tтN

N

t

Н.И.

1

н.и.

н.и.н.и.н.и.

н.и.

N

н.и.

н.и.N

N

Н.И.

N

t

Т

6N

N

N

N

N

Н.И.

J,

Н.И.

н.и.н.и.н.и.

н.и.

i

н.и.

н.и.N

N

Н.И.

N

N

Состояние яичек

7

Гипоплазия


Норма


Норма

Норма


Н.С.

Н.С.

Н.С.

Норма

Норма

Врожденная од-носторонняя ап-лазия яичка (мо-

норхизм)

Гипогонадизм

Н.С.

Норма

Норма

Н.С.



Кариотип

8

46,XY

46,XY

46,X,del(Y)(q11.2)

46,X,del(Y)(q11.2)

46,X,del(Y)(ql 1.2)

Н.И.

46,X,del(Y)(q11.2)

46,XY

45,X/46, XY

Н.И.

46,XY

Н.И.

Н.И.

Н.И.

46,XY

46,XY

Н.И.

46,XY

Н.И.

46,XY

Тип делеции

9

del AZFa

del AZFa

del AZFb-c

del AZFb-c

del AZFb-c

del AZFb-c

del AZFb-c

del AZFb-c

del AZFb-c

del AZFb-c

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

Протяженностьделеции

10

sY86 - sY88

sY86 - sY615

sY114-sY160

sY114-sY160

sY114-sY160

sY114-sY255

sY114-sY160

sY114 -sY255

sY127 - sY255

sY130 - sY255

sY152 - sY160

sY152 - sY158

sY152 - sY158

sY152 - sY158

sY152 - sY158

sY152 - sY158

sY152 - sY158

sY152 - sY157

sY152 - sY157

sY152 - sY157

онного анализа, количество пациентов в обследу-емых выборках, выбор исследуемых локусов STS[10, 14, 34, 51]. В среднем выявлено наличие деле-ций локуса AZF у 7,5% мужчин с бесплодием, приэтом наибольшая частота делеций отмечена средимужчин с идиопатической азооспермией (18%)или тяжелой олигозооспермией неясного генеза

(14,3%) [25]. При идиопатическом СКС или сни-женной сперматогенной активности неясного ге-неза частота делеций составляет соответственно34,5% и 24,7% [25]. Частота обнаруженных намиделеций AZF-локуса у обследованных, мужчин сбесплодием и азооспермией или олигозооспер-мией тяжелой степени соответствовала результа-



Продолжение таблица 3Данные обследования пациентов с делециями в локусе AZF

1

29

31

33

34

35

36

37

38

' 39

41

42

43

18

28

9

12

15

16

19

20

21

26

2





Олигозооспермият.ст. (единичные)

Олигозооспермият.ст. (0,25 млн/мл)








Олигозооспермият.ст. > азооспермия

Олигозооспермият.ст. (1-5 млн/мл)

Олигозооспермият.ст. (0 - единич-

ные)







3

Н.И.

Блок на стадиисперматид

Н.И.

Лев. яичко —СКСИ

пр. яичко —CKCI

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

4

лгН.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

5

ФСГ

Н.И.

Н.И.

Н.И.

N

N

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

J,Н.И.

Н.И.

Н.И.

N

N

Н.И.

1

tN

Н.И.

N

Н.И.

6

тН.И.

Н.И.

Н.И.

N

N

Н.И.

Н.И.

Н.И.

Н.И.

N

Н.И.

Н.И.

Н.И.

N

N

Н.И.

N

N

N

Н.И.

N

Н.И.

7

Н.С.

н.с.

Н.С.

Варикоцелеслева

Норма

Н.С.

Н.С.


Н.С.


Н.С.

Н.С.

Н.С.

Варикоцелеслева

Норма

Норма



Норма

Норма

Норма

Н.С.

8

46,XY

46.XY

46,XY

46,XY

46,XY

46,XY

46,XY

46,XY

Н.И.

46,XY

Н.И.

Н.И.

46,XY

46,XY

46,XY

46,XY

Н.И.

46,XY

46,XY

46,XY

46,XY

46,XY

9

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

del AZFc

10

sY152 - sY255

sY152 - sY255

sY152 - sY255

sY152 - sY255

sY152 - sY255

sY152 - sY255

sY152 - sY255

sY152 - sY255

sY152 - sY255

sY152 - sY255

sY152 - sY255

sY152 - sY255

sY242 - sY157

sY242 - sY157

sY242 - sY254

sY242 - sY254

sY242 - sY254

sY242 - sY254

sY242 - sY254

sY242 - sY254

sY242 - sY254

sY242 - sY254

там других, в том числе отечественных, исследова-ний, а также обобщенным литературным даннымпо 36 исследованиям микроделеций Y-хромосо-мы, проведенным с 1992 г. по 2000 г. среди 4868мужчин [5, 7, 8, 26]. При этом соотношение меж-ду различными типами выявленных нами делецийв целом отражает структуру делеционных наруше-ний в локусе AZF у мужчин с бесплодием (табл. 2;рис. 4) [26]._________________________372

За исключением одного пациента (код 40), умужчин с тяжелой олигозооспермией, имевшихмикроделеции локуса AZF, количество сперматозо-идов было менее 1 млн/мл (криптозооспермия —термин, который не оглашен Рекомендациями поспермиологическому анализу ВОЗ 1992 г. и 1999 г.)(табл. 3). По данным литературы, у большинства па-циентов с микроделециями AZF-локуса количествосперматозоидов составляло 0—1 млн/мл.

№ 8-2003

Таблица 4Нарушения сперматогенеза при различных типах делеций локуса AZF

(обобщенные собственные и литературные данные)

Субрегион

AZFa

AZFb

AZFc

AZFa-b

AZFb-c

AZFa-c

Гены-кандидаты

USP9Y (DFFRY), DBY

RBMY

DAZ1 - DAZ4

Гены -кандидаты соот-ветствующих субрегио-

нов AZF

Частота форм патозооспермии при делецияхэтих генов или субрегионов (собственные

данные/обобщенные литературные данные)

Азооспермия (100%/67%)Олигозооспермия тяжелой степени (0%/33%)

Азооспермия (-/68%)Олигозооспермия тяжелой степени (-/ 23%)

Олигозооспермия средней тяжести (-/9%)


Азооспермия (-/50%)Олигозооспермия тяжелой степени (-/50%)


Азооспермия (-/100%)

Нарушения сперматогенеза,выявленные при

гистологическом исследовании

Синдром «только клетки Сертоли»

Блок сперматогенеза на стадияхсперматоцитов или сперматид

Сниженная активность сперматогенезаили блок на уровне сперматид




Одним из наиболее сложных вопросов в областиисследований AZF-микроделеций остается выясне-ние генофенотипических корреляций [25]. Учиты-вая литературные данные и собственные результа-ты, наиболее характерные нарушения сперматоге-неза при различных типах делеций локуса AZFможно представить таким образом (табл. 4). Так, бо-лее крупные делеции, захватывающие два субрегио-на или весь локус AZF, ассоциированы с большейтяжестью нарушения сперматогенеза — СКС. Одна-ко при одних и тех же типах делеции Y-хромосомыи даже идентичных микроделециях может наблюда-ться вариабельность фенотипического проявления,что обусловлено влиянием большого числа генети-ческих факторов (хромосомные, генные, а возмож-но, и эпигенетические мутации), а также негенети-ческих факторов (инфекции, гипогонадизм, вари-коцеле и другие), оказывающих влияние на сперма-тогенез.

Микроделеции AZFa-субрегиона (делеционныйинтервал 5 С) чаще всего связаны с азооспермией иотсутствием половых клеток в извитых семенныхканальцах — с СКС [12, 24-26, 57] (табл. 4). В двухвыявленных нами случаях, как и в других пяти со-общенных ранее микроделециях AZFa-субрегиона,захватывающих оба «кандидатных» гена — USP9Y иDBY, — также отмечали азооспермию в сочетаниис СКС [12, 24].

У обследованных нами мужчин с делециямиAZFb+c и AZFc спермиологическая и гистологиче-ская картина также была сходна с данными другихисследований (табл. 4). При делециях, захватываю-щих субрегионы AZFb и AZFc, у всех мужчин, заисключением одного пациента (код 40) была выяв-лена азооспермия и СКС II, а в ряде случаев — блок

сперматогенеза в прелептотене-зиготене I мейоза.При изолированных делециях AZFc отмечена вари-абельность количества сперматозоидов (от олигозо-оспермии тяжелой степени до азооспермии), поданным гистологического исследования и КА НПК— от блока сперматогенеза на допахитенных стади-ях и стадиях делений созревания до СКС.

Определение зависимости степени нарушениясперматогенеза от размера и локализации делецийможет иметь некоторое прогностическое значение вплане возможности получения сперматозоидов,пригодных для проведения ИКСИ либоКРИО-ИКСИ [3, 10, 34, 35, 50]. Так, наличие деле-ций, захватывающих субрегионы AZFa и/или AZFb,указывает на невозможность получения зрелых по-ловых клеток, а у пациентов с делециями AZFc (прибиопсии яичка, ТЕЗА, ТЕЗЕ или с помощью другихметодик) примерно в 50—70% случаев удается полу-чить зрелые сперматозоиды [35, 41, 50].

Гистологическое исследование биоптата яичкабыло выполнено у пяти мужчин с делециямиAZF-локуса, у четырех из них наблюдали СКС, ау одного — блок сперматогенеза на стадии спер-матид, у всех мужчин сперматозоиды отсутствова-ли (табл. 3). Среди обследованных нами пациен-тов с микроделециями Y-хромосомы сперматозо-иды, пригодные для ИКСИ, были получены с по-мощью ТЕЗА или других методик только у мужчинс микроделециями AZFc-субрегиона, у пациентовс делециями AZFa или AZFb-c сперматозоиды по-лучить не удалось.

Одной из проблем в определении генофенотипи-ческих корреляций и клиническом ведении пациен-тов с делециями локуса AZF является возможностьпрогрессирования нарушений сперматогенеза с воз-



растем [3, 10]. В нашем исследовании вариабель-ность показателей спермограммы в динамике на-блюдали у пяти пациентов (коды 9, 27, 28, 36, 40),кроме того, еще у четырех мужчин (коды 7, 12, 13,14) при повторных спермиологических исследова-ниях в эякуляте в некоторых случаях обнаруживалиединичные сперматозоиды, а в других — нет (табл. 3).

У трех пациентов с мироделециями субрегионаAZFc (коды 9, 28, 36) спермиологическое исследова-ние проводили многократно. У одного из них(код 28) в динамике (несколько лет) отмечали сни-жение количества сперматозоидов в эякуляте от оли-гозооспермии тяжелой степени до азооспермии(табл. 3). У другого мужчины с AZFc-микроделецией(код 27), было отмечено умеренное повышение чис-ла сперматозоидов с 400 тыс. до 950 тыс. на 1 мл по-сле курса сперматогенезстимулирующей терапии.Специфичного лечения нарушения сперматогенеза умужчин с делециями локуса AZF в настоящее времяне разработано. С одной стороны, обнаружение у па-циента делеции позволяет избежать этиопатогенети-чески не обоснованного гормонального или хирур-

гического лечения. С другой стороны, возможно, нестоит отказываться от проведения сперматогенезсти-мулирующей терапии у мужчин с микроделециямиY-хромосомы, в частности субрегиона AZFc, для по-лучения от них сперматозоидов, которые могли быбыть использованы при ИКСИ, а тем более от лече-ния сопутствующей патологии репродуктивной сис-темы. Однако при этом следует учитывать риск воз-никновения опухолей. Поскольку у пациентов смикроделециями AZF-локуса имеется вероятностьухудшения состояния сперматогенеза с возрастом,им может быть рекомендована криоконсервациясперматозоидов с целью их последующего использо-вания в циклах ИКСИ (КРИО-ИКСИ).

Обнаружение в осадке эякулята единичных спер-матозоидов у пациентов с синдромом де ля Шапел-ля (синдром ХХ-мужчин или XX-инверсии пола)[1], а также у мужчин с делециями локуса AZF, втом числе при СКС, свидетельствует о частичнойсохранности сперматогенеза в некоторых семенныхканальцах в отсутствие генов локуса AZF. На сегод-ня известно более 2 тыс. генов, участвующих в гене-

374

№ 8-2003

тическом контроле сперматогенеза человека, лока-лизованных как на аутосомах, так и половых хромо-осмах. Очевидно, что гены AZF-субрегионов не яв-ляются абсолютно критичными для гаметогенеза умужчин, однако их наличие и функциональная ак-тивность необходимы для нормального протеканияразличных этапов сперматогенеза. Сфера влиянияделеций AZF-локуса на мужской фенотип, по-ви-димому, ограничена репродуктивной системой исвязана с нарушением дифференцировки половыхклеток, часто приводящим к бесплодию.

Исследования уровня гормонов (ЛГ, ФСГ, Т идр.) при микроделециях не показали каких-либоспецифичных изменений уровней гормонов у паци-ентов с делециями AZF-локуса, в том числе средиобследованных нами мужчин (табл. 3). Однако былопоказано, что у мужчин с Y-микроделециями уро-вень ФСГ в сыворотке крови ниже, а ингибина В —выше по сравнению с мужчинами с бесплодием итяжелым нарушением сперматогенеза, не имев-шими микроделеций Y-хромосомы [23]. Крометого, при делециях, захватывающих субрегионыAZFb и/или AZFc, концентрация ингибина В сыво-ротки крови была выше, чем в случае делеций AZ-Fa-субрегиона. Уровень ингибина В у мужчин сAZF-микроделециями был примерно на 70% выше,чем у пациентов без Y-микроделеций. Дальнейшиеисследования необходимы для выяснения причинэтих различий. Эти данные говорят о том, что функ-ция клеток Сертоли может быть частично нарушенапри AZF-микроделециях и является важным факто-ром, определяющим степень нарушения спермато-генеза в случае микроделеций Y-хромосомы. Веро-ятно, при делециях локуса AZF функция клетокСертоли и Лейдига может быть частично нарушенавследствие дефектов межклеточных взаимодейст-вий или других механизмов.

В отличие от генов-кандидатов субрегионовAZFb и AZFc гены AZFa-субрегиона представленына хромосоме единственной копией, поэтому, веро-ятно, даже точковые мутации (как было показанодля гена USP9Y) могут вызывать нарушение спер-матогенеза и приводить к бесплодию у мужчин [53].Вероятно, делеции или мутации гена DBY, кодиру-ющего тестис-специфичную РНК-геликазу, нару-шают процесс метаболизма мРНК в дифференциру-ющихся мужских половых клетках, приводя к уси-лению их апоптотической активности.

Гены RBMY и DAZ, представленные на Y-xpo-мосоме в нескольких копиях, являющиеся «кан-дидатными» генами для субрегионов AZFb иAZFc, кодируют белки с РНК-связывающей ак-тивностью, которые участвуют в метаболизме но-восинтезированных РНК-транскриптов. Вероят-но, гены семейства RBMY играют важную роль настадиях пролиферации сперматогониев и при про-хождении сперматоцитов через стадии профазы Iмейоза, а их отсутствие или нарушение функции

может привести к блоку сперматогенеза на стадиисперматоцитов и, как следствие, к азооспермии[18, 19, 39, 57]. Продукты, кодируемые генамиDAZ, участвуют в метаболизме мРНК тестис-спе-цифичных генов, регулируя их экспрессию в диф-ференцирующихся половых клетках после мейозана этапах сплайсинга, транспорта, хранения и се-лективной трансляции мРНК вплоть до образова-ния зрелых сперматозоидов [15, 27, 46]. Делециигенов DAZ могут приводить к различной степенинарушения сперматогенеза — от снижения числасперматозоидов вплоть до СКС — либо блокусперматогенеза на уровне сперматид (делений со-зревания) [10, И, 45]. Вследствие многокопийно-сти генов RBMY и DAZ поиск мутационных нару-шений в них значительно затруднен. Ряд генов ло-куса AZF имеет гомологи, расположенные как наХ-хромосоме, так и на аутосомах [2, 10, 57]. Меха-низмы их межгенного взаимодействия, возможно-сти функциональной компенсации еще не извест-ны и требуют дальнейшего изучения.

Недавно были опубликованы сообщения об об-наружении у мужчин с бесплодием парциальных(частичных) делеций субрегиона AZFc, захватываю-щих 1—4 копии генов DAZ-кластера (DAZ1-DAZ4),выявленных с помощью техники Fiber FISH (FISH— флуоресцентная гибридизация in situ) и анализаSNP (однонуклеотидных полиморфизмов) [16, 22].Делеции, захватывающие гены DAZ1-DAZ4 иDAZ2-DAZ3, были обнаружены у 8—9,5% мужчин солигозооспермией тяжелой степени и не были вы-явлены у фертильных мужчин контрольной группы[И, 16, 22, 40]. Вероятно, в случае частичных деле-ций имеет место эффект снижения дозы гена. Одна-ко пока неизвестно, являются ли гены кластеровDAZ функционально идентичными. Дальнейшиеисследования позволят дать оценку степени функ-циональной идентичности или различия как много-копийных генов AZF-локуса, так и их гомологов.Эти данные будут необходимы для создания генети-ческой сети контроля сперматогенеза у человека.

У пациентов с делециями локуса AZF и олигозо-оспермией тяжелой степени помимо сниженногоколичества сперматозоидов отмечали ухудшение ихподвижности и морфологических характеристик —олигоастенотератозооспермию. Специфичных формнарушений морфологии сперматозоидов у пациен-тов с делециями локуса AZF не описано, за исключе-нием единственного случая глобулозооспермии, ве-роятно, патогенетически не связанного с делециейY-хромосомы [60]. Помимо генов DAZ субрегионAZFc содержит копии гена CDY1 (хромодомен хро-мосомы Y), функция которого связана с модифика-цией хроматина в дифференцирующихся мужскихполовых клетках [21]. Поэтому нельзя исключить,что потеря или дефекты функции генов CDY1 могутбыть в определенной степени ответственны за нару-шение данного процесса.



Сообщения об успешности проведения ИКСИу пациентов с AZF-микроделециями противоре-чивы. Некоторые исследователи сообщали об от-сутствии различий в частоте наступления оплодо-творения, имплантации эмбриона и беременности[41, 48]. Другие четко указывали на снижение час-тоты оплодотворения и ухудшение показателейсостояния эмбрионов при использовании сперма-тозоидов, полученных от мужчин с делециями влокусе AZF [56]. Среди обследованных нами па-циентов с делециями AZF-локуса, у которых спер-матозоиды были доступны для ИКСИ, частотаоплодотворения, дробления и наступления бере-менности была не ниже, чем в обычной группе па-циентов программы ИКСИ [3]. Низкие показате-ли оплодотворяющей способности сперматозои-дов, несущих Y-хромосому с микроделециями,могут быть причиной повышенного соотношениярождения девочек над мальчиками при использо-вании ИКСИ без выбора по полу (без преимплан-тационной диагностики) [56]. Данный вопрос тре-бует дальнейшего изучения.

По крайней мере, у пяти обследованных намипациентов делеции локуса AZF были определеныкак de novo (результаты обследования отцов неприведены). По данным литературы большинствомикроделеций AZF-локуса представляют собоймутации de novo, однако известно о случаях пере-дачи Y-микроделеций от отца сыну, в том числепосле проведенного ИКСИ [31, 33, 43, 52]. В рядеслучаев размер делеции у сына с бесплодием былбольшим, чем у его отца [56]. Вероятно, микроде-леции Y-хромосомы могут возникнуть как при де-лении гоноцитов и сперматогониев (в митозе), таки при I и II делениях созревания (в мейозе), а так-же в зиготе и в клеточных линиях у эмбриона [17].В тех случаях, когда мутации происходят при де-лениях дробления эмбриона и на последующихэтапах эмбрионального развития, возникает тка-невой либо гонадный мозаицизм. Возможностьтканевого мозаицизма подтверждается случаямиобнаружения микроделеций локуса AZF у двух ма-льчиков, зачатых с помощью ИКСИ, хотя микро-делеционный анализ, проведенный у их отцов сбесплодием, не выявил микроделеций Y-хромосо-мы в лимфоцитах периферической крови [33]. По-добный мозаицизм не может быть выявлен с по-мощью анализа AZF-микроделеций и характери-зуется присутствием в яичках пула клеток, несу-щих Y-делеции и клеток без Y-делеций, которыйможет проявиться очаговой сохранностью спер-матогенеза (например, СКС II). При этом соотно-шение размера пула клеток, несущих AZF-микро-делеции, и клеток без них должно коррелироватьсо степенью нарушения или сохранности сперма-тогенеза [10].

Вероятная частота носительства микроделеций,вычисленная из встречаемости делеций в Yq11 сре-

ди мужчин с бесплодием, оценивается примерно 1на 5000 мужчин. Таким образом, частота мутаций вданной области является одной из самых высоких ипримерно на порядок выше аналогичных показате-лей аутосомных локусов [57]. Однако микроделециилокуса AZF обнаруживают примерно в 3—5 разчаще, поэтому частота микроделеций Y-хромосомыравняется примерно 1 на 1000-1500 мужчин.

Исследования ДНК Y-хромосомы показали еевысокую полиморфность [30]. Вероятно, некото-рые субъекты в большей мере, чем другие, склоннык возникновению Y-микроделеций вследствие осо-бенностей структуры Y-хромосомы у них, носите-льством полиморфизмов ДНК, предрасполагаю-щих к таким потерям [10]. Основной причиной вы-сокой частоты микроделеций Y-хромосомы явля-ются ее нестабильность и склонность к потере ге-нетического материала. Возникновение делецийсвязано с наличием большого числа различных по-второв (Аш-повторов и др.), действием мобильныхгенетических элементов (эндогенных вирусов идр.), а также может быть вызвано потерей генети-ческого материала в случаях аберрантной рекомби-нации между гомологичными областями Х- иY-хромосом или несбалансированными обменамимежду сестринскими хроматидами Y-хромосомы[13, 17]. Результаты анализа делетированных ифланкирующих их последовательностей позволиливыявить общие точки разрыва, определить причи-ну и установить механизм образования различныхделеций в локусе AZF. Наиболее частой причинойвозникновения делеций Yqll является несбалан-сированная рекомбинация между двумя гомоло-гичными последовательностями эндогенного виру-са герпеса 15 (HERV15), фланкирующими субреги-он AZFa [32, 54], палиндромами Р5, Р4 и прокси-мальной или дистальной частью палиндромаР1 в случае делеций, захватывающих субрегионыAZFb и AZFc, а также ампликонами Ь2/Ь4 при де-лециях субрегиона AZFc [36, 47]. С учетом этихданных в настоящее время предложена новая клас-сификация микроделеций AZF-локуса: делециисубрегиона AZFa, вызванные рекомбинацией меж-ду двумя гомологичными последовательностямиHERV15yql/HERV15yq2 (размер 0,8 млн.п.н.), де-леции AZFb-c Р5/проксимальная часть PI (AZFb)(размер 6,2 млн.п.н.), Р5/дистальная часть Р1 (раз-мер 7,7 млн.п.н.), Р4/дистальная часть Р1 (размер7,0 млн.п.н.) и делеции субрегиона AZFc b2/b4(размер 3,5 млн.п.н.) [32, 36, 47].

В последнее время появилось несколько сооб-щений, указывающих на высокий риск рождениядетей с мозаицизмом по половым хромосомам исиндромом Шерешевского—Тернера у отцов, яв-ляющихся носителями микроделеций локуса AZF[29, 37, 44, 49]. Анеуплоидия по хромосоме Y,вследствие ее потери в дифференцирующихсямужских половых клетках или клеточных линиях

376

№ 8-2003

эмбриона, может привести к рождению детей ссиндромом Шерешевского—Тернера (кариотип45,X) и с двойственным развитием гениталий (мо-заицизм по половым хромосомам 45,X/46,XY) со-ответственно. При обследовании пациентов с ка-риотипом 45,X/46,XY в 33% случаев были выявле-ны микроделеции локуса AZF [49]. Кроме того,было показано, что, по крайней мере, около 15%пациентов с микроделециями субрегиона AZFcмогут являться носителями немногочисленногоклона клеток 45,X [29]. Таким образом, наличие ивыраженность мозаицизма по клону 45,X можетявляться одним из факторов генофенотипическойвариабельности при одних и тех же типах делецийи даже идентичных микроделециях.

Среди обследованных нами мужчин с делециямилокуса AZF у одного пациента с азооспермией былвыявлен мозаицизм 45,X/46,XY (код 30) (табл. 3).Анализ кариотипа по лимфоцитам периферическойкрови позволил обнаружить клон клеток, не несущихY-хромосомы в 10% исследованных метафаз (45,Х).Не исключено, что у других мужчин с делециямиAZF-локуса, мог быть мозаицизм 45,X/46,XY. Крометого, микроделеции Y-хромосомы, захватывающиесубрегион AZFc, были обнаружены у трех пациентокс синдромом Шерешевского—Тернера с кариотипом45,X/46,XY. Эти данные указывают на необходимостьпродолжения исследований в данной области.

Заключение

Сперматогенез — сложный многостадийныйпроцесс, в контроль, регуляцию и реализацию ко-торого у человека вовлечено более 2000 генов, сре-ди которых одно из центральных мест занимаютгены Y-хромосомы. Результаты молекулярно-гене-тических исследований убедительно свидетельст-вуют о том, что микроделеции локуса AZF являют-ся одной из наиболее частых (мажорных) генетиче-ских причин бесплодия у мужчин при таких фор-мах нарушения сперматогенеза, как азооспермия иолигозооспермия тяжелой степени. Наличие в дан-ной области группы генов, контролирующих диф-ференцировку мужских половых клеток, а такжеограниченность фенотипических проявлений на-рушением сперматогенеза и бесплодием у мужчинпри делециях локуса AZF указывают на высокуюфункциональную специализацию данного регионаY-хромосомы. Секвенирование, определение тон-кой структуры субрегионов AZF и картирование«горячих» точек разрыва позволило не только оце-нить их размеры и количество генов, но и глубжепонять причины и механизмы различных типов де-леций Y-хромосомы, по-новому определить основ-ные типы делеций AZF-субрегионов.

Выявление, помимо нарушения сперматогенезаи бесплодия у мужчин, других эффектов микроделе-ций Yq, таких, как повышенная частота нерасхож-дения половых хромосом, потеря Y-хромосомы в

линиях мужских половых клеток и клеток эмбрио-на, говорит о влиянии микроделеций Y-хромосомына различные биологические процессы, что требуетдальнейших исследований.

Обнаружение микроделеций Y-хромосомы по-зволяет установить генетическую причину наруше-ния сперматогенеза, избежать необоснованного ле-чения бесплодия у мужчин с микроделециями локу-са AZF, а также прогнозировать вероятность полу-чения сперматозоидов для проведенияЭКО/ИКСИ. Исходя из полученных нами результа-тов исследования и данных литературы, необходиморекомендовать проведение цитогенетического ис-следования, а затем — анализа микроделецийY-хромосомы всем мужчинам с бесплодием при ко-личестве сперматозоидов в эякуляте менее 5млн/мл, а также мужчинам из супружеских пар сбесплодием, которым планируется программа ЭКОили ИКСИ. После генетического обследования поего результатам должно быть проведено медико-ге-нетическое консультирование с оценкой степенириска рождения детей с нарушением репродуктив-ной функции. Так как при делециях Y-хромосомыповышен риск рождения детей с аномалиями и/илимозаицизмом по половым хромосомам (синдромомШерешевского—Тернера и др.), то данным супру-жеским парам необходимо рекомендовать проведе-ние соответствующей преимплантационной и/илипренатальной диагностики.

Список литературы1. Гаева Т.Н. Разработка метода количественного анализа не-

зрелых половых клеток из эякулята и выяснение степени его ин-формативности: Автореф. дисс. на соискание уч. степени к.м.н.- М., 1997; 15 с.

2. Гоголевский П.А., Гоголевская И.К. Y-хромосома и муж-ское бесплодие (обзор литературы) // Пробл. репрод. 1999. —№ 5, Т. 5. - С. 26-34.

3. Гоголевский П.А., Калугина А.С., Бондарев Д.А. и др.AZF-микроделеции и мужское бесплодие // Андрология и гени-тальная хирургия. — 2001. — № 4. — С. 73—77.

4. Захаров А.Ф., Бенюш В.А., Кулешов Н.П., Барановская Л.И.Хромосомы человека. Атлас — М: Медицина. — 1982. — 263 с.

5. Здановский В.М., Гоголевский П.А., Гоголевская И.К. и др.Тестирование микроделеций на Y-хромосоме у пациентов с раз-личными нарушениями сперматогенеза // Пробл. репрод. —2000. - Т.6, №6. - С. 56-59.

6. Курило Л.Ф., Любашевская И.А. Возможности количест-венного кариологического анализа анализа половых клеток эяку-лята // Тез. докл. XII научной конференции болгарскихаспирантов с международным участием. — М., 1990. — С. 52.

7. Логинова Ю.А., Нагорная И.И., Шлыкова С.А. и др. Моле-кулярно-генетический анализ микроделеций Y-хромосомы умужчин с тяжелыми нарушениями сперматогенеза // Мол. биол.2003. - № 1, Т. 37. - С. 74-80.

8. Логинова Ю.А., Нагорная И.И., Шлыкова С.А. и др. Цито-генетическое исследование и микроделеционный анализ локусовAZF у пациентов с азооспермией и олигозооспермией неясногогенеза перед проведением ИКСИ // Пробл. репрод. — 2000. —Т.6, № 5 - С. 27-33.

9. Черных В.Б., Курило Л.Ф., Гоголевская И.К. и др. Комп-лексное клинико-генетическое обследование пациентов с азоос-пермией или олигозооспермией неясной этиологии // Пробл.репрод. - 2001. - Т. 7, № 3,- С. 58-63.



10. Черных В.Б., Курило Л.Ф., Поляков А.В. Y-хромосома,AZF-микроделеции и идиопатическое бесплодие у мужчин //Пробл. репрод. - 2001. - Т. 7, - № 5, - С. 47-58.

11. Bienvenu Т., Patrat С., McElreavey К. et al. Reduction in theDAZ gene copy number in two infertile men with impaired spermato-genesis // Ann. Genet. - 2001. - Vol. 44, №3. - P. 125-128.

12. Blagosklonova O., Fellmann F., Clavequin M.C. et al. AZFadeletions in Sertoli cell-only syndrome: a retrospective study // Mol.Hum. Reprod. - 2000. - Vol. 6, № 9. - P. 795-769.

13. Blanco P., Shlumukova M., Sargent C.A. et al. Divergent out-comes of intrachromosomal recombination on the human Y-chromo-some: male infertility and recurrent polymorphism // J. Med. Genet.- 2000. - Vol. 37. - P. 752-758.

14. Calogero A.E., Garofalo M.R., D»Agata R. Factors influencingthe variable incidence of Y chromosome microdeletions in infertile pa-tients // Hum. Reprod. - 1999. - Vol. 14, № 2. - P. 275.

15. Cooke H.J., Lee M., Kerr S., Ruggiu M. A murine homolo-gue of the human DAZ gene is autosomal and expressed only inmale and female gonads // Hum. Mol. Genet. — 1996. — Vol. 5. —P. 513-516.

16. de Vries J.W.A., Repping S., van Daalen S.K.M. et al. Clinicalrelevance of partial AZFc deletions // Pert. Steril. — 2002. — Vol. 78,№ 6. - P. 1209-1214.

17. Edwards R.G., Bishop C.E. On the origin and frequency of Ychromosome deletions responsible for severe male infertility // Mol.Hum. Reprod. - 1997. - Vol. 3. - P. 549-454.

18. Elliott D.J. RBMY genes and AZFb deletions // J. Endocrinol.Invest. - 2000. - Vol. 23, № 10. - P. 652-658.

19. Elliott D.J., Millar M.R., Oghene K. et al. Expression of RBMin the nuclei of human germ cells is dependent on a critical region ofthe Y chromosome long arm // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1997. —Vol. 94. - P. 3848-3853.

20. Ferlin A., Moro E., Rossi A. et al. The human Y chromosome'sazoospermia factor b (AZFb) region: sequence, structure, and deletionanalysis in infertile men // J. Med. Genet. — 2003. — Vol. 40. —P. 18-24.

21.Ferlin A., Moro E., Rossi A., Foresta C. CDY1 analysis in infer-tile patients with DAZ deletions // J. Endocrinol. Invest. — 2001. —Vol. 24, № 2: RC4-6.

22. Fernandes S., Huellen K., Goncalves J. et al. High frequency ofDAZ1/DAZ2 gene deletions in patients with severe oligozoospermia //Mol. Hum. Reprod. - 2002. - Vol. 8, № 3. - P. 286-298.

23. Foresta C., Bettella A., Moro E. et al. Sertoli cell function in in-fertile patients with and without microdeletions of the azoospermiafactors on the Y chromosome long arm // J. Clin. Endocrinol. Metab.- 2001. - Vol. 86, № 6. - P. 2414-2419.

24. Foresta C., Ferlin A., Moro E. Deletion and expression analysisof AZFa genes on the human Y chromosome revealed a major role forDBY in male infertility. Hum. Mol. Genet. — 2000. — Vol. 9. - P.1161-1169.

25. Foresta C., Moro E., Ferlin A. Prognostic value of Y deletionanalysis. The role of current methods // Hum. Reprod. — 2001. —Vol. 16, № 8. - P. 1543-1547.

26. Foresta C., Moro E., Ferlin A. Y chromosome microdeletionsand alterations of spermatogenesis // Endocr. Rev. 2001. — Vol. 22,№ 2. - P. 226-239.

27. Habermann В., Mi H.-F., Edelmann A. DAZ (deleted in azo-ospermia) genes encode proteins located in human late spermatids andin sperm tails // Hum Reprod. - 1998. - Vol. 13. - P. 363-369.

28. ISCN (1995) An international system for human cytogeneticnomenclature. Ed. Mitelman F. // Cytogenetic Cell Genet. Karger. —1995. - 114pp.

29. Jaruzelska J., Korcz A., Wojda A. et al. Mosaicism for 45,X cellline may accentuate the severity 6f spermatogenic defects in men withAZFc deletion // J. Med. Genet. - 2001. - Vol. 38. - P. 798-802.

30. Jobling M.A., Samara V., Pandya A. et al. Recurrent duplicati-on and deletion polymorphism on the long arm of the Y chromosomein normal males // Hum. Mol. Genet. — 1996. — Vol. 5. — P.1767-1775.

31. Kamischke A., Gromoll J., Simoni M. et al. Transmission of aY-chromosomal deletion involving the DAZ and CDY genes from fat-her to son though ICSI // Hum. Reprod. — 1999. — Vol. 14. — P.2320-2322.

32. Kamp C., Hirschmann P., Voss H. et al. Two long homologousretroviral sequence blocks in proximal Yql 1 cause AZFa microdeleti-ons as a results of intrachromosomal recombination events // Hum.Mol. Genet. - 2000. - Vol. 9. - P. 2563-2572.

33. Kent-First M.G., Kol S., Muallem A. et al. The incidence andpossible relevance of Y-linked microdeletions in babies born after int-racytoplasmic sperm injection and their infertile fathers // Mol. Hum.Reprod. - 1996. - Vol. 2. - P. 943-949.

34. Krausz C., McElreavey K. Y chromosome and male infertility// Frontiers in Biosunce — 1999. Vol. 4. P. 1—8.

35. Krausz C., Quintana-Murci L., McElreavey K. Prognostic va-lue of Y deletion analysis: what is the clinical prognostic value of Ychromosome microdeletion analysis? // Hum. Reprod. — 2000. —Vol. 15, № 7. - P. 1431-1434.

36. Kuroda-Kawaguchi Т., Skaletsky H., Brown L.G. et al. TheAZFc region of the Y chromosome features massive palindromes anduniform recurrent deletions in infertile men // Nat. Genet. — 2001. —Vol. 29. - P. 279-286.

37. Le Bourhis, Siffroi C., McElreavey K. et al. Y chromosomemicrodeletions and germinal mosaicism in infertile males // Mol.Hum. Reprod. - 2000. - Vol. 6. - P. 688-693.

38. Lindblom В., Holmlund G. Rapid DNA purification for restric-tion fragment length polymorphism analysis // Gene Anal. Techn. —1988.-Vol. 5. -P. 97-101.

39. Ma K., Inglis J.D., Sharkey A. et al. A Y chromosome gene fa-mily with RNA-binding protein homology: candidates for the azoos-permia factor AZF controlling human spermatogenesis // Cell. —1993. Vol. 75. - P. 1287-1295.

40. Moro E., Ferlin A., Yen P.H. et al. Male infertility caused by ade novo partial deletion of the DAZ cluster on the Y chromosome //J. Clin. Endocrinol. Metab. — 2000. - Vol. 85, № 11. —P. 4069-4073.

41. Mulhall J.P., Reijo R., Alagappan R. et al. Azoospermic menwith deletion of the DAZ gene cluster are capable of completing sper-matogenesis: fertilization, normal embryonic development and pre-gnancy occur when retrieved testicular spermatozoa are used forintracytoplasmic sperm injection // Hum. Rep. — 1997. — Vol. 12. —P. 503-508.

42. Gates R.D., Silber S., Brown L.G., Page D.C. Clinical charac-terization of 42 oligospermic or azoospermic men with microdeletionof the AZFc region of the Y chromosome, and of 18 children concei-ved via ICSI // Hum. Reprod. - 2002. - Vol. 17, № 11. -P. 2813-2824.

43. Palka G., Dallapiccola B. Widening of a Y-chromosome inter-val-6 deletion transmitted from a father to his infertile son accounts foran oligozoospermia critical region distal to the RBM 1 and DAZ genes// Am. J. Hum. Genet. - 1996. - Vol. 59. - P. 1393-1395.

44. Papadimas J., Dimitrios G.G., Giannouli C. et al. Ambiguousgenitalia, 45,X/46,XY mosaic karyotype, and Y chromosome microde-letions in a 17-year-old man. Pert. Ster. — 2001. — Vol. 76. №6. —P. 1261-1263.

45. Reijo R., Lee T.Y., Salo P.et al. Diverse spermatogenic defectsin humans caused by Y chromosome deletions encompassing a novelRNA-binding protein gene // Nat. Genet. 1995. — Vol. 10. — P.383-393.

46. Reijo R., Seligman J., Dinulos M.B. Mouse autosomal homologof DAZ, a candidate male sterility gene in humans, is expressed inmale germ cells before and after puberty. Genomics 1996; 35:346-352.

47. Repping S., Skaletsky H., Lange J. et al. Recombination betwe-en palindromes P5 and PI on the human Y chomosome causes massivedeletions and spermatogenic failure // Am. J. Hum. Genet. — 2002. —Vol. 71. - P. 906-922.

48. Rossato M., Ferlin A., Garolla A. et al. High fertilization rate inconventional in-vitro fertilization utilizing spermatozoa from an oligo-zoospermic subject presenting microdeletions of the Y chromosomelong arm // Mol. Hum. Reprod. - 1998. - Vol. 4. — P. 473—476.

49. Siffroi J.P., Le Bourhis C., Krausz C. et al. Sex chromosomemosaicism in males carrying Y chromosome long arm deletions //Hum. Reprod. - 2000. - Vol. 15, № 12. - P. 2559-2562.

50. Silber S., Alagappan R., Brown L., Page D.C. Y chromosomedeletions in azoospermic men undergoing intracytoplasmatic sperm in-

378

№ 8-2003

jection after testicular sperm extraction // Hum. Reprod. — 1998. —Vol. 13. - P. 3332-3337.

51. Simoni M., Bakker E., Eurlings M. et al. Laboratory guidelinesfor molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletion // Int. J. An-drol. - 1999. - Vol. 22. - P. 292-299.

52. Stuppia L, Calabrese G., Franchi P.O. et al. Widening of a Y-chro-mosome interval-6 deletion transmitted from a father to his infertile son ac-counts for an oligozoospermia critical region distal to the RBM1 and DAZgenes // Am. J. Hum. Genet. - 1996. -Vol. 59. -P. 1393-1395.

53. Sun C., Skaletsky H., Birren B. et al. An azoospermic man witha de novo point mutation in the Y-chromosomal gene USP9Y // Nat.Genet. - 1999. - Vol. 23. - P. 429-432.

54. Sun C., Skaletsky H., Rozen S. et al. Deletion of azoospermia factor a(AZFa) region of human Y chromosome caused by recombination betweenHERV15 proviruses // Hum. Mol. Genet - 2000. - Vol. 9. - P. 2291-2296.

55. Tiepolo L., Zuffardi O. Localization of factors controlling sper-matogenesis in the non fluorescent portion of the human Y chromoso-me long arm // Hum. Genet. - 1976. - Vol. 34. - P. 119-124.

56. van Golde R.J., Wetzels A.M., de Graaf R., Tuerlings J.H.,Braat D.D., Kremer J.A. Decreased fertilization rate and embryo qua-

lity after ICSI in oligozoospermic men with microdeletions in the azo-ospermia factor с region of the Y chromosome // Hum. Reprod. —2001. - Vol. 16, № 2. - P. 289-292.

57. Vogt P.H., Edelmann A., Kirsch S. et al. Human Y chromoso-me azoospermia factor (AZF) mapped to different subregions in Yqll// Hum. Mol. Genet. - 1996. - Vol. - 5, № 7. - P. 933-943.

58. Vollrath D., Foote S., Hilton A. et al. The human Y chromoso-me: a 43-internal map based on naturally occurring deletions // Scien-ce. - 1992. - Vol. 258. - P. 52-59.

59. WHO (1999). Руководство ВОЗ по лабораторному исследо-ванию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов сцервикальной слизью. Четвертое издание. Cambridge UniversityPress, 1999. Пер. с англ. Р.А. Нерсесяна. Научн. ред. переводапроф. Л.Ф. Курило. М. — 2001. — 143 с.

60. Zeyneloglu H.B., Baltaci V., Duran H.E., Erdemli E., BatiogluS. Achievement of pregnancy in globozoospermia with Y chromosomemicrodeletion after ICSI // Hum. Reprod. - 2002. — Vol. 17, № 7. —P. 1833-1836.

MICRODELETION ANALYSIS OF AZF LOCUS IN INFERTILE MALES: COOPERATIVEEXPERIENCE OF RESEARCH WORK


CHERNYKH V . B . , KURILO L . F . , SHILEIKO L . V . , SHIRSHOVA L . S . ,CHUCHROVA A . L . , KOVALEVSKAYA Т . S . , POLYAKOV A . V . ; l

GOGOLEVSKY P . A . , KALUGINA A . S . , MORINA G . V . ; 2

TOGOBETSKY A . S . , ZDANOVSKY V . M . ; 3

GOGOLEVSKAYA I . К . , KRAMEROV D . A . 4

1 — National Research Centre for Medical Genetics of Russian Academy of Medical Sciences (RAMS), Moscow2 — Centre for Family Planning and Reproduction, Moscow3 — IVF Centre «EKO», Moscow4 — Engelhardt Institute of Molecular Biology of Russian Academy Sciences, Moscow

One of the major genetic causes male infertility are deletions in AZF locus (Yq11) that associated with various spermato-genesis abnormalities from hypospermatogenesis to «Sertoli cells only syndrome», appearing mostly azoospermia or severeoligozoospermia. During large-scale clinical and genetic examination of 514 infertile males microdeletion analysis of AZFlocus was performed. Y-chromosome deletions were founded in 43 cases: two AZFa-microdeletions, eight deletions AZFb-cand thirty-three microdeletion in AZFc-subregion. Frequency of revealed Y-deletion between azoospermic and oligozoos-permic males amounted to 12,7% and 8%, respectively. Detailed molecular analysis allows to define more precisely deletionintervals and to reveal their different size. Results of comprehensive clinical-genetic examination of patients with differenttypes AZF-deletions confirmed geno-phenotypic correlations prescribed in other investigations.

document4

Documents