实验须知(biochemist

ry)

基本操作

一、玻璃仪器的洗涤与清洁

（一）新购玻璃仪器的清洗：新购来的玻璃仪器，其表面附有游离质，可先用肥皂水洗侧，再用流水冲洗，浸泡 1 - 2 % Hcl 中过夜，再用流水冲洗，最后用蒸馏水冲洗 2 - 3 次，在干燥箱中烤干，或晾干备用。

一、玻璃仪器的洗涤与清洁（二）使用过的玻璃仪器清洗：

1 ．一般玻璃仪器：如试管、烧杯、锥形瓶等，先用自来水洗刷至无污物，再选用大小合适的毛刷故洗衣粉或肥皂水，将器皿内外壁细心刷洗，再用自来水冲洗干净，洗至容器内壁光洁不挂水珠为止，最后用蒸馏水冲洗 2 一 3 次，倒置在清洁处晾干，急用时可用干燥箱烤干。

一、玻璃仪器的洗涤与清洁2 ．容量仪器：吸量管、滴定管、容

量瓶等，使用后应立即浸泡于清水中，勿使沾污物质干涸，并及时用流水冲洗干净，稍干后再用铬酸洗液浸泡数小时，然后用自来水反复冲洗干净，最后用蒸馏水冲洗 2 一 3 次，晾干备用。

一、玻璃仪器的洗涤与清洁3 ．比色杯：用毕立即用自来水反

复冲洗干净，如洗不净时，可用盐酸或适当溶剂冲洗，再用自来水冲洗干净．切忌用试管刷或粗糙的布或纸擦洗，以免损坏比色杯透光度，亦应避免用较强的碱液或强氧化剂清洗，洗净后倒置晾干备用．

二、吸量管的种类和使用（一）分类生化常用的吸管有三类：

1 奥氏吸量管： 供准确量取 0.5mL 、 1mL 、 2 m

L 液体时用。每根吸管上只有一个刻度，放液时必须吹出最后残留在吸量管尖端的液体。

二、吸量管的种类和使用2 移液管：供准确量取 5mL 、 10

mL 、 25mL 等较多体积液体时用。每根吸量管上只有一个刻度，放出液体流毕后，将吸量管尖在容器内壁上继续停留 15 秒，注意不要吹出尖端内的最后部分．

二、吸量管的种类和使用3 刻度吸量管：供量取 10ml 以下的

任意体积的液体时用。每根吸量管上都有许多等分刻度，一般刻度包括尖端部分，欲将所量取液体全部放出时，须将残留管尖的液体吹出。在吸量管的上端常标有吹字，此类吸量管又称全流出式。

（二）吸量管的使用1 选择：使用前先根据需要选择适当的

吸量管，刻度吸量管的总容量最好等于或稍大于最大取液量．临用前要看清容量和刻度．

2 执管：用拇指和中指（辅以无名指），拿住吸管上部，用食指堵住管上口和控制液流．刻度数字要对向自己。

3 取液：另一只手捏压橡皮球，将吸量管擂入液体内（不得悬空，以免液体吸入球内），用橡皮球将液体吸至最高刻度上端 1 一 2cm 处，然后迅速用食指按紧管上口，使液体不致于从管下口流出。4 调准刻度：将吸量管提出液面，吸粘性较大

的液体时，先用毽纸擦干管尖外壁，然后用食指控制液流使之缓慢下降至所需刻度（此时液体凹面、视线和刻度应在同一水平面曰，立即按紧吸量管上口．

5 放液：放松食指，让液体自然流入受器内，放液时，管尖最好接触受器内壁，但不要擂入受器内原有的液体中，以免污染吸量管和试剂。6 洗涤：吸血液、血清等粘稠液体及标本( 尿液）的吸量管，使用后要及时用自来水冲洗干净。吸一般试剂的吸量管可不必马上冲洗，实验完毕后再冲洗。冲洗干净后，晾干去水分，再浸泡于铬酸洗液中，数小时后取出，再用流水冲净，最后用蒸馏水冲洗，晾干备用．

四、溶液的混匀（一）旋转混匀法用手持容器，使溶液

作离心旋转，适用于未盛满液体的试管或小 n 器皿，如锥形瓶。旋转试管时最好用手腕旋转。

（二）指弹混匀法左手持试管七端，用右手指轻轩弹动试管下部，使管内溶液作旋涡运动

（三）倒转混匀法适用于有塞量筒和容量瓶、试管内容物的混匀。一般试管内容物的混匀可用聚乙烯等薄膜封口，再用手按住管口倒转混匀。

（四）吸盘管混匀法用吸最管将溶液反复吸放数次，使溶液充分混匀。

（五）玻棒搅动法适用于烧杯内容物的混匀，如固体试剂的溶解和混匀．

（六）甩动混匀法右手持试管上部，轻轻甩动振摇，即可混匀．

（七）电磁搅拌混匀法在电磁搅拌机上放置烧杯，在烧杯内放人封闭于玻璃或塑料管中的小铁棒，利用磁力使小铁棒旋转以达到混匀杯中液体的目的。适用于酸碱自动滴定，梯度滴定等。

（八）振荡器混匀法利用振荡器使容器中的内容物振荡，达到混匀的目的．

五、过滤• 是分离沉淀和池液的一种方法，可用于收集滤液，收集或洗涤沉淀。生化实验的过德，操作与化学相同，应注意以下几点：（一）制备血滤液等实验过滤时，要用干掳纸而不能用水把滤纸先弄湿，因为湿滤纸会影响血液稀释的体积。（二）折叠滤纸的角度应与漏斗相合，使滤纸上缘能与漏斗壁完全吻合，不留缝隙。一般采用平折法（即对折后再对折）。

五、过滤（三）向漏斗中加溶液时最好使用玻棒引流，倒人速度不要太快，不得使液面超过浊纸上缘。

（四）较粗的过滤可用脱脂棉或纱布代替滤纸，有时可用离心沉淀法代替过滤法

六、离心机的使用方法• 欲使沉淀与母液分开，过滤和离心都可达到目的，但当沉淀粘稠，或颖粒大小能通过滤纸，总容最太少又稿定量测定时，使用离心沉淀法比过滤法要好．使用离心机前，应先栓查离心机转动状态是否平稳，以确定离心机的性能，检查套管与离心管大小是否相配，套管是否铺好软垫（用棉花、或橡皮）．套管底部有无碎玻片或漏孔（碎玻片必须取出，漏孔须修补好）。

六、离心机的使用方法• 检查合格后，将一对离心管放人一对套管

中，然后连交管一起分置粗天平两侧，用滴管向较轻的一侧离心管与套管之间加水，直至天平两侧彼此相等为止。将各对已平衡的套管连同内容物放投于离心机内，两个等重的管必须放于对称位置．放妥后，接通电源开关，逐步扭动转速旋钮，缓慢增加离心机转速，直至所濡的转速。达规定时间后．将转速旋钮逐步回零，待离心机停稳后，取出离心管．

Ⅱ 吸光分析㈠ 原理 光的本质是电磁波的一种，有不同的波长。

﹤400nm 的光线 （紫外线） 400～ 750nm 的光线（可见光） ﹥750nm 的光线（红外线）

• 光线通过透明溶液介质时，其辐射的波长一部分被吸收，一部分透过，因此光线射出溶液后，部分光波减少。可利用溶液对光线的吸收和透过的特性进行物质的定性定量分析。如：可见光通过有色溶液，或红外线通过多种气体时，部分被吸收。

I0 I

l

T =I/I0×100% A =-logTT(透光度） A(吸光度）

T和 A的关系： T 越大，则A越小；T越小则A越大。 A与溶液的性质（溶质），溶液的浓度，溶液的厚度等密切相关，它们之间的关系可用 Lambert-Beer 定律表示：

• Lambert-Beer 定律 A=KCl or A=εClK（吸光常数） C（溶液浓度） L （溶液厚

度）K的定义 :与 C、 l 无关，表示的是单位浓度

的溶液，单位厚度的比色皿中，在一定波长下的吸光度。

（与溶质、温度、入射波长及仪器等相关，这些条件一定时为常数。K的单位： C为 g/L ， K为吸光率 C 为 mol/L,k为摩尔吸光率，用 ε表示

•A与入射光线波长 (λ)的关系 溶液对光线有选择性地吸收作用，对不同波长的光线的吸收能力不同，即物质对某一波长的光线有最大吸收（最大吸收波长 λmax）。

Lambert-Beer公式是吸光分析进行物质定量测定中用到的基本公式，通过公式我们可由测得的 A来推算出溶液的浓度 C。

㈡ 吸光分析的计算⒈ 公式法：样品量少时，根据标准管求未知溶液的浓度或含量标准管：与被测溶液物质相同，浓度已知（ CS ）样品管：浓度未知（ CX ）标准管和样品管同样处理后读取吸光度，测得 AS,AX

CX=CS×AX/AS

AS=CS

AX=CX

AS=KSCS

LS

AX=KXC

XLX

⒉ 标准曲线法 样本量大时，根据标准曲线求物质的含量或浓度

作法：一为样品管（浓度未知 CX）； 配置 5-10 个不同浓度的标准溶液，按一定

操作方法处理显色后，最大波长读取吸光度，得到 A1-A5→以溶液浓度 C为横坐标，吸光度 A为纵坐标，在坐标纸上作图，若被测物质对光的吸收符合 Lambert-Beer公式 ,则得到一条通过原点的直线，即标准曲线也称工作曲线

＊＊ ＊

＊＊

C

A

Folin- 酚试剂法测定蛋白质浓度的标准曲线721型分光光度计， 2006年 9月 13日

CX

AX

• 注意事项：⑴ 作一条标准曲线至少要 5 个点，为减少误差每个

标准管应作 2 个平行管⑵ 一条标准曲线，如果测定条件（试剂、方法、仪

器等）不变，可供多次使用，否则应重新绘制。⑶ 被测物质与标准物质应用相同的方法、试剂、仪

器和温度⑷ 制作标准曲线应写上标准曲线的名称、日期仪器型号⑸ 标准曲线中标准物浓度有一定的线性范围，应使

标准曲线范围在被测物质浓度的 1/2～ 2倍之间，并使吸光度在 0.05～ 1.0范围为宜。

⒊ 摩尔吸光率法（ A=εCL ） 标准溶液为 1mol/L ， L 为 1cm 时，

根据 A=εCL, 此时的 A =ε, 测得 ε值 CX=AX/ε

特点： ε值不易测准确，则误差大，普通实验条件不能达到该法要求的精确度