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酶工程（二）

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四、酶催化反应机理及反应动力学

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（二）酶的催化反应机理1 酶的活性中心指酶分子中直接和底物结合，并和酶的催化作用

直接有关的部位。（ 1 ）结合基团：与 S 结合的基团。（ 2 ）催化基团：直接参与催化反应的基团。酶的活性部位，不仅决定酶的专一性，同时对 E

的催化性质起决定作用。活性部位的基团都是必需基团，必需基团还包括

活性部位以外的，对维持空间构象必需的基团。

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2 关于酶与底物分子结合的假说

（ 1 ） . 中间络合物学说：底物先与酶结合成不稳定的中间络合物，然后再分解释放出酶与底物

证实： H2O2 + 过氧化物酶 （ H2O2 — 过氧化物酶） （ 褐色） （ 红色） 645\587\548\498nm 561\550nm

（ H2O2 — 过氧化物酶） + AH2 过氧化物酶 + A + 2H2O （ 红色） （ 褐色）

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（ 2 ）锁－钥匙学说： 1890 年 Fisher 提出。 该学说认为酶的天然构象是刚性的，如果底物分子结构上存

在着微小的差别，就不能契入酶分子中，从而不能被酶催化。

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（ 3 ）诱导－契合假说 :Koshland 提出当酶分子与底物接近时，酶蛋白受底物分子的诱导，

其构象发生了有利于底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。

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（三）酶催化反应的速率理论基础知识： 在反应体系中，任何反应分子都有进行化学反应的可

能，但只有能量达到或超过某一限度（能阈）的活化分子，才能在碰撞中起化学反应。

能阈——活化能：活化分子处于活化态，活化态与常态的能量差，也就是分子由常态转变为活化态所需的能量称为活化能。

达到或超过能阈的分子——活化分子 活化分子越多——反应速度越快。 提高活化分子数量的途径 ① 对反应体系加热，照射 ② 降低活化能

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2. 酶高效催化的理论 酶催化能够降低活化能，

是非酶催化 1/3 以下。

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（ 1 ）邻近和定向效应（ 2 ）酸碱催化（ 3 ）张变和扭曲效应（ 4 ）共价催化（ 5 ）多元催化与协同效应

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（四）酶催化反应动力学1 概念• 热力学：研究一个反应能否

进行，进行的程度（反应物转化成产物的多少），只考虑始态、终态，不考虑历程（如何反应）。

• 化学动力学：研究（ 1 ）反应速度（ 2 ）反应条件对速度的影响（ 3 ）反应步骤（ 4 ）反应机理（以便估价、控制、应用）。

• 酶促反应动力学：研究酶促反应的速度和影响此速度的各种因素以及反应历程。

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2 底物浓度 [S]对酶促反应速度 V 与底物浓度 [S] 的关系Michaelis&Menten 提出的著名

的米氏方程根据如下现象的观测当底物浓度较低时候，反应速

率与底物浓度成正比，即符合一级反应动力学；当底物浓度较高时，反应速率与底物浓度无关，即符合零级反应动力学

当酶的浓度大大小于底物浓度时，反应速率与酶的加入量成正比

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根据中间络合物假说， Michaelis&Menten 提出单底物酶催化的反应机理如下：

式中， E代表游离酶， ES 为酶与底物的复合物； S 为底物； P 为产物； k+1,K-1,k+2 为相应各步反应的反应速率常数。

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Michaelis&Menten 进一步假设：① 与底物浓度 [S]相比，酶的浓度 [E]很小，因而可忽略由于生成中间复合

物 ES 而消耗的底物② 考虑反应的初始状态，此时产物 P 的浓度为零，可忽略反应的逆反应的

存在③ 假设基元反应 ES E+P 的反应速率最慢，为上述步骤的控制步骤，而

S+E ES 的反应速率很快，可快速达到平衡状态。在此基础二人提出了“米氏方程”：其中 Vmax 是酶反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，单位为 mol/L

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3 温度对酶催化反应速率的影响在 Topt之前， T↑ 、 V↑ T=10△ ℃，

反应速度增加 1～ 2倍在 Topr之后， T↑ 、 V↓注意：（ 1 ）动物体内最适 T 一般 30-50℃，

植物 40-60℃，有少数酶能耐较高的温度，如某些细菌中分离的DNA 聚合酶，最适温度可达 70℃，细菌淀粉酶在 93℃下活力最大。

（ 2 ）最适 T ，不是酶的特征常数，它与酶作用时间的长短、底物种类以及 PH 有关。

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4 pH 对酶催化反应速率的影响每一种酶只能在一定 pH 下才能表现酶反应

的最大速度，高于或低于此值，反应速度都会下降，通常称此 PH 值为酶反应的最适 PH 值。

（ 1 ）一般酶最适 PH4 － 8 ，植物 5 － 6.5 动物 6.5 － 8

（ 3 ）最适 PH 与等电点不一定

例如：• 胰 pr.E ： Phopt=7.7～ 8.1• 蔗糖 E ： pr.E ： Phopt=3.0～ 7.5• 胃 pr.E ： Phopt=1.5～ 2.2

酶有最适 PH 的原因（ 1 ） pH 影响 E 结构的稳定性，过酸、过

碱会强烈影响酶蛋白的构象，甚至使 E 变

性失活。（ 2 ） PH 影响 E 分子上某些基团的解离状

态（ 3 ） PH 影响 S 分子某些基团的解离状态。

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5 激活剂对酶催化反应速率的影响

• 定义：凡能提高酶活的物质均为激活剂• 种类：（ 1 ）无机离子：

① 金属离子： K+ 、 Na+ 、 Ca2+ 、 Mg 2+ 、 Cu 2+ 、 Zn 2+ 、 Fe 2+ 、 Mn 2+ 、 Mo 2+ 。

② 阴离子： Cl— 、 Br—

（ 2 ）有机小分子： Vc 、 Cys 、 GSH 可使含 E—SH 处于还原态。

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6. 抑制剂对酶催化反应速率的影响

1 ）抑制的作用① 失活作用：凡使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用。② 抑制作用：使酶活力下降，但并不引起酶蛋白变性的作用。

（此作用使一部分酶的必需基团或辅助因子失活（活力变小））。

2 ）抑制类型① 不可逆抑制： I 与 E 共价结合，是一不可逆反应，二者结合

后，不能透析除去抑制剂而恢复酶活力，称为不可逆抑制作用。

② 可逆抑制： I 与 E 非共价结合，为可逆反应，透析能除去抑制剂使酶恢复活力，称为可逆抑制作用。

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四 酶的固定化和固定化酶的反应器

（一）为什么要固定化酶（二）酶固定化的优缺点（三）酶的固定化方法（四）固定化酶反应器

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（一）为什么要固定化酶

传统酶（自由酶）催化反应存在如下缺点① 传统酶催化反应几乎都在水溶液中进行，只能一次性使

用，难以回收② 酶与产物混合，增加产物分离和纯化难度③ 溶液中酶的稳定性差，容易变形和失活。 而将酶固定化能够克服这些缺点。

相对于酶直接加入至溶液中，通常将固定化酶的制备过程称为酶的固定化。该项技术于 20世纪 60 年代发展起来的， 1971 年第一届国际酶工程会议正式建议采用固定化酶的名称。

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（二）酶固定化的优缺点

1 、酶固定化的优点：固定化酶最大的特点就是既有生物催化剂的功能，又有固相催化剂的特点：

① 可以重复使用，在大多数情况下，稳定性明显提高② 催化后，酶与底物容易分开，产物易于分离纯化，质

量提高③ 反应条件易于控制，可实现反应的连续化和自动控制④ 酶的利用效率高了，单位酶量催化的底物浓度增加，

而酶量减少⑤ 更适合于多酶催化反应

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2 、固定化酶的缺点① 存在着酶失活现象，尤其是共价法固定② 消耗固定化材料，增加成本③ 酶被固定到载体后将增加底物和产物的传质阻力

以此，考虑固定化酶的优缺点，在工业采用固定化还是液态的，应该根据具体情况分析而定。

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（三）酶的固定化方法1 载体结合法：将水不溶性的载体与酶

结合形成固定化酶的方法。

（ 1 ）物理吸附法：使酶直接吸附在载体上的方法称为物理吸附法。常用的载体有 : a 有机载体 , 如面筋、淀粉等 ;b 无机载体 , 如氧化铝、活性炭、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、硅胶等

（ 2 ）离子吸附法：此法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体结合。此法在工业上应用较广泛 , 常用的载体有 : (1) 阴离子交换剂 , 如二乙氨基乙基 (DEA E) －纤维素等 ; (2) 阳离子交换剂 , 如羧甲基 (CM ) －纤维素、纤维素－柠檬酸盐等。

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（ 3 ）共价偶联法：将不溶性载体与酶蛋白以共价键形式结合成固定化酶的方法，包括重氮法、肽键法和烷化法等。

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2 、包埋法：包埋法是将游离酶包埋于格子或微胶囊内，格子的结构可以防止酶渗出到周围的培养基中，而底物分子仍能渗入格子内与酶接触。

又可分为：聚合物包埋法、疏水相互作用法、

微胶囊包埋法、脂质体包埋法

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3 、交联法利用双功能或多功能试剂 ,使酶分子之间或酶蛋白与其它惰性蛋白之间发生交联 ,凝聚成网状结构 , 对酶行固定。戊二醛是应用最广泛的双功能试剂

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六、酶工程的应用

• 酶工程的应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。

• 另外在环境保护、能源开发上也有应用。

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应用一：酶法生产高果糖酱

1 ：为什么要生产高果糖酱果糖的甜度是葡萄糖的 1.7倍，而且甜味纯正

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2 ：需要用到的酶：淀粉酶、糖化酶、葡萄糖异构酶等3 ：工艺流程示意图

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应用二、酶法合成丙烯酰胺合成

1传统的丙烯酰胺合成生产及其缺点传统丙烯酰胺合成合成：丙烯 腈与丙酮在催化剂浓硫酸 缺点：反应物浓度低，转化率低，反应物中残留金属铜

合丙烯腈，影响产品质量2 酶法合成丙稀酰胺腈水合酶催化条件温和、产率高，没有副产物3. 酶法合成

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应用三：酶法生产 L-氨基酸

1 氨基酸的用途：人体必须氨基酸：赖氨酸、蛋氨酸、色氨

酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸

补充营养和治疗某些疾病增味剂和畜禽的饲料高分子材料：聚赖氨酸

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2 化学合成——酶拆分方法氨基酸酰化酶1969 年，该酶被固定在 DEAE-葡聚糖载体上，

是世界上第一个固定化酶。

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3 、酶法工艺生产 L-氨基酸

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应用四 酶法合成、半合成抗生素生产的重要中间体

1 、酶法的好处：发酵法存在一些缺点：抗菌谱窄、副作用大等。而酶法则可生产抑制耐药性和新型广谱抗生素

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β-内酰胺环是青霉素的有效成分，若对青霉素分子进行改造，可通过三种途径，即更换侧链、改造羧基和改造母核，一般第一种较多。

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2 、合成过程：青霉素酰化酶

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作业

1. 酶作为生物催化剂有哪些特性2. 请简单列出微生物发酵生产酶制剂的工艺过程。