1

DNAの精製操作を要しない

簡便・迅速な形質転換技術

東京工業大学 生命理工学院助教 金子 真也

4.新技術説明会について（実施後フォローアップ、来年度の実施） 【産連展開部（産学連携支援Ｇ）】

2

・プラスミドDNAを保持する大腸菌や枯草菌を溶菌させ、溶菌液を用いて形質転換を行う方法を提供する。

概要

・ドナー宿主(大腸菌、枯草菌)を、ファージ感染や界面活性剤などを利用して溶菌させる。

・溶菌液を直接、または添加剤を添加後、レシピエント宿主(大腸菌、枯草菌、酵母など)と接触させる事によりプラスミドDNAをレシピエント細胞内に導入し形質転換を行なう。

・生化学的精製操作を経ず異宿主間のベクターDNA移動ができるため、迅速かつ簡便な遺伝子導入が可能。特に精製過程でダメージを受けやすいサイズの大きなDNAに対して効果的。

・多種類のＤＮＡの評価・スクリーニングや長鎖DNA(ゲノム)合成をハイスループットに行うには極めて有効な方法。

3

細胞外核酸を利用する形質転換法「溶菌法」

“精製された”プラスミドベクター

大腸菌でクローニング

ゲノム

コンピテント枯草菌

ゲノム

プラスミドマーカーで選択

“精製された”・DNA断片・PCR産物・合成遺伝子

“精製された”プラスミド

ラムダファージによる溶菌誘導

溶菌液中でプラスミドは安定な細胞外核酸

細胞外核酸精製ステップのない形質転換が可能！

Cell Lysis Technology to provide transformable Extra-cellular DNA (CELyTED)

4

発表内容

1) 大腸菌から枯草菌への溶菌液を利用した形質転換

2) 枯草菌から出芽酵母への溶菌液を利用した形質転換

3) 従来法(一般的なプラスミド精製→形質転換)との比較

4) 活用事例； プラスミドライブラリーの評価長鎖DNA(ゲノム)合成

6) 知的財産権、お問合せ先

5) 実用化に向けた課題、企業への期待、

5

大腸菌 (E. coli)λcI857 溶原化株

LB

30℃

37℃以上(over 37℃)

GFPuv

tetLrepA

Dtet

bla

pGETSGFP17.1 kb

pBRori

B.subtilis ori

ラムダファージで溶菌させた大腸菌から溶液中へ放出されるプラスミドDNAは予想外に安定

phage細胞外 plasmid

λcI857

plasmid

大腸菌ゲノム

溶菌lysing

(kb)

5.6

21.2

4.9

5.8

7.4

M’

EcoRI

23

M

c.c.c.

9.4

6.6

超遠心を用いてプラスミドDNAの精製を試みた結果、溶菌直後の溶液中にはプラスミドが意外に安定に存在していることが確認された

Uptake of excpDNA by competent B. subtilis

Genome

oriC

terC

枯草菌(B. subtilis)

Transport across the cytoplasmic mem-brane and DNA processing. In both B.subtilis and N. gonorrhoeae, similar poly-topic membrane proteins (ComEC and ComA,respectively) are required for DNA trans-port into the cytosol (8, 33). These large pro-teins (ComEC contains 776 residues) areproposed to form channels for the passage ofDNA (34). In addition, the Gram-positivesystems encode a membrane-bound ATPase,ComFA, that functions in DNA uptake (35).ComFA resembles the family of Asp-Glu-Ala-Asp (DEAD) box helicases, and mayassist the translocation of DNA through themembrane or carry out strand separation. InS. pneumoniae, the membrane-associatedEndA nuclease degrades the nontransform-ing strand, even when the ComEC equivalentis absent (10). In B. subtilis, the identity ofthe corresponding nuclease is unknown, butdegradation of the nontransforming strandseems dependent on passage through orinteraction with ComEC (12).

Cellular location of DNA uptake and therole of cytosolic proteins. In B. subtilis,which is a rod-shaped bacterium, DNAbinding and uptake take place preferentiallyat the cell poles, where the membrane-associated proteins ComGA and ComFAand the cytosolic ssDNA binding protein

YwpH colocalize (36). Several additionalcytosolic proteins participate in transfor-mation, and some have been shown to as-sociate with ssDNA entering the cell. In S.pneumoniae, the Smf protein protects trans-forming DNA from degradation in thecytosol (37). The repair/recombination pro-teins RecN and RecA also localize to thepoles of competent B. subtilis (38). RecNoscillates from pole to pole, but becomesstatic at one pole when transforming DNAis added. RecA localization depends onComGA; when DNA is added, RecA formsa filament extending from the pole to thecentrally located nuclear body, perhaps fa-cilitating the search for a homologous siteon the chromosome.

A transformation model. We propose thatrepeated cycles of Y-pilus assembly anddisassembly drive a DNA molecule throughthe cytoplasmic membrane channel formedby ComEC and that an unidentified DNAbinding protein anchors DNA to the Y-pilus.ComEA may ensure processivity by main-taining contact with DNA as these cyclespush DNA through the channel (8). Theproton motive force might drive disassemblyof the Y-pilus. Finally, the binding energy ofcytosolic ssDNA binding proteins mightprovide a pulling force by a Brownian

ratchet mechanism (39), and the helicase/translocase ortholog ComFA may also assistuptake.

ConjugationMost bacterial and some archaeal speciesencode conjugation systems, and severalclasses of mobile elements exist, includingself-transmissible and mobilizable plasmids,conjugative transposons, and integrative con-jugative elements (40). We will restrict thediscussion to a few of the better-characterized,plasmid-encoded conjugation systems ofGram-negative bacteria and draw on examplesfrom the Gram-positive bacteria where infor-mation is available.

The conjugation apparatus is composedof a cell-envelope–spanning translocationchannel and either a pilus for Gram-negativebacteria or surface-localized protein adhe-sins for Gram-positive bacteria (Fig. 1B)(41, 42). The mating pair formation (Mpf)proteins elaborate the extracellular pilus,and these subunits plus the coupling protein,here termed the substrate receptor, mediatesubstrate transfer across the cell envelope(43, 44). Agrobacterium tumefaciens elabo-rates a model conjugation machine from 11Mpf subunits, VirB1 to VirB11, and theVirD4 substrate receptor, to deliver onco-genic transferred DNA (T-DNA) to suscep-tible plant species (45). Many plasmidconjugation systems, exemplified by trans-fer systems of plasmids R388, F, and RP4,are built from nearly complete sets of VirB/D4-like subunits, whereas other systemshave only one or two discernible homologs(41, 42, 44–47). Conjugation and ancestrally-related translocation machines make up thelarge and functionally versatile family oftype-IV secretion systems (46–48).

Processing of the conjugative-transferintermediate. The processing of substrateDNA for conjugative transfer is a widelyconserved reaction among Gram-negativebacteria and unicellular Gram-positive bacte-ria (Fig. 1B) (49). A relaxase plus one ormore auxiliary factors initiate processing bybinding the origin-of-transfer (oriT) se-quence and cleaving the DNA strand des-tined for transfer (T-strand). The relaxaseremains covalently bound to the 5¶ end of theT-strand, resulting in the formation of therelaxase–T-strand transfer intermediate. Thisprocessing reaction clearly is distinct fromthe strand-specific degradation pathwaysoperating during transformation. Also incontrast to the competence systems, signalsconferring substrate recognition are carriednot by the DNA but by the relaxase; theseminimally consist of positively charged orhydrophobic clusters of C-terminal residuesand are found in other protein substrates aswell (50–52). Conjugation systems thus arecurrently viewed as protein-trafficking sys-

ATP

ADP + Pi

PMF

CGA

GB

EA

ECFA

DNA-binding protein (?)

nuclease (?)

ssb proteins

RecA

chromosomal DNA

exogenous DNA

membrane

ψ-pilins

Fig. 2. DNA uptake during transformation in B. subtilis. The uptake machinery is preferentially locatedat the cell poles. The Y-prepilins are processed by the peptidase and translocate to the outer face ofthe membrane. With the aid of the other ComG proteins, the major Y-pilin ComGC assembles intothe Y-pilus, which attaches exogenous DNA via a hypothetical DNA binding protein. Retraction of theY-pilus, driven by the proton motive force, and DNA binding to the receptor (ComEA) are required totransport one strand of DNA through the membrane channel (ComEC) while the other is degraded byan unidentified nuclease. The helicase/DNA translocase (ComFA) assists the process, along withssDNA binding proteins that interact with the incoming DNA. RecA forms a filament around thessDNA, and mediates a search for homology with chromosomal DNA. ADP, adenosine diphosphate; Pi,inorganic phosphate; PMF, proton motive force; ssb, single-stranded DNA binding protein.

G E T T I N G A C R O S S T H E M E M B R A N EG E T T I N G A C R O S S T H E M E M B R A N E

2 DECEMBER 2005 VOL 310 SCIENCE www.sciencemag.org1458

SPECIA

LSECTIO

N

自然形質転換能

1) 大腸菌から枯草菌への溶菌液を利用した形質転換

6

大腸菌λ溶菌 → 安定プラスミド(溶液中) → 枯草菌形質転換Ab

s(O

D 6

00)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 時間 (h）0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0E.coli ; 30℃E.coli ; 30℃→ 37℃

shift

Kaneko and Itaya (2010) J. Biochem. 147:819-822

DNase I による分解→阻害

プラスミドを保持する大腸菌

30˚C in LB

E.co

li

37˚C~42℃5 h1〜2h

37˚C 1hr

枯草菌コンピテント化

枯草菌形質転換体選択プレートB.

subt

ilis

Mixture

GFPuv

tetLrepA

Dtetbla

pGETSGFP17.1 kb

pBRori

B.subtilisori

Itaya and Kaneko (2010) Nucleic Asid Res 38:2551-2557

UV

DNase I (-) (+)

Day

light

M

(kb)

4.3

23

6.69.4

2.32.0

EcoRV digestion

大腸菌

TF 枯草菌

TF

レシピエント宿主ドナー宿主

1) 大腸菌から枯草菌への溶菌液を利用した形質転換

λ溶原株

7

条件検討；ビルレントλ(λgt10)の活用大腸菌溶菌→安定プラスミド(溶液中)→枯草菌形質転換

E.co

li

37˚C 1hr

5mLLB Ap 溶菌

Mix

ture

Plating

枯草菌168trpC2 GFPuv

tetLrepA

Dtet

bla

pGETSGFP

17.1 kb

pBRori

B.subtilis ori

37˚C (O/N)

λ非溶原性大腸菌(DH10B)

Abs

(OD

600

)

(hour)

E.coli ; λgt10 −E.coli ; λgt10 ＋

X103

Num

ber o

f col

ony

(ml-1

)2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 23 2500

5

2

43

1

67

2540 2 6 8 10 12 14 16 18 200

0.20.40.60.81.01.21.4

λgt10(OD;0.2)

23

(hour)

89

37℃

温度一定(37℃)で操作が可能

λgt10

ゲノム

1) 大腸菌から枯草菌への溶菌液を利用した形質転換

8

条件検討；ヌクレアーゼ阻害剤E.

coli

37˚C 1hr

5mLLB Ap 溶菌

Mix

ture

Plating

枯草菌168trpC2

37˚C (O/N)

λ非溶原性大腸菌

λgt10

・HB101 (endA1+)

アウリントリカルボン酸(ATA)

ヌクレアーゼ阻害剤

全ての大腸菌株に適用可能ATA (mg/mL)

・DH10B (endA1-)

1) 大腸菌から枯草菌への溶菌液を利用した形質転換大腸菌溶菌→安定プラスミド(溶液中)→枯草菌形質転換

0

25

50

75

100

4.0

125

16.5

51.5

0 01.0 1.5 2.0 2.5 3.0 5.0

150

175

200

225

173.3

0

Num

ber o

f col

ony

(ml-1

)

DH

10B

250

HB101: endA1+

0 0.5

9295

3.35

9

1) 大腸菌から枯草菌への溶菌液を利用した形質転換・マルチウェルプレートによるハイスループット化

1.2%LB agar

Mix 1h 37℃

溶菌

λgt10 Virulent Phage 枯草菌

168trpC2

37˚C (O/N)

プラスミド保持大腸菌ライブラリー

・巨大プラスミド(BACクローン)への適用

repA tetLrepE

kam

oriSparA

parBparC

BAC[R]

BAC[L]

Giant plasmid95kb~116kb

Insert(80kb~101kb)

大腸菌-枯草菌シャトルBACクローン

A 全長; 95kb(insert 80kb)

B 全長; 115kb(insert 100kb)

C 全長; 116kb(insert 101kb)

形質転換体Cm

I-PpoII-PpoI

レシピエント枯草菌のゲノム中への組み込み

B.subtilisレシピエント I-PpoIによる切断 (CHEF)

A M

145

6.69.4

kb

234897

M

23

M B

kb145

6.69.4

4897

C

枯草菌ゲノム

挿入領域

溶菌

Top agar 法

10

枯草菌

溶菌法による細胞外核酸の活用：形質転換可能な株への応用 : DNA精製不要

溶菌

大腸菌

受容菌レシピエント

細胞外核酸

供与菌(ドナー)

ゲノム

乳酸菌

シュードモナスSynechocystis sp.

(ラン藻)高度好熱菌

枯草菌 など

大腸菌

出芽酵母

11

枯草菌終夜培養液の静置による溶菌誘導枯草菌を溶菌させるには

0.7

0.8

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.10

190 2 6 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 484

静置

2hr後

24hr後

(hr)

Abs(OD 600)

溶菌

しんとう培養 静置

168trpC2株及びその誘導株

溶菌液を直接用いた形質転換へ

19hrCulture

静置2hr

静置24hr

静置による溶菌誘導

plasmid

溶菌

B.s

ubtil

is

2) 枯草菌から出芽酵母への溶菌液を利用した形質転換

12

シャトルプラスミドを溶菌法(CELyTED)で移動：【枯草菌/静置】 ➡ 【酵母】

37˚C O/N Mixture

形質転換

Donor cell

Recipient cell

出芽酵母YPH499株など

Selection plate

B.s

ubtilis

枯草菌168trpC2株 静置

2h〜

proK処理

溶菌

TritonX-100

静置2h〜

しんとう5min

ヌクレアーゼ阻害剤(ATA)

酢酸リチウム法

LB またはSuper broth

溶菌液； 50μLキャリア；10μL出芽酵母；100μLTF溶液； 600μL

エキソヌクレアーゼ(ExoI)

pGETS302

bla

15,514 bpLEU2

CEN6 tetL

1.2%SD Leu-

agar

Top agar 法

2) 枯草菌から出芽酵母への溶菌液を利用した形質転換

13

0.2

2010754321.51

0.5

kb

0.7

M1 2C

EcoRV digestion

controlC

溶菌法

pGETS302

tetRbla

15,514 bp

LEU2

CEN6

pGETS302V1pGETS302V2

KOD FX Neo (TOYOBO)

pGETS302V1pGETS302V2プライマー

酵母ではコピー数が低いのでLong PCRによってプラスミドの構造確認を行なった

Long PCRによるプラスミド構造確認

tetL

【枯草菌/静置】 ➡ 【酵母】：条件検討

ExoI、ATA、proKの効果pGETS302 (15.5 kb)

30

61

81

24

75

49

120140

80

60

40

20

0

100

120

ExoI ー ー ー ー ＋ ＋ ＋ ＋ATA ー ー ＋ ＋ ー ー ＋ ＋

proK ー ＋ ー ＋ ー ＋ ー ＋

69

2) 枯草菌から出芽酵母への溶菌液を利用した形質転換

14

シャトルプラスミドを溶菌法で移動：【枯草菌/静置】 ➡ 【酵母】サイズの検討・添加剤

・ ExoIII 1.67U/mL

エキソヌクレアーゼ・ ExoI 1.67U/mL

・EDTA(1mM)・EGTA(1mM)

・アウリントリカルボン酸 (0.35mg/mL)

ヌクレアーゼ阻害剤

タンパク質分解酵素・プロテネースK (proK) (6.7U/mL)・ペプシン (6.7U/mL)

・パパイン (6.7U/mL)・トリプシン (0.01%)

・エラスターゼ(12.5U/mL)

・TritonX-100 (1%)・Tween 20 (15%-25%)・Tween 80 (10%)・ノニデットP-40 (1%)・CHAPS (1%)

界面活性剤

pGETS302

tetRbla

15.5 kbpLEU2

CEN6

pGETS30X(18.2)

tetRbla

33.7 kbpLEU2

CEN6

18.2 kbpラムダDNAインサート

pGETS30X(29.2)

tetRbla

44.7 kbpLEU2

CEN6

29.2 kbpラムダDNAインサート

pGETS30X(50.1)

tetRbla

65.6 kbpLEU2

CEN6

50.1 kbpラムダDNAインサート

pGETS302 (15.5kb)

pGETS30X33.7kb

pGETS30X65.6kb

pGETS30X44.7kb

120

100

80

60

0

140 137123

2440

20

131

160

15.5

kb

33.7

kb

44.7

kb

65.6

kb

2) 枯草菌から出芽酵母への溶菌液を利用した形質転換

15

・その他のDNA導入法との比較

プラスミドDNAの抽出・精製操作を含まないDNA導入法として接合伝達法が挙げられる。しかし接合伝達法は一般的にドナー細胞とレシピエント細胞の相性や培養条件が限定されている場合が多く、現時点ではまだ汎用的な操作法としては向いていない。

3) 従来法(一般的なプラスミド精製→形質転換)との比較

従来法では、形質転換に用いるDNAは生化学的な抽出・精製が必要とされてきた。抽出・精製操作において、特に50kbを越える長鎖DNAは長大なポリマーであるため物理的ダメージを受けやすく取扱いが困難であった。

16

37˚C (O/N)

形質転換5mL

LB Tc静置 2hr

Mix

ture溶菌

枯草菌⇒酵母：従来法との比較

酵母コンピテントセル

酵母形質転換体

B.s

ubtilis

pGETS302/RM125株枯草菌

50 mL以上LB Tc

37˚C (O/N)

アルカリ法；4hr以上

超遠心法；2day

集菌＆

前処理

確認アルカリ処理

カラムor

フェノクロエタ沈

生化学的精製・抽出操作

確認超遠心O/N

回収 超遠心5hr以上

エタ沈回収集菌＆

前処理酵母

形質転換体

形質転換

長鎖プラスミドは物理的ダメージを受けやすい

溶菌法

従来法

3) 従来法(一般的なプラスミド精製→形質転換)との比較

17

枯草菌⇒酵母：従来法との比較 形質転換効率

9.30 X10-17

mol

コロニー数

OD600吸光度；0.7

形質転換効率(cfu/mol)

X1015DNA

添加量

DNA添加量 コロニー

数(80 ng)

形質転換効率(cfu/mol)

X1015

pGETS30215.5kb 124 1330 91 5.321710x10-17

mol

pGETS30X33.7kb 41939 11 1.38799x10-17

mol

pGETS30X44.7kb 13 139 8 1.29618x10-17

mol

pGETS30X65.6kb 3 32.3 4 0.995402x10-17

mol

溶菌法 従来法

3) 従来法(一般的なプラスミド精製→形質転換)との比較

18

1）物質生産に必要な遺伝子群を含む長鎖遺伝子クラスターを酵母細胞に導入することで、抗体など高度な有用タンパク質の生産分泌可能な有用形質転換酵母を作製することができる。溶菌法は操作が簡便であるため、ハイスループットな運用が可能である。従って、ゲノムデザインサイクル(GDC)を活用し、物質生産に特化した形質転換酵母を作成する際は、本発明の溶菌法は重要な技術基盤ツールになると期待される。

2）大腸菌などで作成されたコンティグクローンによるDNAライブラリーを目的の宿主のゲノムに順次導入することでゲノム領域の再構築を実現する。溶菌法を用いることで長鎖DNA合成を簡便、迅速に操作することができる。

4) 活用事例

19

コロニーから枯草菌培養液

大腸菌や枯草菌で作製されたプラスミドライブラリー

遺伝子発現・抗体生産を測定、比較

遺伝子クラスター設計情報処理・

再設計

ゲノムデザインサイクルにおける溶菌法の活用大腸菌や枯草菌で合成されたプラスミドライブラリー(長鎖DNA)→酵母細胞などへ導入

酵母細胞に迅速に導入するシステム

ハイスループット化・溶菌法

溶菌液中未精製のプラスミドによる形質転換

溶菌

ゲノムデザインサイクル (GDC) による効率的な物質生産

酵母など

4) 活用実施例；プラスミドライブラリーの評価

20

複数のDNAコンティグ断片のクローニング

(16.3 kb)

Mouse Mitochondrial

genome

・遺伝子クラスターの構築・巨大ゲノム領域の再構築

1 2 3 4

溶菌法によるダイレクトクローニング

Em1

4 Cm

Cm1 2 3 4I-PpoII-PpoII-PpoI I-PpoI

枯草菌ゲノム

枯草菌ゲノム

B. subtilis Gene/Genome Manipulation (BGM) システム

の活用

大腸菌からのプラスミド抽出・精製操作は不要

3 Em

2 Cm

1

ゲノム

Em大腸菌(供与菌)プラスミドライブラリー

目的の宿主へ

溶菌法によるダイレクトクローニング

サブゲノム化

I-PpoI digestion90V 4sec 18hr 14℃

kb

2010754

4) 活用事例；長鎖DNA(ゲノム)合成

21

• 溶菌法は操作が非常に単純なため複数のサンプルを同時に扱うことに適している。現在、マルチウェルプレートを用いた運用が可能なところまで確認済み。

1.2%LB agar

形質転換溶菌

37˚C (O/N)

ドナー宿主・大腸菌・枯草菌

レシピエント宿主

オートメーション化

• 操作が単純であることから、実用化に向けて全体の流れをオートメーション化できれば、さらに扱いやすい操作法になると見込まれる。

• レシピエントとして培養細胞などにも適用できないか検討中。・各種バクテリア・真菌(酵母など)

5) 実用化に向けた課題

22

• オートメーション化については既存の機器を組み合わせることで開発できると見込まれる。培養細胞への適用については添加剤などの条件検討で克服できると見込まれる。

• また、有用宿主作成のための形質転換技術を開発中の企業、長鎖DNA(遺伝子クラスター)またはゲノム合成分野への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。

• 微生物や培養細胞を用いた有用物質生産の技術を持つ企業との共同研究を希望。

http://engineeringbiologycenter.org/

国際コンソーシアムGP-Write

5) 企業への期待

23

本技術に関する知的財産権

• 発明の名称 ：酵母形質転換細胞の製造方法出願番号 ：特願2015-78489

• 出願人 ：東京工業大学、慶應義塾大学

• 発明者 ：金子真也、板谷光泰

・関連特許；特開２００５－２５３４６２ (2005/1/28)「レシピエント細胞の形質転換方法」

大腸菌から枯草菌へのDNA導入操作法。真核微生物は対象外。本発明は培養条件、溶菌条件、および添加剤により上記関連特許の効率を大幅に改善している。

24

お問い合わせ先

東京工業大学

研究・産学連携本部

産学連携コーディネーター 松本 進

ＴＥＬ 03-5734-7693

ＦＡＸ 03-5734-7694

e-mail smatsumoto@sangaku.titech.ac.jp