Leveduras na fermentaLeveduras na fermentaçção ão alcoalcoóólicalicaProfa. Sandra Regina Profa. Sandra Regina CeccatoCeccato--AntoniniAntoniniDTAiSER / CCA / UFSCar DTAiSER / CCA / UFSCar –– Campus Campus de Ararasde Araras

antonini@cca.ufscar.brantonini@cca.ufscar.br

LaboratLaboratóório de microbiologia agrrio de microbiologia agríícola e molecularcola e molecular

www.cca.ufscar.br/lamam

As caracterAs caracteríísticas essenciais de um sticas essenciais de um processo microbiolprocesso microbiolóógico industrialgico industrial

MICRORGANISMOSMICRORGANISMOS

Vírus

Bactérias

Fungos

Algas

Protozoários

SubstratoSubstrato

Adicionados no meio de cultura

RecuperaRecuperaçção e ão e PurificaPurificaçção do ão do

ProdutoProduto

Produtos do metabolismo

Célula microbiana

Fração das células

RESIDUO RESIDUO OU OU

MATERIAL MATERIAL DE DE

EXCREEXCREÇÇÃOÃO

CaracterCaracteríísticas gerais e sticas gerais e identificaidentificaçção de levedurasão de leveduras

CaracterCaracteríísticas gerais das sticas gerais das levedurasleveduras

Grupo heterogêneoGrupo heterogêneo

UnicelularesUnicelulares

DiversidadeDiversidade

–– Cor das colôniasCor das colônias

–– TexturaTextura

ReproduReproduççãoão

Aspecto colonial de fungos que apresentam crescimentofilamentoso (F) e leveduriforme (L).

Brotamento

Ciclo haplóide

Ciclo diplóide

Ciclo de vida de S. cerevisiae e sua relação comas condições ambientais

+ ferormônio

Ciclo de vida de S. cerevisiae

Leveduras. Em A, células de levedurase de bactérias. Em B, células de Saccharomyces cerevisiae, mostrando células em brotamento. Em C, pseudomicélio de Saccharomyces cerevisiae, em meio Corn-meal agar.

A. B.

C.

A levedura Pichia stipitis, fermentadora de xilose, durante crescimento vegetativo (A), esporos em formação (B), e sob limitação de carbono (C). Foto Tom Kuster.

Leveduras apiculadas

Extrato de malte

MacroscopiaSedimentoResíduoAnelIlhotaPelículaMicroscopiaForma e tamanhodas células

MicrocultivoAgar fubáTween 80Corn meal agar

MicroscopiaPseudomicélio,Micélio verdadeiro,BalistósporosClamidósporos

MicroscopiaProdução esporos sexuais:Ascos e ascósporos

Meio de acetatoGorodkowaYMÁgua de torneira

Outras provas:-Urease-Cápsula-Meio DBB

IDENTIFICAÇÃO GENÉRICA

AuxanogramaAssimilaçãoFontes C e N

ZimogramaFermentação Alcoólica de açúcares

Meios diferenciais-meio TTC-ágar molibdênio-ágar azul Tripan-meio de Nickerson-meio de CGB

Outras provas:-Crescimento 37ºC-Produção de compostos amilóides

-tubo germinativo-resistência aCicloheximida-fenol oxidase

IDENTIFICAÇÃO ESPECÍFICA

Teste do DBB. As linhagens CCA 181, 506 e 567 são DBB negativas, enquanto a CCA379 é DBB positiva (utilizada como

controle positivo) – Linhagens basidiomicéticas são DBB+

ESPOROSSEXUAIS

S. cerevisiae

S. cerevisiae

Produçãode pseudomicélio

Candida albicans - pseudomicélio

Teste de produção de ácido a partir da glicose em meio carbonato de cálcio, por 7-10 dias, a 30º C.

Para caracterização de linhagens de Dekkera

FERMENTAÇÃO DA GLICOSE

+- +--

Carbono Nitrogênio

Lin

hage

m

Erit

ritol

Sac

aros

e

Raf

inos

e

Gal

acto

se

Xilo

se

Mel

ezito

se

Ara

bino

se

Cel

obio

se

Man

itol

Mel

ibio

se

Glic

ose

Eta

nol

Mal

tose

Ac.

Lac

tico

Ac.

Citr

ico

Ram

nose

Ac.

Suc

cíni

co

Inos

itol

Lis

ina

Etil

amin

a

Nitr

ato

005 - + + + + + + - - - + - + - - - - + - + - 006 - + + + + + + + + + + + + - + + + - + + - 007 - + - + + + + - - - + - + - - - - - - + - 008 - + + - - + + - - + + - + - - - - + - - - 012 - + + + + + + - - - + - + - - - + + + + - 022 - + - + - + - - + - + - - - - - - - - nd - 023 - + + + + + + - - + + - + - - - - + - - - 027 - + - + - + + - - - + - + - - - - - - nd - 035 - + - + + - + - + - + - + - - - - - - nd - 037 - + + - + + - - - + + - + - - - - + - - - 053 - + + + + + + + - - + - + - - + + + + + +059 - + - - + + + + - - + - + - - - + + + + +077 - + + + - + - + + - + + + - - - + + + + +083 - + + + + + + - - - + - + - - - - + - - - 115 - + - + + + + - + - + + + - + - - + + + - 151 - + - - - - + - - - + - - - - - - - + - - 155 - + - + + + + + - - + + + - - + + + + + +181 - + - + + + + + + - + + + - + - + + + + - 209 - + + + + + - - - + + - - - - - + - - - 373 - + - + + + + - + - + + + - - - + + - + - 385 - - - - - - + - - - + - + - - - - - - - - 397 - + - + - + + - - - + - - - - - + + - - - 447 - + - + + + + - + - + + + - + - + + + + - 467 - + - + + + + - + - + + + - + - + - + + +471 - + - + + + + - + - + + + - + - + - + + - 506 - + - + + + + + + + + + + - + - + + + + - 540 - + - + nd + + - + - + + + - + - + + + + - 567 - + - + + + + - + - + + + - + - + + + + - 593 - + + + + + + - + - + + + - + - + + + + - 610 - + - - + + + + + - + + + - + - - + + + - 612 - + - + + + + + + - + + + - + - + + + + -

1 - (+) = positivo; (-) = negativo e (nd) = não determinado;

Chaves de identificaChaves de identificaççãoãoKregerKreger--vanvan RijRij, N.J.W. , N.J.W. TheThe yeastsyeasts. A . A taxonomictaxonomic studystudy. . ElsevierElsevier, 1984., 1984.

BarnettBarnett, J.A., Payne, R.W., , J.A., Payne, R.W., YarrowYarrow, D. , D. YeastsYeasts: : characteristicscharacteristics andand identificationidentification. . Cambridge Univ. Cambridge Univ. PressPress, 1990., 1990.

Importância do estudo da Importância do estudo da diversidade de leveduras diversidade de leveduras na fermentana fermentaçção alcoão alcoóólicalica

http://www.apta.sp.gov.br/cana/anexos/Workshop_Etanol_sessao%202_Luiz%20Basso.pdf

http://www.apta.sp.gov.br/cana/anexos/Workshop_Etanol_sessao%202_Luiz%20Basso.pdf

http://www.apta.sp.gov.br/cana/anexos/Workshop_Etanol_sessao%202_Luiz%20Basso.pdf

http://www.apta.sp.gov.br/cana/anexos/Workshop_Etanol_sessao%202_Luiz%20Basso.pdf

TTéécnicas avancnicas avanççadas no adas no estudo da diversidade de estudo da diversidade de leveduras em processos leveduras em processos fermentativosfermentativos

IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAScomo era feita há 20 anoscomo era feita há 20 anos

Morfologia das células e colônias;Características bioquímicas e fisiológicas;Classificação de espécies mas não de linhagens.

IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAScomo é feita hojecomo é feita hoje

Cariotipagem: análise do DNA cromossômico das leveduras.

Técnicas baseadas em PCR (RAPD) e RFLP.

Cada linhagem possui um padrão único de cromossomos ou bandas de DNA (como um código de barras).

2007 – Anais do XVI Sinaferm

Todos os isolados pertencem à espécie Saccharomyces cerevisiae e apresentaram o mesmo cariótipo. No entanto, um dos três tipos morfológicos isolados, em cada coleta, apresentou desempenho industrial diferente dos demais. Os dados obtidos indicam que a determinação do desempenho fermentativo, pelas técnicas utilizadas, além de avaliar a performance industrial de cepas de levedura, pode proporcionar a diferenciação final entre cepas S. cerevisiae de mesmo cariótipo.

ANDRIETTA, M. G. S. ; ANDRIETTA, Silvio Roberto ; STROPPA, C. T. . Caracterização das leveduras floculantes selecionadas em reator tipo torre em uma unidade de fermentação alcoólica. In: SINAFERM, 2003, Florianópolis. XIV SINAFERM, 2003.

Região ITS

RAPD

Tabela 1 – Pontuação e limites das faixas de variação dos parâmetros utilizados na classificação daleveduras (Andrietta et al., 1999).

Dígito Parâmetro 1 (Alto) 2 (Médio) 3 (Baixo) Primeiro Yx/s (gMS/gSubst) > 0,044 0,041 a 0,044 < 0,041Segundo VCS (gSubst/Lxh) > 5,7 5,2 a 5,7 < 5,2 Terceiro NCO (%) > 98,5 90 a 98,5 < 90 Quarto μmax (1/h) > 0,55 0,45 a 0,55 < 0,45 Quinto PROD (gEt/Lxh) > 2,4 2,2 a 2,4 < 2,2 Sexto Yp/s (gEt/gSubst) > 0,45 0,45 a 0,42 < 0,42

Metodologia da Capacidade Fermentativa (Andrietta et al., 1999)

Andrietta, S. R.; Migliari, P. C. e Andrietta, M. G. S. (1999), Classificação das cepas de leveduras de processos industriais de fermentação alcoólica utilizando capacidade fermentativa. STAB – Açúcar, Álcool e Subprodutos, v.17, n.5, p.54-59.

Tabela 2 - Valores de participação populacional, PP (%); rendimento em células, Yx/s (gMS/gSubst); velocidade de consumo de substrato, VCS (gSubst/Lxh); nível de conversão de substrato, NCO (%); velocidade específica máxima de crescimento, μmax (1/h); produtividade, PROD (gEt/Lxh); rendimento em etanol, Yp/s (gEt/gSubst); grupo de desempenho, para as leveduras isoladas.

Coleta (dias/safra) Isolado PP Yx/s VCS NCO μm PROD Yp/s Grupo

IN 74 100,0 0,0412 5,81 99,65 0,50 2,60 0,4774 211.21178 0,0412 5,81 99,62 0,51 2,49 0,4579 211.21179 0,0412 5,80 99,50 0,47 2,51 0,4618 211.21180

77,3 0,0440 5,80 99,50 0,49 2,54 0,4672 211.211

81 0,0410 5,80 99,50 0,48 2,47 0,4540 211.21182 0,0424 5,80 99,50 0,49 2,53 0,4650 211.21183

12,5 0,0432 5,80 99,50 0,46 2,57 0,4715 211.211

84 0,0422 4,45 76,36 0,46 2,00 0,4878 233.23185 0,0443 3,92 67,27 0,45 1,86 0,5199 233.231

60

86* 10,2

0,0434 5,80 99,49 0,46 2,55 0,4688 211.21196 0,0423 5,80 99,50 0,51 2,46 0,4528 211.21197 0,0419 5,80 99,50 0,48 2,48 0,4555 211.21198

55,2 0,0436 5,80 99,50 0,48 2,45 0,4511 211.211

99 0,0430 4,78 81,94 0,53 2,02 0,4574 233.231100 0,0433 4,79 82,21 0,55 2,00 0,4513 233.231101

29,3 0,0433 5,80 99,44 0,47 2,44 0,4502 211.211

102 0,0419 5,80 99,50 0,50 2,45 0,4517 211.211103 0,0435 5,80 99,50 0,49 2,46 0,4539 211.211

120

104 15,5

0,0434 5,80 99,50 0,50 2,46 0,4527 211.211114 0,0440 3,37 57,85 0,48 1,59 0,5207 233.231115 0,0440 3,77 64,63 0,50 1,58 0,4598 233.231116

43,3 0,0417 5,79 99,41 0,47 2,52 0,4645 211.211

117 0,0420 5,80 99,50 0,47 2,46 0,4521 211.211118 0,0411 5,80 99,51 0,48 2,56 0,4702 211.211119

31,7 0,0416 5,80 99,51 0,46 2,53 0,4657 211.211

120 0,0410 5,80 99,50 0,47 2,52 0,4633 211.211121 0,0420 5,80 99,51 0,46 2,49 0,4577 211.211

180

122 25,0

0,0415 5,80 99,50 0,45 2,50 0,4600 211.211* Variante morfológico.

AN

DR

IETTA, M

. G. S. ; A

ND

RIETTA

, Silvio Roberto ; STR

OPPA

, C. T..C

aracterização das leveduras floculantes

selecionadas em reator tipo torre em

uma unidade de ferm

entação alcoólica. In: SINA

FERM

, 2003, Florianópolis. XIV SIN

AFER

M, 2003.

UtilizaUtilizaçção de meios ão de meios seletivosseletivos

3 X 109 células de S. cerevisiae / ml3 X 103 células de leveduras selvagens / ml

1 ml sem diluição

1 ml diluição 10-8

1 ml diluição 10-2

Meio contagem geralNão seletivo>>> 300 colônias

Meio contagem geralNão seletivo30 colônias{3 X 109 / 108 } = 30{3 X 103 / 108 } = < 1

Meio seletivo{3 X 103 / 102 } = 30Exemplo: actidioneinibe o crescimentode S. cerevisiae

Dorna de fermentação

Regra: contarentre 30 e 300 colônias

MEIO DE CULTURA WLN – Wallerstein Laboratory Nutrient Medium

Diluição10-10

Sem diluição

Sem diluição

Para Saccharomyces não-cerevisiae

Para não-Saccharomyces

Para Saccharomyces não-cerevisiaeContagem geral

Sem diluição

Tosta, Tosta, C.D.C.D., , CeccatoCeccato--AntoniniAntonini, S.R. Eficiência de meios seletivos , S.R. Eficiência de meios seletivos no monitoramento de leveduras na fermentano monitoramento de leveduras na fermentaçção alcoão alcoóólica lica atestada por PCR. In: XV Simpatestada por PCR. In: XV Simpóósio Nacional de sio Nacional de BioprocessosBioprocessos, , 2005, Recife2005, Recife--PE (Anais).PE (Anais).

Analisou a eficiência de três meios seletivos (Analisou a eficiência de três meios seletivos (AgarAgar--lisinalisina, , LWYM e WLD) no isolamento de leveduras selvagens LWYM e WLD) no isolamento de leveduras selvagens atravatravéés dos testes de taxonomia cls dos testes de taxonomia cláássica e de PCR.ssica e de PCR.Linhagens isoladas do vinho e fermento a partir dos Linhagens isoladas do vinho e fermento a partir dos meios seletivos pertenceram exclusivamente a gêneros meios seletivos pertenceram exclusivamente a gêneros não não SaccharomycesSaccharomyces, com bandas de DNA da região ITS , com bandas de DNA da região ITS entre 420 e 550 entre 420 e 550 bpbp..Linhagens de Linhagens de SaccharomycesSaccharomyces cerevisiaecerevisiae, isoladas , isoladas exclusivamente de WLN, apresentaram ITS acima de exclusivamente de WLN, apresentaram ITS acima de 800 800 bpbp, caracter, caracteríístico desta e da demais espstico desta e da demais espéécies do cies do grupo grupo SaccharomycesSaccharomyces sensusensu strictostricto..Os meios seletivos testados permitiram a distinOs meios seletivos testados permitiram a distinçção entre ão entre linhagens selvagens e do processo.linhagens selvagens e do processo.

S. cerevisiae

Colônias rugosas

= S. cerevisiaeColôniasmucosas

Oliveira, M.C.F.L., Silva, R.B.O. BiotipoSaccharomyces cerevisiae em cadeias multicelulares ramificadas na fermentação contínua. In: XVII Congresso Brasileiro de Microbiologia, 1993, Santos-SP.

Identificaram uma levedura selvagem com as mesmas características, apresentando elevado poder competitivo em relação à levedura usual do processo e às demais leveduras selvagens, substituindo em cerca de 50% o fermento de partida.

Ceccato-Antonini, S.R., Parazzi, C. Isolamento de levedura selvagem floculante e efeitos da contaminação em processo de fermentação etanólica contínua. In: VI Congresso Nacional da STAB, 1996, Maceió-AL.

Verificaram uma proporção de 1:1 entre leveduras rugosas e não-rugosas no fermento e no vinho, ocasionando uma queda de 10% no rendimento fermentativo e 18% na produção de álcool. Para a retomada do rendimento a valores ~ 89,5%, o fermento teve que ser substituído. Os focos de contaminação eram a água de diluição e o melaço.

A pesquisadora Silene C. L. Paulillo (Fermentec) apresentou os resultados de um trabalho realizado durante 3 safras consecutivas (2002, 2003 e 2004)

sobre as características de 300 leveduras selvagens que contaminaram 46 destilarias. As leveduras identificadas

pela cariotipagem formavam colônias de borda lisa (57%) ou rugosa (43%). Todas as leveduras de colônias

com borda rugosa apresentaram problemas na fermentação como: espuma em excesso, floculação e/ou

sobra de açúcar no vinho. Entre as leveduras de colônias de borda lisa, 65% apresentaram pelo menos

um dos problemas citados.As leveduras com estas características foram submetidas a mais dois ciclos

fermentativos com mosto contaminado por lactobacilos (~1 x 107 bactérias/mL).

Nestas condições, as leveduras contaminantes flocularam intensamente (como indicado pelas setas amarelas), enquanto que, a linhagem PE-2 (referência), não foi afetada. Estes resultados mostraram a importância do uso de leveduras selecionadas e quanto se pode perder com leveduras contaminantes.

Alguns resultados de Alguns resultados de monitoramento utilizando monitoramento utilizando meios seletivosmeios seletivos

Fermento da cuba

1,00E+001,00E+021,00E+041,00E+061,00E+081,00E+101,00E+121,00E+14

22-jun

29-jun

6-jul

13-jul

20-jul

27-jul

3-ago

10-ago

17-ago

24-ago

31-ago

7-set

14-set

21-set

Data da coleta

UFC

ou

célu

las

viáv

eis/

mL

Não Sacch Não Sacch. cerev.Leveduras totais Células viáveisBactérias totais

Safra 2005/2006

Vinho dorna 1

1,00E+001,00E+021,00E+041,00E+061,00E+081,00E+101,00E+121,00E+14

22-jun

29-jun

6-jul

13-jul

20-jul

27-jul

3-ago

10-ago

17-ago

24-ago

31-ago

7-set

14-set

21-set

Data da coleta

UFC

ou

célu

las

viáv

eis/

mL

Não Sacch Não Sacch. cerev.Leveduras totais Células viáveisBactérias totais

Safra 2005/2006

Mosto

1,00E+00

1,00E+01

1,00E+02

1,00E+03

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

22-jun

29-jun

6-jul

13-jul

20-jul

27-jul

3-ago

10-ago

17-ago

24-ago

31-ago

7-set

14-set

21-set

Data da coleta

UFC

/mL

Não Sacch Não Sacch. cerev.Leveduras totais Bactérias totais

Safra 2005/2006

OBRIGADA !OBRIGADA !