71. 細胞遊走，細胞分裂時の極性形成における細胞骨格の時空間的制御機構

水野　健作

Key words：細胞極性，細胞運動，アクチン細胞骨格，　コフィリン，シグナル伝達

東北大学 大学院生命科学研究科分子生命科学専攻情報伝達分子解析分野

緒　言

アクチン細胞骨格の再構築は，細胞の運動，分裂，極性形成に必須の役割を担っており，器官形成，神経系構築，免疫応答，癌細胞転移など多くの生理的･病理的現象においても重要な役割を果たしている．私達は，アクチン骨格の再構築を制御する主要因子であるコフィリン（アクチン脱重合因子）を特異的にリン酸化（不活性化）する LIM キナーゼ (LIMK) と，脱リン酸化（活性化）するホスファターゼである Slingshot (SSH) を同定し，コフィリンのリン酸化･脱リン酸化を介したアクチン骨格の制御機構とそのシグナル伝達経路を明らかにしてきた 1,2)．さらに，LIMK1 と SSH1 の発現抑制によって，細胞遊走や分裂時の極性形成に異常が生ずることを見出した 3,4)．しかし，細胞遊走や細胞分裂時の LIMK1 と SSH1 の時空間的な活性制御機構や極性形成における機能発現の分子機構は不明である．本研究では，主に細胞遊走時の前後軸の極性形成における SSH1の活性化を制御するシグナル伝達機構を解明し，コフィリンを介したアクチン骨格の時空間的な制御が細胞遊走時の極性形成において果たす役割を解明することを目的として研究を行い，以下の結果を得た．私達は以前，ケモカインによる Jurkat T細胞の遊走において，SSH1 は細胞刺激依存的にラメリポディアに局在し，細胞遊走における極性化に関与していることを明らかにした 3)．さらに，14-3-3 蛋白質は SSH1 のリン酸化依存的に SSH1 と結合し，SSH1 のアクチン繊維への結合とアクチン繊維による活性化を抑制していることを見出した 5)．本研究では，SSH1 の 14-3-3 蛋白質への結合に関わるリン酸化の責任キナーゼとしてMARK3 (MAP/microtubule affinity-regulating kinase 3) を同定し，MARK3 およびその上流キナーゼである LKB1 (Serine/threonine protein kinase 11) が刺激依存的な SSH1 のラメリポディアへの局在と細胞極性化に関与することを解明した．また，私達は，細胞極性形成過程におけるアクチン動態の時空間的変化を測定することを目的として，生細胞内におけるアクチン単量体の濃度変化を時間的空間的に高解像度で測定する新しい顕微鏡イメージング技術（s-FDAP法及びmultipoint FDAP法）を開発した 6,7)．

方法および結果

１．細胞極性化因子による SSH1 の活性制御機構の解明私達は以前，SSH1 は Ser-937 と Ser-978 のリン酸化依存的に 14-3-3 蛋白質と結合し，それによって SSH1 のアクチン繊維への結合とアクチン繊維による著しい活性化が阻害されることを報告した 5)．しかし，これらの位置をリン酸化するキナーゼは不明であった．私達は，Ser-978 のリン酸化部位特異的抗体を用いた大腸菌発現スクリーニングによって，MARK3 を Ser-978キナーゼとして同定した．MARK3 及びその上流キナーゼである LKB1 の発現によって，SSH1 の Ser-978 のリン酸化レベルが上昇するとともに，SSH1 と 14-3-3 蛋白質との結合も上昇することを見出した．刺激依存的な細胞極性形成過程におけるSSH1 の機能を解明するため，ケモカイン SDF-1 (Stromal cell-derived factor 1) による Jurkat T 細胞のラメリポディア形成の過程をYFP-アクチンを用いて蛍光顕微鏡によりタイムラプス観察した．その結果，Jurkat 細胞は刺激前はほぼ球形で仮足はほとんどみられないが，SDF-1 刺激後 1 分でまず多方向に複数のラメリポディアが形成され，その後 5-10 分までに一方向へのラメリポディアをもつ極性化した細胞へと変化することが分かった（図１）．Ser-937 と Ser-978 をアラニンに置換した非リン酸化型 SSH1(2SA)を発現すると，SDF-1 刺激による一方向へのラメリポディア形成が抑制され，多方向に複数のラメリポディアをもつ細胞が形成された．この時，野生型 SSH1 は極性をもったラメリポディア内部に局在するのに対して，SSH1(2SA) はラメリポディア基部にのみ局在し，ラメリポディア内部への局在が阻害された．さらに，SSH1, MARK3, LKB1 のいずれかの発

　上原記念生命科学財団研究報告集, 25 (2011)

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現を shRNA により抑制すると，一方向へのラメリポディア形成が阻害され，多方向へ複数のラメリポディアを出す極性のない細胞が生じた．以上の結果から，LKB1-MARK3 経路による SSH1 の Ser-937 及び Ser-978 のリン酸化とそれに依存した14-3-3 蛋白質の結合は，SSH1 のアクチン繊維からの解離を促進し，SSH1 のラメリポディア内への移行を促進するのではないかと考えられる．その後 14-3-3 蛋白質から解離し，脱リン酸化された SSH1 によって，コフィリンが脱リン酸化･活性化され，ラメリポディアの退縮と一方向への収束が生じるのではないかと考えられる（図１）．本研究によって，LKB1-MARK3 によるSSH1 の活性と局在の制御機構が明らかになるとともに，この経路が SDF-1 による Jurkat 細胞の一方向へのラメリポディア形成に重要な役割を担っていることが明らかになった．　

　図 1． 刺激依存的な細胞遊走時の極性形成過程における Slingshot の活性と局在の制御機構.

（上図）Jurkat 細胞を SDF-1 で刺激したときの細胞の形態変化と Slingshot の局在．刺激前はほぼ球形で仮足はみられないが，刺激後 1分でまず多方向に複数のラメリポディアが形成され，その後 5-10 分までに一方向へのラメリポディアをもつ極性化した細胞へと変化する．Slingshot-1 (SSH1) はラメリポディアに局在する．（下図）SSH1 の局在と活性制御のモデル．SSH1 はリン酸化依存的に 14-4-3 蛋白質と結合するとアクチン繊維から解離する．SSH1 は刺激後一時的に LKB1-MARK3 経路によってリン酸化されアクチン繊維から解離しラメリポディア内部に移行する．その後，脱リン酸化され，ラメリポディア内でアクチン繊維と再結合して活性化されコフィリンを脱リン酸化する．

　　２．生細胞内のアクチン単量体濃度の時空間的変化の測定細胞外からの刺激によって誘導される細胞遊走において，移動方向の先導端にラメリポディアが形成されることが必要である．細胞遊走時のラメリポディア形成においては，先導端へのアクチン重合が仮足の形成と伸長の駆動力として働いており，アクチン重合の動的な制御が仮足形成･伸長の中心的役割を担っている．アクチン重合はアクチン繊維の重合端（プラス端）の濃度とアクチン単量体（G-アクチン）の濃度によって決定されることから，細胞内のG-アクチン濃度はラメリポディア形成･伸長において重要な役割を担っていると考えられる．しかし，細胞内の G-アクチン濃度は臨界濃度よりもはるかに高濃度に存在することから，刺激依存的なアクチン重合やラメリポディア形成過程における G-アクチン濃度の変動はあまり考慮されてこなかった．そのため，細胞内 G-アクチン濃度と刺激依存的なアクチン重合やラメリポディア伸長との間の関係は未だ不明である．そこで，私達は生細胞内の G-アクチンの濃度変化を高い時間空間分解能で測定する新しい顕微鏡イメージング手法，SequentialFluorescence Decay After Photoactivation (s-FDAP) 法を開発した（図２)7)．s-FDAP 法は，発光と消光を繰返すことができる蛍光蛋白質 Dronpa を融合したアクチンを用いて，G-アクチンの拡散による蛍光の減衰量（FDAP 量）を連続的に計測し，生細胞内の局所の G-アクチンの濃度変化を高い時間分解能で測定できる方法である．また，本法では微分干渉像を同時に取得することによって細胞の形態変化を同一細胞で測定することが可能である．

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　図 2． s-FDAP法による G-アクチン濃度変化の測定.

発光と消光を繰返すことができる蛍光蛋白質 Dronpa を融合したアクチンを細胞に発現させる．細胞内の全てのDronpa-アクチンを消光させた後，細胞内の局所の Dronpa-アクチンを発光させる．G-アクチンの拡散による蛍光の減衰量（FDAP 量）を計測する．この操作を繰り返すことによって，生細胞内の局所の G-アクチンの濃度変化を高い時間分解能で測定できる．

　この測定系を用いて，ヒト乳癌由来 MCF-7 細胞にニューレグリン刺激を与えた時の細胞内の G-アクチン濃度のタイムラプス測定を行い，G-アクチン濃度がニューレグリン刺激後 2-4 分以内に約 40%減少することを明らかにした（図３）．また，ラメリポディア形成に伴う細胞面積の増加を同時に計測した結果，細胞面積の増加は刺激後 6-8 分後に約 1.6 倍上昇することを見出した．また，G-アクチンが臨界濃度よりはるかに高い濃度範囲であっても，刺激前の細胞内 G-アクチン濃度は刺激後のアクチンの重合度及び仮足のサイズと高い相関をもつことを明らかにし，G-アクチン濃度はこれらを決定する重要なパラメーターであることを証明した 7)．さらに，s-FDAP 法を用いて，アクチン脱重合阻害剤 Jasplakinolide の処理による細胞内 G-actin量の減少を高い時間分解能で定量的に計測し，モデル解析によって，細胞内 G-アクチン及び G-アクチンとチモシン，G-アクチンとプロフィリンの複合体の濃度や結合･解離速度定数，および F-アクチンのプラス端，マイナス端の濃度を推定した 7)．さらに，同一細胞の多点で G-アクチン濃度を測定する multipoint FDAP 法を新たに開発し，生細胞内におけるラメリポディアの内部，基部，細胞質における G-アクチン濃度の空間分布の測定にも成功した．その結果，ラメリポディア内部における G-アクチン濃度は細胞質における G-アクチン濃度と同程度であることが明らかになった 7)．

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　図 3． s-FDAP法による刺激依存的な細胞内G-アクチン濃度変化の測定.

MCF-7 細胞をニューレグリンで刺激した時の細胞内のG-アクチン濃度（FDAP量）の時間変化を s-FDAP法で解析した. ニューレグリンを加えてから 2-4 分以内に細胞内 G-アクチン濃度（FDAP量）が約 40%減少し，その後はその濃度を維持することが観察された.

　

考　察

アクチン細胞骨格の時空間的な制御機構や細胞遊走における極性形成機構の解明は，細胞生物学における基本的で重要な課題の一つであり，細胞運動の分子機構の理解に重要であるばかりではなく，発生や再生過程における高次の組織構築機構や癌細胞の浸潤･転移や免疫応答，神経回路形成など多くの生理的，病理的現象を理解し，これらの疾患に対する薬剤を開発するためにも必須の研究である 8-10)．本研究では，細胞極性形成に関与することが示唆されている LKB1-MARK3 経路によって SSH1 がリン酸化され，その活性と局在が制御されていることを明らかにした．また，これらの経路が刺激依存的な一方向へのラメリポディア形成と細胞遊走に関与することを解明した．本研究ではまた，細胞内の単量体アクチン濃度の時間的空間的な変化を高解像度で測定する顕微鏡イメージング技術として s-FDAP法とmultipoint FDAP法を開発したが，これらの技術は細胞遊走や分裂時の極性形成を担うアクチン動態の時空間的変化を制御する基本メカニズムの解明に広く応用されることが期待できる．また，s-FDAP法は，G-アクチンのように細胞内で拡散性の蛋白質の濃度変化を高分解能で測定できる新手法であり，他の細胞骨格蛋白質や膜結合蛋白質等にも広く応用できると考えられる．　

共同研究者

本研究の共同研究者は，東北大学大学院生命科学研究科の三嶋利明，木内　泰，永井友朗および大橋一正である．本研究をご支援いただきました上原記念生命科学財団に深く感謝申し上げます．

文　献

1） Yang, N., Higuchi, O., Ohashi, K., Nagata, K., Wada, A., Kangawa, K., Nishida, E. & Mizuno, K. :Cofilin phosphorylation by LIM-kinase 1 and its role in Rac-mediated actin reorganization. Nature,393 : 809-812, 1998.

2） Niwa, R., Nagata-Ohashi, K., Takeichi, M., Mizuno, K. & Uemura, T. : Control of actin reorganizationby Slingshot, a family of phosphatases that dephosphorylate ADF/cofilin. Cell, 108 : 233-246, 2002.

3） Nishita, M., Tomizawa, C., Yamamoto, M., Horita, Y., Ohashi, K. & Mizuno K. : Spatial and temporalregulation of cofilin activity by LIM-kinase and Slingshot is critical for directional cell migration. J.Cell Biol., 171 : 349-359, 2005.

4） Kaji, N., Muramoto, A. & Mizuno, K. : LIM-kinase-mediated cofilin phosphorylation during mitosisis required for precise spindle positioning. J. Biol. Chem., 283 : 4983-4992, 2008.

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5） Nagata-Ohashi, K., Ohta, Y., Goto, K., Chiba, S., Mori, R., Nishita, M., Ohashi, K., Kousaka, K.,Iwamatsu, A., Niwa, R., Uemura, T. & Mizuno, K. : A pathway of neuregulin-induced activation ofcofilin-phosphatase Slingshot and cofilin in lamellipodia. J. Cell Biol., 165 : 465-471, 2004.

6） Kiuchi, T., Ohashi, K., Kurita, S. & Mizuno, K. : Cofilin promotes stimulus-induced lamellipodiumformation by generating an abundant supply of actin monomers. J. Cell Biol., 177 : 465-476, 2007.

7） Kiuchi, T., Nagai, T., Ohashi, K. & Mizuno, K. : Measurements of spatiotemporal changes in G-actinconcentration reveal its effect on stimulus-induced actin assembly and lamellipodium extension. J.Cell Biol., 193 : 365-380, 2011.

8） Horita, Y., Ohashi, K., Mukai, M., Inoue, M. & Mizuno, K. : Suppression of the invasive capacity ofrat ascites hepatoma cells by knockdown of Slingshot or LIM-kinase. J. Biol. Chem., 283 : 6013-6021,2008.

9） Mishima, T., Naotsuka, M., Horita, Y., Sato, M., Ohashi, K. & Mizuno, K. : LIM-kinase is critical forthe mesenchymal-to-amoeboid cell morphological transition in 3D matrices. Biochem. Biophys. Res.Commun., 392 : 577-581, 2010.

10） Takemura, M., Mishima, T., Wang, Y., Kasahara, J., Fukunaga, K., Ohashi, K. & Mizuno, K. : Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase IV-mediated LIM-kinase activation is critical for calciumsignal-induced neurite outgrowth. J. Biol. Chem., 284 : 28554-28562, 2009.

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