1

• Najdjelotvorniji postupak separacije (razdvajanja) sličnih spojeva

• Tswett – ruski botaničar, 1903. prvi je proveo odjeljivanjebiljnih pigmenata na CaCO3; chroma (grč.) = boja

• Tiselius – začetnik kolonske kromatografije 1952.

• Stahl – začetnik tankoslojne kromatografije (TLC) 1950.

8.1. Uvod

• Martin i James – začetnici plinske kromatografije (GC) 1952. (Nobelovanagrada)

• 12 Nobelovih nagrada za radove s kromatografijom (1937-1972.)

• KROMATOGRAFIJA – odijeljivanje sastojaka homogene smjesesorpcijskim procesima između stacionarne (nepokretne) faze (SF) i mobilne (pokretne) faze (MF)

8. KROMATOGRAFSKI POSTUPCI

2

• Adsorpcija – stvaranje međusloja tvari na dodirnoj površini MF ičvrste SF

• Apsorpcija – prijenos tvari iz MF u tekuću SF (razdjeljivanje, particija)

8.2. Podjela kromatografskih procesa

(i) Prema načinu dodira SF i MF

Kolonska kromatografija – gravitacija i(li) (pod)tlak

Planarna kromatografija – gravitacija ili kapilarni efekt

• Sorpcija = adsorpcija + apsorpcija (razdjeljivanje)

3

KROMATOGRAFIJA

ADSORPCIJSKA

SF-čvrsta

RAZDJELNA

SF-tekuća

MF – tekuća MF – plin MF – tekuća MF – plin

•"klasična"adsorpcijska kromatografija

• TLC (tankoslojnakromatografija)

• s izmjenjivačimaiona

• HPLC (visoko djelotvornatekućinska kromatografija)

• plinska (GC) •"klasična"razdjelna kromatografija(LC)

• papirna (PC)

• HPLC

• plinska (GC)

• kapilarnakromatografija

(ii) Prema tipu SF/MF i načinu uspostavljanja ravnoteže

4

8.3. Adsorpcijska kromatografija

• Kolonska kromatografija

SF (Al2O3), MF (heksan, etil-acetat,...)

5

• Elucija ("ispiranje") – razdvajanje smjese djelovanjem MF• Brzina elucije (tR) – ovisi o adsorpciji na SF

• Adsorpcijske sile: Van der Waalsove i vodikove veze (Al2O3) ili elektrostatske veze (izmjenjivači iona)

• TLC (Thin Layer Chromatography) – poseban slučaj

8.4. Razdjelna (particijska) kromatografija

• Tehnička izvedba – slično adsorpcijskoj kromatografiji (prethodnaslika); kolonska ili TLC (tankoslojna) kromatografija

• SF tekućina (često H2O) vezana na inertni nosač (npr. Kieselguhr = dijatomejska zemlja)

• Brzina elucije – ovisi o topljivosti u SF, a separacija o konstantirazdjeljenja KC:

KC = cScM

cS – koncentracija tvari u SFcM – koncentracija tvari u MF

6

• PC (papirna kromatografija) – poseban slučaj

• Separacija kod obje vrste kromatografije ovisi o raspodjeli izmeđuSF/MF (svojstvenoj za svaku tvar)

8.5. Teorija elucijske kromatografije

• Kromatografski proces – uspostavljanje i narušavanje dinamičkeravnoteže pri prelasku tvari iz SF u MF i obratno

Dinamička ravnoteža spoja Aizmeđu stacionarne i mobilne faze u kromatografskom procesu

7

• Najvjerojatnije ponašanje molekula razdvajanog spoja

8.5.1. Kinetička teorija

• Molekule prelaze in MF SF kad dobiju potrebnu aktivacijsku energiju

• Zadržavanje molekule u SF/MF

8

8.5.2. Model teorijskih tavana

• Temelji se na teoriji protustrujne Craigove distribucije (frakcijskadestilacija).

Tavani u koloni za frakcijskudestilaciju

9

• Pojedinačna uravnoteživanja (odjeljivanja) zbivaju se na odsječcimakolone, teorijskim tavanima (HETP).

• Nakon n odjeljivanja, molekule se rasporede prema Gaussovoj krivulji.

10

• Djelotvornost kolone raste s brojem tavana (N) a obrnuto je proporcionalna njihovoj visini (H).

L = H x N

11

• U elucijskoj kromatografiji veća djelotvornost kolone znači užekromatografske vrpce (bolje odjeljivanje), mada je neizbježno njihovoširenje.

• Širina vrpce (w) upravo je proporcionalna s tR a obrnutoproporcionlna s brzinom MF (u).

12

• Vrpca je Gaussova krivulja, a standardno odstupanje τ računa se iznjezine širine (w = 4τ).

• Optimalna w, u (brzina MF) i razdvajanje (α) postiže se kontrolom nekoliko parametara (vidi 8.6.)

-2τ +2τ

tR = ukupno vrijeme zadržavanja (retencijskovrijeme)

tM = vrijeme prolaska MFτ = standardna varijancija

13

• Faktor zadržavanja – opisuje brzinu putovanja analita kroz kolonu

k = (tR – tM)/tM

k > 20 elucija traje predugo (nepovoljno)k = 1-5 optimalno

14

• Separacijski faktor (faktor razdvajanja) – mjera za separacijuanalita A i B; pretpostavlja se da B putuje brže

α = kB/kA

• Eksperimentalni podaci w (=4τ) i tR

su važni za izračunavanje H i N(kojima se izražava djelotvornost kolone)

H = L w2

16tR2 N = 16

tRw

2

• Kromatografija je mnogo djelotvornija od frakcijske destilacije jer se male razlike u sorpcijskom ponašanju ovdje multipliciraju

• 1 destilacijski tavan ≈ 10-30 kromatografskih tavana

• Prednost kromatografije – kraće trajanje separacije (1 min – 1 sat)(frakcijska destilacija može trajati danima)

α > 1

15

• H i N su važni komercijalni podaci; usporedba je smislena ako se radi oistom spoju; npr. U GC-kolonama 30.000 – 500.000 teorijskih tavana

8.6. Realni kromatografski proces

• Na disperziju skupa sličnih molekula (širina vrpce) utječe niz faktora.Što je disperzija skupova (w) manja a njihova udaljenost (∆z) većapostupak je uspješniji

8.6.1. Faktori koji utječu na širenje (disperziju) vrpce

(i) Brzina mobilne faze (u)

• veća u – smanjuje longitudinalnu difuziju (B) ali onemogućujeuravnoteživanje analita između MF i SF (CM, CS)

• manja u – povećava B i omogućuje uravnoteživanje

• optimalna u – najmanja B, povoljno uravnoteživanje najmanja

H i najuža w

16

H = B/u + CS u + CM u

zbroj donjih krivulja

optimalna brzina

H = visina teorijskog tavanaB = longitudinalna difuzijau = linearna brzina MFCS = koeficijent prijenosa mase

u SFCM = koeficijent prijenosa mase

u MF

Van Deemterova jednadžba

17

(ii) Temperatura sustava

• idealni proces – smanjenje disperzije odnosno povećanje brzineprijelaza SF MF

• realni proces – povećanje difuzije; potrebno naći optimum

(iii) Količina analita

• idealni slučaj – beskonačno razrjeđenje• realni proces – promjene energetskog stanja molekula pri većim

koncentracijama negativno djeluju na uspostavljanjeravnoteže ("kašnjenje") što povećava disperziju (w)

(iv) Promjer čestica sorbensa i kolone

• manja zrnca – veća ukupna površina ali usporavanje brzine MF (u)

• naći optimum za svaki slučaj• u pukotinama zrnaca zadržavaju se molekule povećanje difuzije;

zato je povoljan kuglasti oblik zrnaca bez pukotina

18

• uža kolona – bolje razlučivanje (nema ljevkastih vrpci!)

(v) Tip veze SF-analit

• prečvrste veze – razvučene vrpce• preslabe veze – nema efekta razdvajanja• najpogodnija Eveze = 21-63 kJ/mol

(dipol-dipol; vodikova veza, koordinacijska veza)

8.6.2. Razlučivanje

• Mjera za uspješnost kromatografije jest razlučivanje RS (tvari A i B):

Rs= 2 ∆Z/wA + wB

19

• Za bolje razlučivanje treba povećati N (broj tavana), α (separacijski faktor)i k (faktor zadržavanja):

20

− N se povećava smanjenjem promjera čestice SF − k ovisi o temperaturi (GC) i o sastavu MF (LC)

R =N

4

kB 1+kB

α - 1α

8.7. Kromatografske tehnike

• U prethodnim primjerima: elucijska analiza (jedina tehnika u razdjelnoj kromatografiji)

• Frontalna analiza i analiza istiskivanjem− uklanjanje "repova" u adsorpcijskoj kromatografiji

8.7.1. Elucijska analiza

• Elucijski agens ili eluens – MF pri elucijskoj analizi – ne smijereagirati sa SF

21

• Postupna elucija – dodatak sve "jačih" eluenasa

• Gradijentna elucija – kontinuirana promjena sastava eluensa

8.7.2. Frontalna analiza

• Služi za uklanjanje "repova" u adsorpcijskoj kromatografiji

• Postupak: otopinu smjese dodaje se u kolonu do njezina zasićenja

22

8.7.3. Analiza istiskivanjem

• Elucijska + frontalna analiza

• Tvar se nanosi na kolonu a potom dodaje otopina "istiskivala" D(umjesto eluensa)

• Primjena:(ii) uklanjanje nepoželjnog sastojka (mala količina) iz smjese

(npr. EtOH iz CHCl3)

(i) određivanje tragova nečistoća

23

• Učinak: D se najjače adsorbira pa istiskuje slijedom sve slabije adsorpcijeC, B, A te se dobivaju vrpce čistih tvari

8.7.4. Usporedba razdjelne i adsorpcijske kromatografije

• Odabir: razdjelna kromatografija pogodnija za razdjeljivanje srodnihspojeva (homologni niz); zbog specifičnosti adsorpcijskih efekata adsorpcijska kromatografija služi za razdjeljivanje različitih spojeva

• Prednost razdjelne kromatografije: uže kromatografske vrpcebez "repova"

• Nepogodnost adsorpcijske kromatografije: SF često reaktivna

• U praksi: često istodobnost adsorpcijskih i razdjelnih procesa (PC)

24

8.7.5. Odabir MF i SF u adsorpcijskoj kromatografiji

SF MF

SiO2Mg-silikat

ANALIT

srednje

Al2O3RX

petroleter RH

CaO

CaCO3

aktivna

MgO

cikloheksanCCl4ClCH=CCl2benzenCH2Cl2CHCl3 (bez EtOH)Et2OEtOAcpiridinMe2COEtOH

talkškrobceluloza

MeOHMeCNH2O

RORRCOOR

nereaktivna

RCOR

RCO2H

RCHORCONHRRNH2ROH

ArOH

aktivna

polarnost

25

STAHLOV TROKUT

SF MF

SMJESA

aktivna polarna (hidrofilna)

neaktivna

nepolarna (lipofilna)

nepolarna (lipofilna)polarna (hidrofilna)