A humán genom projekt 2. A humán genom projekt 2.

Mol. biol. módszerek Dr. Sasvári Mária

Kb. 40,000 - 60,000 fehérje kódoló gén (sokkal kevesebb, mint amennyit vártunk)

vagyis a gének a genom kevesebb mint 5%-át foglalják el…..

A “hasznos információ” - hány génünk van?

A “hasznos információ” - hány génünk van?

Hogyan találjuk meg a géneket?

Kiindulási pont: Az agy (és más szövetek) mRNS információtartalma (cDNS)

Gén = az az információ, amely az egyes szövetekben kifejeződik (expresszálódik)

Rövid másolatok (150 -400 bp) PCR reakcióval:

Random primer

Craig Venter

EST = expressed sequence tagEST = expressed sequence tag

Olyan rövid DNS szekvencia részletek, melyek kifejeződnek (az agyban ill. máshol)

EST könyvtár

Az agyban (ill. más szövetekben) kifejeződő gének azonosítására alkalmas

2. Hol van az EST a humán genomban? ‘in silico’ keresés

BLAST – Basic Local Alignment Search Tool

1. EST -k szekvenálása

2375 agyi EST szekvenálása + BLAST

3. Gének azonosítása, új gének felfedezése

< 400 ismert gén Közel 2000 új gén felfedezése

A gének könyve

Celera, 2001: kb. 30 000 EST kb. 35 000 humán gén

Gének azonosítása ‘in silico’Gének azonosítása ‘in silico’

Mi jellemző a génre:1. Start jel (start kodon)2. Stop jel (stop kodonok) NE LEGYENEK SŰRŰN!3. Exon/intron átmenet: jellemző szekvenciák

Kereső programokpl. ORF (NBCI)

ORF= open reading frame =„Olvasási keret” ORF= open reading frame =„Olvasási keret”

GTGCGTGAGC GTGGCCACCG AGCGCGCCCT GCAGACGCCC

ACCAACTCCT TCATCGTGAG CCTGGCGGCC GCCGACCTCC

TCCTCGCTCT CCTGGTGCTG CCGCTCTTCG TCTACTCCGA

GGTGAGCCGC GTCCGGCCGC ACGAGCATCC TCACCTGCTC

123

654

NCBI ORF finder: „Olvasási keret kereső”

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html

Transzkripciós faktorokTranszkripciós faktorok

1

DNS

kódoló régió5’ nem kódoló régió

promoter

enhancer / silencer szekvenciák

DNS-dep. RNS-pol. II.

Transzkr. F.(FEHÉRJÉK)

TATAGCGT

TATA-box: TATA AAT

AT

GC-box: GGGGCGGGG

GT/CACC-box: GGTGTGGG

TATA

GC

GT

Zn2+

Y

C C F

LH H

...

...

Sp1

DNS-fehérje kölcsönhatás vizsgálat

Gél retardáció Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

DNS-fehérje kölcsönhatás vizsgálat

Gél retardáció Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

EMSA

Szabad DNS darab (jelölt oligo)

*

DNS-fehérje

komplex

*

START

Hagyományoselektroforézis

0 2 4 6 8 perc

Kapilláriselektroforézis

lassabb

EMSA

gyorsabb

Szabad DNS darab (jelölt oligo)

*

DNS-fehérje

komplex

*

Specifikus-e a DNS-fehérje kötődés ?

Kompetíciós (versengési) kísérletek

–CCCTTGGTGGGGGCGGGGCCTAAGCTGCG–3’3’–GGGAACCACCCCCGCCCGGGATTCGACGC–5’

F5’–

„vad típusú próba”

5’–CCCTTGGTGGGGGCGGGGCCTAAGCTGCG–3’3’–GGGAACCACCCCCGCCCGGGATTCGACGC–5’

„specifikus kompetitor”

„nem-specifikus (mutáns) kompetitor”5’–CCCTTGGTGGGTTGGGGGCCTAAGCTGCG–3’3’–GGGAACCACCCAACCCCGGGATTCGACGC–5’

A jelöltoligo

a „próba”

A nem jelöltoligo

a „kompetitor”

1 2 3

EMSA: A specifikus kötődés igazolása

DNS-fehérje

komplex

*

+

Nem spec. komp.

DNS-fehérje

komplex

*

Spec. Komp.

+

DNS-fehérje

komplex

nem látjuk

2

DNS-fehérje

komplex

*

látjuk

3

1 2 3

EMSA: A specifikus kötődés igazolása: supershift

DNS-fehérje

komplex

*

Spec. ellenanyag

+

DNS-fehérje

komplex

*

még lassabb„supershift”

2

DNS-fehérje

komplex

*

+Spec.

ellenanyag + antipeptid

3

DNS-fehérje

komplex

*+

Rekombiáns DNS technológia a gyógyszeriparban

Humán rekombináns fehérjék előállítása gyógyászati célra

Rekombiáns DNS technológia a gyógyszeriparban

Humán rekombináns fehérjék előállítása gyógyászati célra

Rekombináns gyógyszerek Rekombináns gyógyszerek

tPA trombózis

VIII. faktor hemofilia

CSF (colony stimulatong factor) immundeficiencia

eritropoetin anemia

hGF (growth factor) hGF hiány (növekedési rendellenesség)

inzulin diabetes

interleukin immunodeficiencia

VACCINÁK Pl. hepatitis B

FEHÉRJÉK ipari előállítása ?

Humán génexpresszió Prokariótákban Humán génexpresszió Prokariótákban

Expressziós vektorok

A humán gén “háziasítása”

- csak exonok (cDNS)

- bakteriális promoter

- bakteriális riboszóma kötőhely

Az idegen fehérje expressziójának ki/be kapcsolása

ProK DNS lac promoter lac operátor Humán fehérje cDNSRepresszor

fehérje

+IPTGindukció expresszió

Inzulin: Az első engedélyezett rekombináns gyógyszer Inzulin: Az első engedélyezett rekombináns gyógyszer

1. Vektor konstrukció

AmpR

ori

lacZ( gal)

InzulinA vagy B lánc

(inszert)

Mesterséges “ inzulin gén”

Aminósav szekvencia

bázisszekvencia

2. Bakteriális transzformáció, AmpR klónok szelektásása és klónozása

E. coli

Bakteriális kromoszóma

lac represszorAmpR

plazmid

3. Fúziós fehérje termelése IPTG adásra

4. Lízis, fehérje izolálása, tisztítása

6. A és B lánc in vitro egyesítése

gal inzulin

5. CN Br kezelés: Metionin lebomlik, inzulin felszabadul

Met-hiányos hGH bakteriális expressziója Met-hiányos hGH bakteriális expressziója

1. Transzformáció szelekció

növesztés

2. hGH szekréció a periplazmás térbe

3. Bakteriális periplazmás proteáz:levágja a szignál szekvenciát

4. Met-nélküli rec hGH tisztítása

1. Vektor konstrukció

hGHBakteriális

szignál szekvencia(extracelluláris)

AmpR

Riporter rendszerek

Riporter génekRiporter gének

EuKsejt

sejtmag

Virus-vektor-riporter gén konstruktum

Expresszió mérés a riporter fehérje alapján

• luciferáz ATP ADP + Pi + fény • -galaktozidáz Laktóz analóg kék színű termék KÉK SEJTEK• CAT (kloramfenikol acetil transzferáz)

Riporter gének felhasználásapl. Transzkripciós faktorok (TF) tesztelése

riporter12

A vektor B vektor

3

1: enhancer2: promoter3: TF génje

EuKsejt

sejtmagTF

megtermékenyített petesejt

vákum

csipesz

Transzgenikus állatokTranszgenikus állatok

1982: az óriás egér

Növekedési hormon gén injektálása

a hím pronukleuszba

1. Mikroinjektálás (több száz petesejt, mikromanipulátor)2. Beültetés ál-terhes nősténybe3. Az utódok ellenőrzése (PCR a farokból)4. Pároztatás5. Beltenyésztés - Klónozás?

A transzgenikus állatok elkészítése

A t-PA-t tejelő egérA t-PA-t tejelő egér

t-PA + lactalbumin szignál szekvencia szövet specifikus promoter

szekréció a tejbe: 0.1 mg t-PA/ml tej

Jövő: transzgenikus tehén? (JUH, KECSKE)

Molecular Farming

A transzgenikus állatok klónozása

A transzgenikus állatok klónozása