Amiloid -peptid által indukált komplement aktiváció gátlása kis molekulatömegű szintetikus

vegyületekkel in vitro

Készítette: Dr. Sárvári Miklós

Richter Gedeon Vegyészeti Gyár Nyrt.

Témavezető: Dr. Sass Miklós, egyetemi tanár

ELTE, TTK,

Anatómiai, Sejt- és Fejlődésbiológiai Tanszék

BIOLÓGIAI DOKTORI ISKOLAVezető: Dr. Erdei Anna, akadémikus

MOLEKULÁRIS SEJT- ÉS NEUROBIOLÓGIAI DOKTORI PROGRAM

Vezető: Dr. Sass Miklós, egyetemi tanár

Köszönetnyilvánítás

Ezúton mondok köszönetet Sass Miklós professzor úrnak, témavezetőmnek, hogy bátorított a

doktori programban való részvételre. Köszönöm segítségét és támogatását, szakmai tanácsait,

amelyekkel munkámat segítette.

Köszönöm volt főosztályvezetőm, Dr. Lőw Miklós, és osztályvezetőm, Dr. Pázmány Tamás

támogatását, amellyel a Társaságnál futó komplement kutatásokat segítették.

Köszönettel tartozom volt vezetőimnek, köztük elsősorban Závodszky Péter professzor úrnak,

hogy bevezetett a tudományos kutatás világába. Köszönöm Alfred F. Esser professzor úrnak,

hogy amerikai ösztöndíjas éveim során segített, és a komplementrendszer újabb arcát

ismertette meg velem.

Köszönöm technikus kollégám, Bozonász Irini pontos és lelkiismeretes munkáját.

Végül, de nem utolsósorban köszönöm jelenlegi, és volt munkatársaim: Dr. Ambrus Géza, Dr.

Cseh Sándor, Dr. Gál Péter, Kósa János, Lehotzky Attila, Dr. Likó István, Dr. Lőrincz Zsolt,

Dr. Mák Mariann, Szilágyi Katalin, Dr. Tóth Szilvia, Dr. Urbányi Zoltán, Dr. Villar Maite,

Dr. Wang Yunxia segítőkészségét és támogatását.

Köszönöm családom türelmes megértését, amellyel a kutatói életformából adódó nehézsége-

ket elviselték, és örömüket, amellyel örömeimben osztoztak.

2

Tartalomjegyzék

1 ÖSSZEFOGLALÁS 5

2 SUMMARY 6

3 BEVEZETÉS 8

3.1 A komplementrendszer aktivációja és szabályozása 9

3.1.1 A klasszikus reakcióút 9

3.1.2 Az alternatív reakcióút 12

3.1.3 A lektin reakcióút 13

3.1.4 C3, a komplementrendszer központi molekulája 14

3.1.5 A C5 aktivációja 14

3.1.6 A membránkárosító komplex kialakulása a terminális fázisban 15

3.1.7 A komplementrendszer szabályozása 16

3.2 Komplement fehérjék bioszintézise 18

3.3 A komplementrendszer aktivációja betegségekben 18

3.4 A komplement aktiváció szerepe az Alzheimer kór kialakulásában

3.4.1 Az Alzheimer kór 19

3.4.2 Alzheimer kórban kialakuló krónikus gyulladás 19

3.4.3 A komplement szerepe az Alzheimer kór patogenezisében 21

3.4.4 A komplement aktiváció a betegség állatmodelljeiben 22

4 CÉLKITŰZÉSEK 23

5 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

5.1 Sejttenyészetek és jellemzésük 25

5.2 RNS izolálás és reverz transzkripció 26

5.3 Polimeráz láncreakció 26

5.4 Szilárd fázisú kötési vizsgálat 27

5.5 Komplement toxicitási teszt 28

5.6 Tömegspektrometria 28

3

6 EREDMÉNYEK

6.1 Komplement aktiváció citotoxikus hatásainak kimutatása in vitro 29

6.2 C1-Inh felfüggeszti a komplement közvetített citotoxicitást 30

6.3 Komplement gének expressziója glia sejtekben

6.3.1 Komplement gének transzkripciója mikroglia sejtekben 31

6.3.2 Komplement génkifejeződés változása gyulladásos stimulus hatására 32

6.3.3 A peptid hatása C1q és C1-Inh gének átíródására 34

6.4 A C1q és A közötti kölcsönhatás tanulmányozása

6.4.1 Humán és egér C1q kötése az A peptidhez 37

6.4.2 Az ionerősség hatása 38

6.5 C1q kötést gátló ismert vegyületek

6.5.1 Glikózaminoglikánok 39

6.5.2 RBI vegyületkönyvtár 40

6.6 C1q kötést gátló új szintetikus vegyületek 41

7 EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE

7.1 A komplement aktiváció biológiai jelentősége 46

7.2 A peptid által kiváltott komplement aktiváció 48

7.3 Az A peptid által kiváltott aktiváció a klasszikus úton történik 49

7.4 C1q, a szelektív komplement gátlás lehetséges molekuláris célpontja 50

7.5 Valószínűleg nem az A14-26 régió a C1q A kötőhelye 51

7.6 A komplement gátlás lehetséges terápiás előnyei és hátrányai 52

7.7 Komplement aktiváció gátlása sclerosis multiplex kezelésére 53

8 CÉLKITŰZÉSEK MEGVALÓSULÁSA 55

9 SAJÁT KÖZLEMÉNYEK 57

10 IRODALMI HIVATKOZÁSOK 59

4

1 Összefoglalás

Az utóbbi évek preklinikai és klinikai kutatási eredményei szerint az agy neuroimmunológiai

folyamatai fontos szerepet játszanak a neurodegeneratív betegségek kialakulásában. Ezekben

a folyamatokban a komplementrendszer, az asztroglia és mikroglia sejtek központi szerepet

játszanak. A krónikus komplement aktiváció jelenléte az agyban az időskori demenciák,

köztük az Alzheimer kór egyik közös jellemzője. Több, az egyes betegségekre jellemző

fehérje természetű komplement aktivátort azonosítottak. A komplement első komponensének

q alegysége (C1q) köt az amiloid -peptidhez, ami oki kapcsolatba hozható az Alzheimer kór

kialakulásával. A két fehérje közötti kölcsönhatásnak három funkcionális következménye van

in vitro. A C1q kötés hatására legalább egy nagyságrenddel megnő az amiloid -peptid

aggregációja. A C1q beépülése az amiloid aggregátumokba megnehezíti azok fagocitózisát az

agy szöveti makrofágja, a mikroglia számára. Végül, de nem utolsósorban a kölcsönhatás a

komplement klasszikus útjának antitest-független aktivációját eredményezi. Mindez azt

sugallja, hogy az Alzheimer kór patológiájában elsősorban a klasszikus útnak van jelentősége,

noha az amiloid -peptid aktiválja a komplement alternatív útját is. A komplement aktiváció

toxikus hatásai ellen szolubilis és membránkötött fehérjék védik a szervezet saját sejtjeit. Az

elhúzódó komplement aktiváció az agyban különösen veszélyes, mert egyes agyterületeken,

különösen a kéregben, a komplement regulátor fehérjék alacsony szintje védtelenné teszi az

idegsejteket a membránkárosító komplex kialakulásával szemben. Kutatásaim az aktiváció

útvonalának felderítésére, és szelektív komplement gátlók kifejlesztésére irányultak.

Megállapítottuk, hogy komplement forrás jelenlétében az amiloid -peptid hippokampális sej-

tek pusztulását okozta in vitro. A klasszikus aktivációs útvonal endogén szabályozó molekulá-

ja, a C1 inhibítor, a citotoxikus hatást felfüggesztette. In vitro kísérletekben kimutattuk, hogy

mikroglia sejtekben állandó C1q szintézis folyik. Irodalmi adatokkal összhangban ez arra

utalt, hogy a C1q fehérje intakt vér-agy gát mellett is állandóan jelen van az agyban. A C1q

fehérjét molekuláris célpontnak választva olyan ismert vegyületeket azonosítottunk, amelyek

gátolták a C1q kötést amiloid -peptidhez. Ezek a vegyületek ugyanakkor nem gátolták a C1q

kötést az antitestek Fc régiójához. Ez az eredmény bizonyította, hogy a C1q molekulán

szelektíven gátolható az amiloid -peptid kötőhely. A Társaság vegyülettárából olyan

molekulákat azonosítottunk, amelyek gátolták a C1q kötést amiloid -peptidhez. A 308

vegyület közül 301 nem befolyásolta a C1q kötést immunkomplexben levő antitestek Fc

régiójához. A 308 vegyület közül 56 gátolta a C1q kötést C-reaktív proteinhez, és 35 mielin

5

bázikus fehérjéhez. Kémiai optimalizálás után vezérmolekulát állítottunk elő. A vegyület

mikromoláris koncentráció alatt gátolta a C1q kötést amiloid -peptidhez, C-reaktív protein-

hez és mielin bázikus fehérjéhez. Szelektivitási vizsgálatokban megállapítottuk, hogy a vezér-

molekula nem gátolta a C1q kötést antitestek Fc régiójához, és a szérum amiloid P kötést

amiloid -peptidhez. ESI-MS kísérlettel igazoltuk, hogy a vegyület nem köt amiloid -peptid-

hez, tehát a C1q amiloid kötőhelyén keresztül gátolja a C1q kötést. A vezérmolekula a

beállított sejtalapú tesztben gátolta a komplement aktivációt és megvédte a hippokampális

sejteket a komplement-függő amiloid -peptid toxicitás ellen. A vegyület szerkezete alapján

várható, hogy átjut a vér-agy gáton és jelentős agyszint érhető el in vivo.

Több kísérlet igazolta, hogy a komplementrendszer antitest-független aktivációja szerepet

játszik a kísérleti úton kiváltott autoimmun encephalomyelitis, a sclerosis multiplex állatmo-

delljében tapasztalható gyulladás kialakulásában és idegsejt pusztulásban. Ez felvetette annak

lehetőségét, hogy a vegyületet sclerosis multiplex különböző modelljeiben is vizsgáljuk.

2 Summary

Recent preclinical and clinical studies have demonstrated that neuroimmune processes of the

brain play important role in the pathogenesis of neurodegenerative diseases. These neuro-

immune processes include the complement system, microglia and astrocytes. Ample evidence

implicates the involvement of the complement system in the pathology of several neuro-

degenerative diseases including Alzheimer’s disease (AD). Residential brain cells, including

neurons, astrocytes and microglia, synthesize proteins of the complement system, so

complement involvement does not depend on disruption of the blood-brain barrier.

Complement synthesis is upregulated in AD brain and complement proteins, including C1q

are associated with senile plaques, one of the pathological hallmarks of AD. C1q, the recog-

nition subunit of the classical pathway binds to amyloid -peptide (A), the major constituent

of these plaques. The interaction between the two proteins has three functional consequences

in vitro. As a result of C1q binding, aggregation of A is enhanced by an order of magnitude.

Incorporation of C1q onto amyloid fibrils blocks the uptake of A by microglia. Most

importantly, C1q binding to A results in activation of the classical pathway in an antibody-

independent manner. It suggests that in AD pathology the classical pathway bears particular

6

importance, although A activates the alternative pathway of complement via binding to C3

as well.

Host tissue is protected against the toxic effect of complement activation by soluble and

membrane-associated regulators. Neurons in the hippocampus and cortex express low levels

of most complement regulators, which makes them susceptible to complement-mediated

damage. Indeed, the end product of the terminal pathway, the membrane attack complex has

been detected on dystrophic neurites and damaged cells in AD brain by several laboratories.

These results provide solid evidence that A peptides, produced and accumulated in AD

brain, drive sustained activation of the complement system resulting in destruction of

complement-sensitive neurons.Although the pathogenic potential of this powerful effector

mechanism has been recognized, a complement inhibitor is still lacking from the therapeutic

arsenal.

The aim of this project was to identify the major route of A-induced complement activation

and to develop selective inhibitors of the complement system. We showed that A in the

presence of complement damaged hippocampal cells in vitro. The endogenous inhibitor of the

classical pathway, C1-Inh suspended the toxic effect. We selected C1q as molecular target

and identified synthetic compounds that inhibited C1q binding to A, but not to antibodies.

These compounds inhibited C1q binding to other non-immunoglobulin activators such as C-

reactive protein, serum amyloid P and myelin basic protein as well. Based on these results, it

is likely that C1q possess the same binding site for non-immunoglobulin activators.

Recent studies on a mouse model of multiple sclerosis, experimental autoimmune encephalo-

myelitis (EAE) implicate myelin induced complement activation in the pathology of the

disease. These results warrant the study of the lead compound in various models of multiple

sclerosis. This can provide further information on the role of pathological complement

activation in various forms of multiple sclerosis and reveal the benefits of its inhibition via

C1q.

7

3 Bevezetés

A komplement a veleszületett immunitás nem antigénspecifikus végrehajtó rendszere, amely

elsősorban az extracelluláris patogének ellen irányul. A komplementrendszert mintegy 30

fehérje, proteázok, speciális funkciójú fehérjék, inhibítorok és receptorfehérjék alkotják. A

rendszer működése alapján három szakaszra bontható, aktivációs, központi és terminális

fázisra. Az aktiváció három független útvonalon, klasszikus, lektin és alternatív reakcióúton

történhet, és mindhárom a komplement központi, C3 komponensének hasításához vezet. A

központi szakaszban a C3 és a C5 aktivációja során több, kulcsfontosságú hasítási termék

szabadul fel. A terminális szakasz során egy litikus, C5b-9 összetételű membránkárosító

komplex keletkezik.

1. ábra A komplementrendszer felépítése. A kaszkád három útvonalon aktiválódhat, az

aktivációs utak a C3 hasításánál futnak össze. A központi szakaszban felszabaduló kisméretű

C3a és C5a fragmentumok hatékony gyulladásserkentők, míg a nagy C3b fragmentum

kovalensen kapcsolódik a célsejt membránjához (opszonizáció). A terminális fázisban alakul

ki a C5b-9 összetételű membránkárosító komplex.

Klasszikus Alternatív

C3

C5

Lektin

C3a

C5a

C5b-9

C3b

C5b

gyulladáskemotaxis

opszonizáció

sejt lízis

Aktivációs fázis

Centrális fázis

Terminális fázis

8

3.1 A komplementrendszer aktivációja és szabályozása3.1.1 A klasszikus reakcióút

A komplement aktiválódásának legkorábban leírt módja a klasszikus aktivációs út. A

reakcióút beindításának legismertebb példája a komplement első komponensének (C1) anti-

testek által történő aktivációja. Az aktivációt a C1q antigénnel kapcsolódott antitestek Fc

régióihoz történő kötése váltja ki (Schumaker és mtsai, 1987). A C1q alegység 18 polipeptid

láncból (6A, 6B és 6C) épül fel, amelyek N-terminálisa egy 81 aminosav hosszúságú (-Gly-

Xaa-Yaa-)27 kollagénszerű szekvenciát , C-terminálisa egy 136 aminosavból álló globuláris

szakaszt tartalmaz (Reid & Porter, 1976). A kollagénszerű szakasz feléig a hármas hélixek

párhuzamosan futnak, majd szétválnak és kúpszerűen távolodnak egymástól. A kollagén

szárak globuláris doménekben végződnek. A C1q elektronmikroszkóppal megfigyelt szerke-

zete egy hat szál tulipánból álló csokorra emlékeztet (2. ábra). A globuláris domének felelnek

meg a tulipánfejeknek, míg a kollagénszerű szerkezet a száraknak. A globuláris fejek és a

kollagén szárak egy része tölcsért formál. Itt, a szárak között helyezkednek el a C1 komplex

további tagjai, a C1r és C1s alegységek (Tosi és mtsai, 1987; Sárvári és mtsai, 1990). Az

enzimatikus funkciót hordozó alegységek C1r2s2 összetételű komplexet alkotnak, amelyet Ca+

+ stabilizál.

2. ábra A C1q elektronmikroszkópos (EM) vizsgálatok adatai alapján készített szerkezeti

modellje, és az azt alátámasztó EM felvételek. A felső sorban intakt C1q molekulák, az alsó

sorban pepszines emésztéssel előállított C1q szárak láthatók (Brodsky-Doyle és mtsai, 1976).

9

A C1 klasszikus aktivátorai az immunglobulin G (IgG) és IgM. A C1q fejek gyenge kötést

létesítenek a monomer IgG Fc régiójával, de a kötés erőssége az immunkomplexekben

található multimer IgG Fc régióihoz drámaian megnő (Duncan & Winter, 1988). A C1

aktivációjához legalább két C1q globuláris domén kötése szükséges. A C1q különböző

affinitással köt az egyes immunglobulin alosztályokhoz. Legnagyobb affinitással az IgG3,

legkisebb affinitással az IgG4 alosztályhoz köt, ez utóbbi már nem vezet C1 aktivációhoz. A

C1q egyáltalán nem köt IgA, IgE és IgD antitestekhez, ezek immunkomplexei nem is

aktiválják a klasszikus utat. A C1q kötőhelyet humán IgG1 monoklonális antitesten tanulmá-

nyozták (Idusogie és mtsai, 2000). A C1q kötőhely az Fc régióban a CH2 domén D270, K322,

P329 és P331 oldalláncok környezetében található. A C1q kötőhely szélén két további amino-

savat, K326 és E333 azonosítottak (Idusogie és mtsai, 2001). Egér antitestben ezzel szemben

a kötőhely kialakításában elsősorban az E318, K320 és K322 oldalláncok vesznek részt

(Duncan & Winter, 1988).

A C1q több globuláris fejének kötése nyomán a C1q tölcsér geometriája és a C1r2s2 szerkeze-

te torzul. Amíg a szabad C1 komplexben (3. ábra) a C1r2C1s2 aktiválódását a C1r katalitikus

doménjei közé beékelődő C1s megakadályozza, a C1q kötésre bekövetkező szerkezetváltozás

során a C1r katalitikus doménjei egymás mellé kerülnek, ami elősegíti a C1r autoaktivációját

(Gaboriaud és mtsai, 2004). Az így keletkező aktív C1r proteáz hasítja a szomszédságában

lévő C1s proenzimet, amely a proenzim aktiválódásához vezet (Sárvári és mtsai, 1990; Luo és

mtsai, 1992). A C1s szubsztrátja a komplement negyedik (C4) és második (C2) komponense,

a hasítás után a keletkező C4b reaktív acilcsoportja révén kovalensen kapcsolódhat hidroxil-

vagy aminocsoportokhoz. A molekulán C2 kötőhely kerül a felszínre, és a C2a kapcsolódása

után kialakul a C4b2a komplex, a klasszikus út C3 konvertáza. A C4b ligandja a fagocitákon

található egyes komplement receptoroknak.

Az antitesteken kívül számos molekula ismert, amelyek antitestek távollétében közvetlenül

képesek C1q kötésre és a klasszikus útvonal aktivációjára. Ezek közül kiemelkedően fontosak

a pentraxinok családjába tartozó akutfázis fehérjék, mint a C-reaktív protein (CRP) és a

szérum amiloid P (SAP), mielin fehérjék (mielin bázikus protein), intracelluláris komponen-

sek (DNS, hisztonok és mitokondriumok), Gram-negatív baktériumok és egyes vírusok.

Az antitestekhez vagy más komplement aktivátorhoz kötött C1q ligandja a több sejttípuson is

megtalálható C1q receptoroknak (Erdei, 1990; Eggleton és mtsai, 1998).

10

3. ábra A C1 komplex 3D szerkezeti modellje (Gaboriaud C és mtsai, 2004). A C1q oldal-

nézeti (a) és alulnézeti (b) képe. A C1q „nyitott” konformációban látható, amely a C1

komplex aktivációjához vezet. A C1q láncai színesek, A lánc kék, B zöld és C vörös. A C1q

globuláris doménen található cukor oldallánc sárga. A nyilak az A59 és B61 lizin oldallánco-

kat jelölik, amelyekről azt gondolják, hogy a C1r és C1s alegységekkel való kölcsönhatásért

felelősek. A kollagén szárakban található lizinek nagyrészéhez diszacharidok kapcsolódnak.

A C1r és C1s alegységek moduláris szerkezete (c). Mindkét proteáz tartalmaz egy N-

terminális CUB1 modult, egy Ca++-kötő EGF-szerű modult, egy második CUB modult, két

CCP modult és egy kimotripszinszerű szerin proteáz domént (Cseh és mtsai, 1996). A C1r és

C1s a szerin proteáz doménben található Arg-Ile kötés (nyíl) hasítása által aktiválódik. A

molekulákon található glikozilációs helyeket fekete négyszögek jelzik. A modulok színkódja

az ábra további részeire (d-g) is érvényes.

11

A C1r katalitikus régiójának homodimér szerkezete (d). A C1 komplex oldalnézeti képe. A

C1r2C1s2 tetramer a C1q szárak között helyezkedik el. A tetramer alulnézeti képe (e). Egy C1r

és C1s alegységben az egyes modulokat jelölések mutatják. A C1 komplex alulnézeti képe (f).

A C1q nyugalmi állapotban, zárt konformációban van. Jól láthatóak a C1q szárai között

elhelyezkedő tetramer doménjei. Nyugalmi állapotban a C1r katalitikus doménjei nem

érintkeznek egymással.

A C1 aktiváció a C1-inhibítor (C1-Inh) szabályozása alatt áll (Ziccardi, 1985). A szerin

proteáz inhibítorok családjába tartozó C1-Inh az egyetlen ismert inhibítora a C1r és C1s

alegységeknek. A szérumban hétszeres moláris feleslegben lévő C1-Inh reverzibilisen köt a

nem-aktivált C1 komplexhez és megakadályozza a C1r autoaktivációját. A C1 aktivációja

után másodperceken belül kovalensen kötődik az aktiválódott C1r és C1s proteázokhoz és

inaktiválja azokat.

3.1.2 Az alternatív út aktivációja

Szemben a klasszikus úttal, az alternatív út aktivációja antitestek távollétében zajlik. A

C3 folyadék fázisban kismértékben spontán aktiválódik, és felszínre kerül a molekulában

található tioészter csoport. Az így keletkező C3b Mg++ jelenlétében B-faktort köthet, amit a D-

faktor hasít és ezáltal egy C3bBb összetételű komplex keletkezik. A komplex az alternatív út

C3 konvertáza (Pangburn és mtsai, 1981). Ez a folyamat normál esetben csak nagyon

alacsony szinten működik, de nagymértékben nő az aktiváció mértéke, ha a C3b egy alternatív

utat aktiváló felszínhez köt (Pangburn & Müller-Eberhard, 1978). Az ilyen felszínek közös

jellemzője az alacsony sziálsav és a viszonylag jelentős nukleofil csoport tartalom. Az alterna-

tív reakcióút működése szigorúan szabályozott. A H- és I-faktorok megakadályozzák a

C3bBb véletlenszerű keletkezését. A H-faktor egyrészt disszociáltatja a C3bBb komplexet,

másrészt kofaktora az I-faktornak, amely a C3b molekulát hasítja és inaktiválja (Pangburn és

mtsai, 1977). Az aktivátorként viselkedő sejtfelszíneken azonban a komplex védve van a H-

és I-faktortól, ezáltal működik a C3 aktivációs hurok. A szervezet saját sejtjeit membránkötött

szabályozófehérjék, CR1, DAF, MCP védik a C3bBb komplex kialakulásától.

12

3.1.3 A lektin reakcióút aktivációja

A lektin út aktivációjában a mannózkötő lektin (MBL) fehérje játssza a központi

szerepet. Az MBL szénhidrátok felismerésére szakosodott fehérje, amelynek szerkezete nagy-

fokú hasonlóságot mutat a klasszikus reakcióút aktivációjában kulcsszerepet játszó C1q

molekulával. Az MBL globuláris doménjei olyan szénhidrátláncokat ismernek fel, amelyek

végén mannóz, N-acetil-glükózamin vagy fukóz található. Az MBL nem kötődik az emberi

glikoproteinek szénhidrátláncának végén található sziálsavhoz és galaktózhoz, tehát a lektin

reakcióút a szénhidrátok végállású szacharidja révén különbözteti meg az idegent a sajáttól.

Az MBL két további fehérjével, MASP-1 és MASP-2 proenzimekkel képez komplexet (Thiel

és mtsai, 1997). Az MBL patogének felszínén található szénhidrátokhoz köt, majd a kötés

hatására bekövetkező konformációváltozás hatására a MASP-1 és MASP-2 proenzimek a C1r

és C1s proteázokhoz hasonlóan aktiválódnak. Ezeknek a szerin proteázoknak az aktivációja (a

C1r és C1s proenzimekhez hasonlóan) a C4 aktivációjához vezet. Innen a lektin reakcióút

lefolyása megegyezik a klasszikus útnál megismertekkel (4. ábra).

1. táblázat Komplement aktivációs fehérjék. Az aktivációban résztvevő fehérjék a C1q és

MBL kivételével proteázok, amelyek kaszkádszerűen aktiválják egymást (4. ábra)

komplement komponens

koncentráció [g/ml szérum]

mw [kDa] funkció referencia

klasszikus útvonalC1q 70 410   Reid & Porter, 1976C1r 34 85 proteáz Journet & Tosi, 1986C1s 31 85 proteáz Tosi és mtsai, 1987C4 600 206 proteáz Carroll & Porter, 1983C2 25 117 proteáz Bentley & Porter, 1984

alternatív útvonalD-faktor 1 24 proteáz Mole & Anderson, 1987

C3 1300 195 proteáz Domdey és mtsai, 1982B-faktor 200 95 proteáz Campbell & Porter, 1983

lektin útvonalMBL 150 600   Super és mtsai, 1989

MASP-1 6 83 proteáz Dahl és mtsai, 2001MASP-2   52 proteáz Thiel és mtsai, 1997

13

3.1.4 C3, a komplementrendszer központi molekulája

A klasszikus, alternatív és lektin útvonalak a C3 hasításánál futnak össze (1., 4. ábra).

A klasszikus út aktivációja során a C4b2a két fragmentumra (C3a és C3b) hasítja a C3

molekulát (Müller-Eberhard és mtsai, 1966). A hasítás során keletkező C3b fragmentumban

egy tioészter kötés a felszínre kerül (Pangburn & Müller-Eberhard, 1980). A tioészter csoport

rendkívül reaktív, és reakcióba lép vízzel vagy a sejtfelszínen, szénhidrátokban, immunkomp-

lexekben található nukleofil csoportokkal (Janssen és mtsai, 2006), ezáltal a C3b kovalensen

megjelöli az adott sejtet (Law & Levine, 1977). A belső tioészter csoport felszínre kerülésével

a C3b elvileg bármilyen sejtfelszínhez kapcsolódhat, beleértve a szervezet saját sejtjeit is. A

komplement aktiváció itt válik kétélű fegyverré, ugyanis a C3b mikroorganizmusok és vírus

fertőzött sejtek felszínéhez kapcsolódása kívánatos, de a szervezet saját sejtjeinek megjelölése

potenciális veszélyeket hordoz. Ezt a veszélyt csökkenti, hogy a tioészter csoport nagyon

rövid életidejű, és azonnal reagál vízzel. Tehát a C3b elméletileg csak az aktivációt kiváltó

célsejt felszínéhez kötődhet. A szervezet saját sejtjei ezáltal védve vannak a C3b jelöléstől.

A kovalensen kapcsolódott C3b (és C4b) fragmentumon több új komplement fehérje (pl. B-

faktor, C5), szabályozó (I-faktor) és receptor fehérje (CR1 és CR2) kötőhely kerül a felszínre.

Ezek a potenciális kölcsönhatások a patogén elpusztítását és fagocitózisát készítik elő.

3.1.5 A C5 aktivációja

A C5 hasonlít a C3 és C4 molekulákhoz, homológ fehérjék, ezért aktivációjuk is

hasonló. A C5-konvertáz a C5 molekulát hasítja és két fragmentum, C5a és C5b keletkezik

(Cooper & Müller-Eberhard, 1970). A felszabaduló C5a anafilatoxin hatékony gyulladás-

serkentő. A hasítás során keletkező másik fragmentum, a nagyon labilis C5b indítja el a

komplement terminális fázisát.

14

3.1.6 A membránkárosító komplex kialakulása a terminális fázisban

A lítikus hatás volt a komplementrendszer első leírt funkciója, és ma már tudjuk, hogy

öt plazmafehérje (C5b, C6, C7, C8, C9) alakítja ki a membránkárosító komplexet. A komplex

a célsejten transzmembrán csatornát képez, ami megbontja a lipid kettősréteg szerkezetét, és a

sejt ozmotikus lízis következtében elpusztul (Esser, 1994).

A C5 hasítása során keletkező C5b, miközben szorosan kötődik a C3b molekulához, köt egy

C6 és C7 molekulát. A C5b-7 komplex egy tranziens membránkötő felszínnel rendelkezik, és

leválik a C3b molekuláról. Ha a komplex nem kötődik gyorsan membrán felszínhez, elveszíti

potenciális lítikus aktivitását. Ha a kötés megtörténik, akkor egy C8 kötése után a C8a irányít-

ja a C9 beépülését a komplexbe. A komplex kialakulása során nem történik proteolitikus hasí-

tás. A komplex azonban egyre inkább hidrofób karakterűvé válik, és egyre mélyebbre merül a

membrán belső rétegébe. A komplex közepén megjelenik egy pórus, amelynek átmérője a

beépülő C9 molekulák számával egyenes arányban nő. A C5b-8(C9)n (n=1-18) komplex

összetétele a hozzáférhető C9 mennyiségétől függ (Podack és mtsai, 1982), és a kialakuló

pórus átmérője elérheti a 70-100 Å nagyságot is. A membránkárosító komplex kialakulása

csökkenti a sejt ozmotikus stabilitását, aminek következtében a sejt elpusztulhat. A sejtek a

komplex levedlése vagy endocitózisa révén próbálják elkerülni ozmotikus egyensúlyuk

elvesztését. A szervezet saját sejtjeit a CD59 membránfehérje védi meg a membránkárosító

komplex lítikus hatásától (Zalman és mtsai, 1986).

3.1.7 A komplementrendszer szabályozása

A komplement aktiváció saját szövetre káros hatásainak kivédése céljából a kaszkád

szigorú szabályozás alatt áll. A szabályozásban keringő és membránkötött fehérjék vesznek

részt (2. táblázat). A keringésben több komplement gátló is található. Központi fontosságú a

C1 inhibítor (C1-Inh), amely a C1r és C1s proteázok inhibítora (Ziccardi, 1985; Davis és

mtsai, 1986). A C1-Inh akut fázis fehérje, és plazma koncentrációja kétszeresére nő fertőzés

esetén. Ezt a szintézist különböző citokinek, köztük interferon- indukálja. Gyulladásos

szövetekben a molekulát az elasztáz proteolitikus hasítás révén inaktiválja, hozzájárulva a

komplement szöveti aktivációjához. A C1-Inh szabályozó funkcióját glikózaminoglikánok,

mint például a heparin több nagyságrenddel növelik (Rent és mtsai, 1976).

15

2. táblázat A komplementrendszer szabályozásában résztvevő fehérjék. A kaszkádot gátló

fehérjék részben vérben keringő fehérjék, másrészt sejtmembrán fehérjék.

komplement komponens

koncentráció [g/ml szérum]

mw [kDa] célpont referencia

keringő gátló fehérjékC1-Inh 200 105 C1r, C1s Davis és mtsai, 1986C4BP 250 550 C4 Hillarp & Dahlback, ’90H-faktor 500 150 C3 Kristensen & Tack, 1986I-faktor 34 90 C4b, C3b Catterall és mtsai, 1987CPN 35 280 C3a, C5a Tan és mtsai, 1990S-fehérje 500 80 C5b-9 Jenne & Stanley, 1985clusterin 60 80 C5b-9 Kirszbaum és mtsai, ’89membrán fehérjékCD55 (DAF)   70 C3 Medof és mtsai, 1987CD46 (MCP)   70 C3 Lublin és mtsai, 1988CD59   20 C5b-9 Zalman és mtsai, 1986

A C4 és a C3 aktivációját szabályozza a C4BP és a H-faktor. Az I-faktor egy szérum proteáz,

amely kofaktorok (pl. C4BP, H-faktor, MCP) jelenlétében hasítja a C4b és C3b aktivációs

fragmentumokat. A szérumban található karboxipeptidáz N (CPN) inaktiválja a C3a és a C5a

fragmentumokat a C-terminális arginin lehasításával (Tan és mtsai, 1990).

Az S-protein és a clusterin a membránkárosító komplex kialakulását gátolja (Jenne & Stanley,

1985; Kirszbaum és mtsai, 1989). A membránkötött komplement gátlók támadáspont alapján

két csoportba oszthatók. Az első csoport a membránkárosító komplex kialakulását gátolja a

saját sejtek membránján. Ide tartozik a CD59 (Zalman és mtsai, 1986), amely a sejtek túlnyo-

mó többségén megtalálható, és gátolja a C9 beépülését és polimerizációját a membránkárosító

komplexben. A membránkötött fehérjék második csoportja a központi jelentőségű C3 aktivá-

cióját szabályozza. Ide tartozik a CD55 (DAF) és CD46 (MCP). Mindkét fehérje a sejtek

többségén megtalálható.

16

4. ábra A komplementrendszer aktivációja során a komponensek kaszkádszerűen

hasítják egymást és különleges funkciókkal rendelkező fragmentumok szabadulnak fel

(Walport, 2001).

17

3.2 Komplement fehérjék bioszintéziseA komplement fehérjék legtöbbje egy polipeptid láncból áll. Több komplement

komponens, mint például a C3, C4 és C5 egy polipeptid láncban szintetizálódik, és alakul a

processzálás során több láncúvá (Campbell és mtsai, 1988). Mindközül legbonyolultabb a

C1q bioszintézise, amely 3 géntermék 6-6 kópiájából épül fel. Emiatt a fehérje rekombináns

úton történő előállítása és kötőhelyeinek tanulmányozása mutációk létrehozásával rendkívüli

mértékben nehezített.

A vérben található oldható komplement fehérjék szintézise a D-faktor kivételével elsősorban a

máj parenchyma sejtjeiben történik. Hepatociták termelik a szérum komplement 90%-át, de a

monocita/makrofág rendszer sejtjei is sokféle komplement fehérjét szintetizálnak. A bazális

szintézis a májjal összehasonlítva alacsony, de indukció hatására a komplement fehérjék

termelése akár egy nagyságrenddel is emelkedhet. Különösen fontos lehet ez szöveti sérülés

esetén kialakuló gyulladásos reakcióban (Ezekovitz és mtsai, 1984). Az epitél és endotél

sejteken jelentős a komplement szabályozó membránfehérjék szintézise (van den Berg és

mtsai, 1998). Az immunrendszer működése szempontjából kiemelkedő jelentőségűek a fago-

citák, limfociták és az érfalak endotél sejtjeinek felszínén található komplement receptorok

(Erdei, 1990; Prechl & Erdei, 2000).

A központi idegrendszerben mind neuronokban, mind glia sejtekben bizonyították

komplement gének expresszióját. Asztrocita sejtek a hepatocitákhoz hasonlóan sokféle

komplement fehérjét termelnek (Gasque és mtsai, 1985; Walker és mtsai, 1998). Mikroglia

sejtek több, fagocitózissal összefüggő komplement receptorral rendelkeznek (Walker és mtsai,

1995).

3.3 A komplementrendszer aktivációja betegségekbenA nem szabályozott és elhúzódó komplement aktiváció szerepet játszik számos emberi

megbetegedés kialakulásában. Ezek közül az autoimmun betegségek mellett a legfontosabbak

a miocardialis infarktus, a politrauma, a szepszis, valamint a központi idegrendszer

demielinizációs (sclerosis multiplex), ischaemiás-perfúziós (stroke) és degeneratív

(Alzheimer kór) megbetegedései. A klasszikus útvonal aktivációját figyelték meg antitestek

kimutatható jelenléte nélkül akut szívizom infarktus és Alzheimer kór esetében is (McGeer &

McGeer, 1998).

18

3.4 A komplement aktiváció szerepe az Alzheimer kór kialakulásában3.4.1 Az Alzheimer kór

Az Alzheimer kór egy életkor-függő neurodegeneratív betegség, amely az időskori

demenciák leggyakoribb formája. A betegség klasszikus klinikai tünetei közé tartoznak az

amnéziás típusú memória zavarok, a beszéd romlása, a térlátás csökkenése, majd később a

motoros és szenzoros zavarok, a járás és testtartás megváltozása és az agyvérzés. A betegség

során magatartás zavarok is jelentkeznek.

A kór patológiájának három jellemzője az amiloid -peptid (A felhalmozódása extracellu-

láris szenilis amiloid plakkokban, az idegsejtekben található finom rostrendszer összeguban-

colódása a tau abnormális foszforilációja következtében (neurofibrillary tangles, NFT), és az

agykéreg neuronjainak pusztulása. Az amiloid plakkok fő alkotói, a 39-43 aminosav hosszú-

ságú A peptidek az amiloid prekurzor proteinből (APP) keletkeznek (Glenner & Wong,

1984; Masters és mtsai, 1985). Az A keletkezése és lerakódása oki kapcsolatba hozható a

betegség kialakulásával, amit az alábbi megfigyelések támasztanak alá. Az Alzheimer kór

korai megjelenésű típusában szenvedő betegek APP génjében (16. és 17. exon) több mutációt

azonosítottak (Goate és mtsai, 1991). Down kóros betegekben az Alzheimer kór neuropatoló-

giai jellemzői 40 éves korig csaknem mindig kialakulnak (Wisniewski és mtsai, 1985).

Számos in vitro kísérlet igazolta, hogy az A neurotoxikus és sejtpusztulást okoz. APP túlter-

melő transzgenikus egérben a betegségre jellemző amiloid plakkok alakulnak ki. Ezekben az

egerekben tanulási és memória zavarok jelentkezhetnek. Az ApoE e4 genotípus az Alzheimer

kór egyik fő rizikó-faktora és korai amiloid lerakódáshoz vezet (Roses, 1996). A fenti megfi-

gyelések bizonyították, hogy az A központi szerepet játszik az Alzheimer kór kialakulásában

(Cummings, 2004).

3.4.2 Alzheimer kórban kialakuló krónikus gyulladás

A kórra jellemző három patológiai vonás mellett a betegek agyában mindig megfigyel-

hetőek a gyulladásos folyamatok és a veleszületett immunválasz következményei (Akiyama

és mtsai, 2000; Wyss-Coray & Mucke, 2002). A gyulladásos folyamatok káros következmé-

nyeire először egy epidemiológiai vizsgálat derített fényt, amelyben arthritises betegek között

az Alzheimer kór alacsonyabb előfordulását figyelték meg. Mivel a legtöbb arthritises beteg

nem-szteroid gyulladáscsökkentőt használt, azt a következtetést vonták le, hogy ezek a

gyógyszerek csökkentik az Alzheimer kór kockázatát (McGeer és mtsai, 1990). Későbbi vizs-

gálatok szerint a gyulladáscsökkentőt használók agyában háromszor kevesebb aktivált mikro-

glia volt, mint az egészséges, gyógyszert nem szedők esetében (Mackenzie & Munoz, 1998).

19

Ez arra utalt, hogy a nem-szteroid gyulladáscsökkentők gátolták a mikroglia aktivációt.

Említésre méltó, hogy a gyulladáscsökkentőt használó arthritises betegek esetében nem

változott az amiloid plakkok száma. A nem-szteroid gyulladáscsökkentők hatását a kór

állatmodelljeiben is vizsgálták. Az első ilyen tanulmányban APP transzgenikus egerek

ibuprofen kezelése csökkentette az amiloid plakkok számát, a mikroglia aktivációt a plakkok

közelében, és az IL-1 túlsúlyt (Lim és mtsai, 2000).

A gyulladás kimutatása a betegség kialakulása előtt, vagy a kór korai szakaszában bizonyít-

hatná a gyulladás oki szerepét. Emellett az is valószínű, hogy a gyulladás kedvező immun-

folyamatokat is beindít, amelyek késleltetik a betegség progresszióját. Ezért a nem-szelektív

gyulladásgátlás nem tűnik célszerű terápiának. Valószínű, hogy a gyulladás (és vele együtt a

kedvező immunfolyamatok) genetikai polimorfizmusokhoz köthető, vagy epigenetikai

tényezők, mint más betegségek (fertőzés, sérülés) vagy gyógyszer használat is szabályozzák.

5. ábra Gyulladás és nem-szteroid gyulladásgátlók lehetséges szerepe az Alzheimer

kór patogenezisében. A krónikus gyulladás valószínűleg hozzájárul a betegség kialakulásához

(↓↑). Ezzel szemben, a kedvező immunreakciók, mint például a fagocitózis lassíthatják a

betegség progresszióját (gátló nyilak). A gyulladáscsökkentők meggátolják vagy lassítják a

kór progresszióját, vagy csökkentik a krónikus gyulladást (gátló nyilak).

Az Alzheimer kór egér modelljeiben központi idegrendszeri gyulladást, többek között glia

sejtek aktivációját, citokinek és komplement fehérjék megemelkedett szintézisét mutatták ki

(Morgan és mtsai, 2005). A komplement kulcsszerepet játszik a gyulladásos folyamatok

iniciálásában, ezért szerepének vizsgálata az Alzheimer kutatások homlokterébe került.

Krónikus gyulladás

Alzheimer kór patogenezis

Kedvező immunreakciók

Genetikai tényezőkEpigenetikai faktorok

NSAID

20

3.4.3 A komplement szerepe az Alzheimer kór patogenezisében

Alzheimer kórban elhunyt betegek agyában a komplement kaszkád fehérjéi megtalál-

hatóak a szenilis plakkok amiloid lerakódásaiban (Eikelenboom & Stam, 1982; McGeer és

mtsai, 1989). A C1q normál körülmények csak nehezen mutatható ki az agyban, de Alzheimer

kór korai stádiumában megjelenik a plakkok környezetében (Zanjani és mtsai, 2005). A

betegség progressziójával a C1q a hippokampuszban idegsejteken és aktivált glia sejteken is

kimutatható (Afagh és mtsai, 1996). A betegségben leginkább érintett kérgi területeken a C1q

koncentrációja legalább egy nagyságrenddel megnő (Yasojima és mtsai, 1999). A klasszikus

reakcióút aktivációját bizonyítják azok a megfigyelések, amelyek a klasszikus út fehérjéinek

aktivációs fragmentumait mutatták ki szenilis plakkokban, pusztuló idegsejt nyúlványokon és

az idegsejtek összegubancolódott finom rostrendszerén. Ugyanakkor az alternatív reakcióút

B-faktora nem volt kimutatható (McGeer és mtsai, 1989; Brachova és mtsai, 1993).

Az érintett agyterületeken kimutatták a membránkárosító komplex jelenlétét is. A komplex

kialakulása azt mutatja, hogy a komplementrendszert szabályozó mechanizmusok képtelenek

voltak megállítani az aktivációt. A léziók helyén kimutatták komplement regulátor fehérjék

jelenlétét is. Ez további bizonyíték a komplementrendszer aktivációjára a sérülések helyén,

továbbá arra utal, hogy a szabályozásért felelős fehérjék csak kismértékben voltak képesek

ellenőrzésük alatt tartani a komplement aktivációt (Yang és mtsai, 2000).

Láttuk, hogy a három komplement reakcióút bármelyikének aktivációja fontos része a sérülés,

szöveti törmelék vagy mikroorganizmusok eltávolítását kísérő gyulladásos folyamatoknak.

Ugyanakkor, a nem megfelelően szabályozott krónikus komplement aktiváció károsíthatja a

saját szöveteket, különösen ott, ahol a sejtek alacsony szinten expresszálnak membránkötött

komplement gátló fehérjéket. Ez magyarázza, hogy noha a komplement aktivációja nem

közvetlen oka sok kórkép kialakulásának, de közvetlen szerepet játszik szöveti sérülések

kialakulásában.

A betegség kialakulásában kulcsszerepet játszó A peptidről in vitro kimutatták, hogy köt a

C1q molekulához, ami a klasszikus út aktivációját eredményezi (Rogers és mtsai, 1992). A

klasszikus út jelentőségét támasztja alá az a megfigyelés, hogy az A aktiválja az alegységei-

ből rekonstituált C1 komplexet (Tacnet-Delorme és mtsai, 1991). Az A ugyanakkor C3

kötésen keresztül aktiválja a komplement alternatív útját is (Bradt és mtsai, 1998). Ezek az in

vitro megfigyelések azt sugallják, hogy az Alzheimer kórban megfigyelhető antitest-független

komplement aktivációért az A felelős (Rogers és mtsai, 1992; McGeer & McGeer, 1998).

3.4.4 A komplement aktiváció szerepe a betegség állatmodelljeiben

21

Két évtized telt el azóta, hogy felmerült a gyanú a komplementrendszer érintettségére

az Alzheimer kór patomechanizmusában (McGeer és mtsai, 1989). Ezzel összhangban voltak

azok a megfigyelések, amelyek arra utaltak, hogy az A peptid antitestek távollétében

aktiválja a komplement klasszikus reakcióútját in vitro (Rogers és mtsai, 1992). Mindazon-

által, a komplement hozzájárulása az Alzheimer kórban tapasztalható neuronpusztuláshoz

szelektív komplement gátlók hiányában nehezen bizonyítható. Több egér modellt is létrehoz-

tak, amelyek az Alzheimer kórra jellemző neuropatológiai és magatartásváltozásokat mutat-

ják. A Tg(HuAPP605.K670N-M671L)2576 egérben korfüggő amiloid lerakódást, mikroglia

és asztroglia aktivációt és pusztuló nyúlványokat mutattak ki (Hsiao és mtsai, 1996).

A dupla transzgén APPPS1 (Tg2576 és mutáns presenilin 1 (PS1) keresztezése) egérben

hamarabb keletkezik több A lerakódás, a plakkok környezetében aktivált glia sejtek és

komplement fehérjék találhatóak (Matsuoka és mtsai, 2001). Az Alzheimer kór eme két

általánosan használt egér modelljében C1q hiányt állítottak elő C1qKO (C1q-/-) egérrel való

keresztezéssel (Botto és mtsai, 1998). Az előállított egerekben a C1q hiánya (APPQ-/- és

APPPS1Q-/-) jelentősen csökkentette a Tg276 (APP) és az APP/PS1 egerekben tapasztalható

mikroglia és asztroglia aktiváció mértékét és a neuronpusztulást (Fonseca és mtsai, 2004).

Ezek az eredmények megerősítették azt az elképzelést, hogy az A által kiváltott C1

aktiváció, és a felszabaduló komplement anafilatoxinok központi szerepet játszanak a glia

sejtek toborzásában. Továbbá az eredmények bizonyítják, hogy a C1q kötése A peptidhez

gyulladásos reakciókat indít be a plakkok környezetében, amelyek idegsejtek funkcionális

zavaraihoz majd pusztulásához vezetnek (McGeer & McGeer, 1998).

A PS1 és PS2 gének mutációja a familiáris Alzheimer kór leggyakoribb oka. Kondícionális,

dupla KO egeret hoztak létre, amelyben mindkét PS hiányzik születés után az előagy

glutamáterg neuronjaiban (Saura és mtsai, 2004). A PScDKO egérben memória csökkenést, a

szinaptikus plaszticitás sérülését és az agykéreg neuronjainak pusztulását figyelték meg. Az

agykéregben végzett microarray vizsgálatok több gyulladásos gén, köztük a C1q expresszió-

jának jelentős emelkedését mutatták ki. Komplement aktivációra utaló aktivációs termékeket

mutattak ki a hippokampuszban (Beglopoulos és mtsai, 2004).

Az eredményekből kitűnik, hogy az Alzheimer kórban fontos szerepet játszó génmutációk

állatmodellekben kimutathatóan komplement aktivációt, mikroglia és asztroglia aktivációt és

neuronpusztulást eredményeznek.

22

4 Célkitűzések

Kutatásaim a komplementrendszer központi idegrendszerben bekövetkező aktivációjának és

következményeinek felderítésére irányultak. Munkám során az alábbi feladatokat és kérdések

vizsgálatát tűztük ki:

1. Ismert, hogy az amiloid -peptid aktiválja a komplementrendszert in vitro. Az

aktiváció funkcionális hatásainak vizsgálatára egy in vitro sejtalapú rendszer

kidolgozását tűztük ki.

2. Az amiloid -peptid által kiváltott komplement aktivációhoz irodalmi adatok alapján

mind a klasszikus, mind az alternatív út hozzájárul. Nem jelent meg azonban

összefoglaló vizsgálat arról, hogy melyik útvonal játsza a főszerepet az aktiváció

során. Ezt a kérdést egy endogén komplement inhibítor, a C1-Inh hatásának

vizsgálatával kívántuk tanulmányozni.

3. A központi idegrendszerben található komplement komponensek nagyrészét az agy

szöveti makrofágja, a mikroglia termeli. Különböző komplement gének kifejeződését

vizsgáltuk kezeletlen és lipopoliszachariddal kezelt mikroglia sejtekben in vitro.

4. Mára egyetértés alakult ki abban, hogy az amiloid -peptid oki szerepet játszik az

Alzheimer kór kialakulásában. Vizsgálni kívántuk, hogy a peptid befolyásolja-e korai

komplement gének átíródását mikroglia sejtekben in vitro.

5. Az aktivációért felelős útvonal és a mikrogliális expresszió ismeretében egy

farmakológiai beavatkozásra alkalmas támadáspontot kell kiválasztanunk, amelynek

révén szelektíven gátolható a komplement aktiváció.

6. A szakirodalomban kevés komplement inhibítort írtak le, klinikán pedig nincs

szelektív, kis molekulatömegű komplementgátló. Ezért célul tűztük ki ismert

vegyületek tanulmányozását a kiválasztott támadáspontú vegyület funkciójára.

7. A Társaság tulajdonában levő vegyülettár mérete és szerkezeti diverzitása révén

alkalmas lehet új kémiai szerkezetek azonosítására. Egy nagy áteresztőképességű

módszer beállítása és validálása után célul tűztük ki a vegyülettár szűrését, és kémiai

optimalizálás után vezérmolekula kiválasztását.

8. A kiválasztott vegyületet hatékonyságának és szelektivitásának vizsgálata.

9. A vezérmolekula egy molekula részlethez kötődve fejti ki a hatását. Tanulmányozni

kívánjuk, hogy a vegyület melyik, a kölcsönhatásban résztvevő fehérje molekulához

köt.

23

10. A vezérmolekula szelektíven gátolja a komplement aktiváció valamelyik lépését. In

vitro sejtalapú tesztben vizsgálni kívánjuk, hogy a molekula felfüggeszti-e a

komplement toxikus hatását az idegsejtekre.

24

5 Anyagok és módszerek

5.1 Sejttenyészetek és jellemzésük

Primer egér mikroglia tenyészeteket újszülött NMRI egerek agyából készítettünk egy

általánosan használt módszert (Suzumura és mtsai, 1987) követve. Az agyakat kivettük a

koponyából és D-oldatban (90 ml PBS pufferben oldunk 99 mg glükózt, 2,017 g szacharózt,

plussz 0,2 ml antibiotic antimycotic solution (Sigma), pH5,5) felszuszpendáltuk. Tripszines

kezelést (2 ml tripszin-EDTA, 37oC, 5 perc) követően DNase oldatot (8 mg DNase I / 50 ml

D-oldat) adtunk a sejtekhez, és 5 percig inkubáltuk 37oC-on. A szuszpenziót 30 ml-re egészí-

tettük DMEM (1,2 g/l NaHCO3 és 1,5 g/l glükóz tartalmú DMEM, pH7,2) tápfolyadékkal,

majd a sejteket lecentrifugáltuk. A sejteket 5 ml 10% FCS-DMEM oldatban felszuszpendál-

tuk, és szűréssel tovább homogenizáltuk. A sejtszuszpenziót tápfolyadékot tartalmazó 75 cm2

szövettenyésztő edényekbe tettük. Egy hét múlva a médiumot lecseréltük. Ezzel a módszerrel

10 nap után konfluens kultúrákat kaptunk. A kevert glia kultúrából a mikroglia sejteket

gyengébb adhéziós tulajdonságuk alapján választottuk el. A benőtt edényeket rázóasztalon

rázattuk 125 rpm mellett 2 órát. A mikroglia tartalmú tápfolyadékot összegyűjtöttük, és a

visszamaradt asztrogliára friss tápfolyadékot adtunk. A mikroglia sejteket lecentrifugáltuk,

majd 5 ml kondícionált médiumban felszuszpendáltuk. A sejtszám meghatározása után a

mikrogliát megfelelő tenyésztő edénybe tettük (kezelésekhez a sejteket általában 24 kamrás

műanyag edényekben tenyésztettük). Kitapadás után a sejteket kondícionált médiummal

mostuk, és szérummentes DMEM/ITS tápfolyadékban tenyésztettük. CD18 festés alapján a

sejtek több mint 95%-át találtuk mikrogliának.

Primer patkány hippokampális sejttenyészeteket újszülött Wistar patkányok agyából

készítettünk egy korábban kidolgozott eljárás alapján (Nagy & László, 2002). A sejteket

komplement toxicitás vizsgálatokra 6, míg RT-PCR vizsgálatokra 24 kamrás műanyag

edényekben tenyésztettük.

25

5.2 RNS izolálás, fordított (reverz) transzkripció

A sejteket kezelés után PBS-sel mostuk, majd totál RNS-t izoláltunk a Stratagene RNS izoláló

kitjével a gyártó által javasolt recept alapján. A minták integritását agaróz gélben vizsgáltuk

etidium-bromid festést követően. Az RNS koncentrációkat 260nm-en mért abszorpcióval

határoztuk meg. Azonos mennyiségű RNS mintákat fordítottunk át cDNS-sé RNáz inhibítor

jelenlétében MuLV reverz transzkriptáz (Stratagene) enzimmel. A reakciót 37 oC-on 60 percig

végeztük, majd 90 oC-ra történő melegítéssel állítottuk le.

5.3 Polimeráz láncreakció (PCR)

A polimeráz láncreakciót 50l térfogatban, 10mM Tris-HCl pH8,3 pufferben 50mM KCl,

0,2mM dNTP, 1,5mM MgCl2, 1mM primer és 1 egység Tag DNS polimeráz (Stratagene)

jelenlétében végeztük Hybaid Thermocycler készülékben. A reakciót általánosan használt

paraméterekkel, 25x (94oC 30 másodperc, 60oC 30 másodperc, 72oC 1 perc) futtatva egy 10

perces extenziós idő után fejeztük be. A tervezett komplement oligonukleotid primereket az

IDT cégtől vásároltuk. A vizsgált komplement komponens mellett a -aktint is minden

esetben koamplifikáltuk. A PCR termékeket 2% agaróz gélen elektroforézissel szétválasz-

tottuk, majd etidium-bromiddal festettük. A PCR termékeknek megfelelő sávok intenzitását

Grab It 2.35 és Gel Works képanalizáló szoftverek (UVP) segítségével határoztuk meg. A

komplement mRNS szinteket a -aktin mRNS szintjével normalizáltuk. A komplement

expresszió vizsgálatára tervezett primerek a következők voltak:

C1q A lánc, up 5’-TGCCGAGCACCCAACGGGAAGGATGG-3’

C1q A lánc, down 5’-CACTTGGAAGTTGAAGTAATAGAAGC-3’

C1q B lánc, up 5’-TCCCTGGGGTTCCTGGCTCTGATGG-3’

C1q B lánc, down 5’-CAGTGAAGATGCTGTTGGCACCCTC-3’

C3, up 5’-GGCATCTTGCCTTTGTCTTGGAAC-3’

C3, down 5’-GACAGAGACGTACAGGGACTTCCCCAC-3’

CR3 (CD18) lánc, up 5’-TGTCATGGCTTCAATCTGGACACTGAA-3’

CR3 (CD18) lánc, down 5’-AAGCTGGACCACATTCTGTCCAAAGCC-3’

26

CR3 (CD18) lánc, up 5’-TGGTGCCAGAAGCTGAACTTCAC-3’

CR3 (CD18) lánc, down 5’-TCGTCTGTGGCAAACACCAGCAGCC-3’

C5, up 5’-CCAGTCTCTCACGTGTATCTGGAAG-3’

C5, down 5’-CAGCTCTTTAACTGCTGTTTCAGAATC-3’

C5aR (CD88), up 5’-CTGGCGGTGGCCGACCTCCTCTCGTGC-3’

C5aR (CD88), down 5’-GGAGCAGGAGGAAGGTGTAGCAGATG-3’

5.4 Szilárd fázisú kötési vizsgálat

A mikrotiter lemezek borítását és a C1q kötést egy közölt leírás módosítása alapján

végeztük (Jiang és mtsai, 1994). Röviden, az amiloid- peptideket DMSO-ban oldottuk és

készítettünk törzsoldatokat. A törzsoldatokat -20oC-on tároltuk. A peptidet csak közvetlenül

használat előtt hígítottuk vizes pufferben. Maxisorp (Nunc) mikrotiter lemezeket borítottunk

10 g/ml amiloid- oldattal 0,1mM Tris pH 8,5 pufferben100 l/kamra térfogatban 16 órát

4 oC-on. 0,05% Tween20 –tartalmú PBS-es mosás után a lemezt 30 percet blokkoltuk PBS-

ben oldott 3% BSA-val. A C1q kötést szobahőmérsékleten végeztük 60 percig a jelzett

koncentrációban. A lemezt háromszor mostuk (3 x 10 perc), majd a kötött C1q mennyiségét

standard ELISA módszerrel határoztuk meg. A C1q-t anti-humán C1q antitesttel reagáltattuk,

majd biotin-jelzett második antitestet, és Extravidin-HRPO-t (Sigma) használtunk. Az enzim

mennyiségét TMB szubsztrát hasítása alapján határoztuk meg. A mérést TecanSpectra

fotométeren végeztük 450 nm-en.

Az antitest-C1q kötési vizsgálatban a lemezt 10 mg/ml ovalbuminnal borítottuk 4 oC-on. Az

antigén fölösleg eltávolítása után immunkomplexet képeztünk anti-ovalbumin 1:400 hígítású

oldatával. A C1q kötést és és mennyiségi meghatározást a fent leírtak szerint végeztük.

A komplement C1q fehérjét a Calbiochem és a Quidel cégektől szereztük be. Az A peptide-

ket a Bachemtől, a SAP és CRP fehérjéket a Calbiochemtől vásároltuk. A komplement fehér-

jék ellen termelt primer antitestek Calbiochem, Serotec vagy Quidel termékek voltak.

A farmakológiailag aktív vegyületek RBI könyvtára a Sigma által forgalmazott termék.

27

5.5 Komplement toxicitási teszt

A komplement-függő A toxicitás mérést egy közölt módszert módosítva végeztük

(Schultz és mtsai, 1994). Röviden, egy héttel lemezelés után a hippokampális sejtek morfoló-

giáját ellenőriztük. Ahol nagyobb méretű fagocitózist, vagy fejletlen nyúlványokat láttunk,

azokat a lemezeket nem használtuk a továbbiakban. Kezelések előtt a tápfolyadékot szérum-

mentes N2 médiumra cseréltük. Komplement aktivátorként A1-40 peptidet, kontrollként a

fordított A40-1 peptidet használtuk. A peptideket használat előtt DMSO-ban oldottuk, majd

tápfolyadékban hígítottuk a kívánt koncentrációra (0,8 mM). Friss, normál humán szérumot

használtunk komplement forrásként. 25l A törzsoldat és 15l normál humán szérum került

minden kamrába, ami 40M A és 3% szérum koncentrációt eredményezett. A toxicitást a

tápfolyadékban mérhető LDH aktivitás alapján határoztuk meg Cytotoxicity Detection kittel

(Roche Diagnostics).

5.6 Tömegspektrometria

A tömegspektrumokat Finnigan MAT 95SQ tandem spektrométeren elektrospray

ionizációs forrást használva vettük fel (Skribanek és mtsai, 2001). A vizsgálatban N2 védő-

gázt használtunk, 3kV spray feszültség és 70V feszültség mellett. Az anyagok oldására 2mM

CH3CO2NH4 – 0,5% ecetsav (v/v) 1:1 elegyét használtuk. 20 l mintát injektáltunk az eluens

áramba, áramlási sebesség 50 l.

28

6. Eredmények6.1 Komplement aktiváció citotoxikus hatásának kimutatása in vitro

Az A1-40 peptid aktiválja a komplementrendszert in vitro (Rogers és mtsai, 1992).

Az aktiváció sejtszintű következményeiről kevés adat állt rendelkezésre, ezért az aktiváció

hatását tanulmányoztuk patkány újszülött hippokampális sejteken. Irodalmi adatokkal

összhangban megállapítottuk, hogy az A1-40 peptid és a normál humán szérum önmagában

nem okozott sejtpusztulást (Schultz és mtsai, 1994). A komplement forrás (humán szérum) és

a komplement aktivátor (A1-40) együtt azonban növekvő, 5 nap után 30% citotoxicitást

eredményezett, amit LDH felszabadulás alapján határoztunk meg (Sárvári és mtsai, 2003).

Különösen a neuronok érzékenyek komplement lízisre, mivel primer glia sejteken a fenti

kezelés nem okozott sejtpusztulást (Sárvári és mtsai, 2003).

0

5

10

15

20

25

30

35

1 2 3 4 5

Napok

Cito

toxi

citá

s (%

)

6. ábra Komplement citotoxikus hatása patkány hippokampális sejteken. A kezelések-

hez csak ép, differenciálódott idegsejteket tartalmazó kultúrákat használtunk. A sejteket

40M A1-40 peptiddel kezelve 3% normál humán szérum jelenlétében (fekete háromszög)

magasabb citotoxicitást tapasztaltunk, mint csak a peptiddel (fehér háromszög) kezelve.

Ugyanebben a koncentrációban a fordított A40-1 peptiddel szérum jelenlétében (fekete

négyzet) vagy távollétében (fehér négyzet) sem tapasztaltunk sejtpusztulást. A kezelés hatását

az 5. napig követtük. A toxicitást a médiumban mért LDH aktivitás alapján határoztuk meg. A

pontok három független mérés átlagai, a mérést az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak

szerint végeztük.

29

6.2 C1-Inh hatása a citotoxicitásraMiután megerősítettük az A1-40 indukálta komplement citotoxikus hatását hippo-

kampális sejteken, a klasszikus úton történő aktiváció hozzájárulását vizsgáltuk a beállított

módszerrel. A C1r és C1s alegységek egyetlen szabályozó molekulája a C1-Inh. A klasszikus

út endogén regulátorának védő hatását vizsgáltuk A1-40 peptiddel és normál szérummal

kezelt primer patkány hippokampális sejteken. Megállapítottuk, hogy 0,1 egység C1-Inh közel

50%-kal, tehát 15%-ra, míg 0,5 egység közel 90%-kal, tehát 3%-ra csökkentette az A1-40

által kiváltott komplement toxicitást (Sárvári és mtsai, 2003). A maradék toxicitás valószínű-

leg az alternatív út hozzájárulása lehetett. Az eredmény azt mutatta, hogy a választott modell-

ben az A túlnyomórészt a klasszikus reakcióúton keresztül aktiválta a komplementrendszert.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

C1-Inhibitor (egység)

Véde

lem

(%)

7. ábra A C1-Inh, a klasszikus út C1r és C1s proteázainak endogén inhibítora védelmet

nyújtott az A peptid indukálta komplement aktiváció által kiváltott neurotoxicitással

szemben hippokampális sejteken in vitro. A sejteket 3% normál humán szérum jelenlétében

40M A1-40 peptiddel kezeltük, és a C1-Inh védő hatását LDH felszabadulás méréssel

követtük az 5. napon. A pontok három független mérés átlagai.

Alzheimer kórban nem tapasztalták a vér monocita/makrofág sejtjeinek infiltrációját, ezért

mikroglia sejtekben, az agy szöveti makrofágjaiban vizsgáltuk komplement komponensek,

köztük a C1q expresszióját.

30

6.3 Komplement gének expressziója mikroglia sejtekben6.3.1 Komplement gének transzkripciója mikroglia sejtekben

A központi idegrendszer immunológiája, a neuroimmunológia az utóbbi évtizedben

önálló tudományággá vált. A kutatások rávilágítottak, hogy az agyban a mikroglia monitoroz-

za a szövet állapotát, és távolítja el az elpusztult sejteket, a szöveti törmeléket vagy fehérje

aggregátumokat. A mikroglia, mint szöveti makrofág vélhetően termel komplement fehérjéket

és rendelkezik komplement receptorokkal, amelyek érzékelik a komplement aktiváció során

keletkező komplement fragmentumokat. Munkám során először komplement gének kifejező-

dését tanulmányoztam mikroglia sejteken in vitro.

8. ábra Komplement gének expressziója kezeletlen mikroglia sejtekben. A vizsgálat-

ban a következő komplement gének átíródását vizsgáltuk: C1q A lánc (1), C1q B lánc (2),

cC1qR (3), C3 (4), CR3 lánc (5), CR3 lánc (6), C5 (7), C5aR (8). A primerek szekvenci-

ája alapján a várt fragmentum méretek a következők: C1q A lánc 419 bp, C1q B lánc 608 bp,

C1qR 377 bp, C3 425 bp, CR3 lánc 84 bp, CR3 lánc 662 bp, C5 638 bp, C5aR 453 bp. A

kép bal szélén látható a 100 bp létra (marker), a belső kontrollként használt aktint (500 bp)

nyíllal jelöltem.

A kísérlet eredményéből kiderült, hogy mikroglia sejtekben több komplement receptor,

többek között a cC1qR, CR3 és C5aR génje átíródott (Sárvári és Pázmány, nem közölt

eredmény). Ez azt jelenti, hogy az aktiváció hatására bekövetkező opszonizáció segíti az

eltávolítandó anyag mikroglia általi fagocitózisát, és a felszabaduló C5a fragmentum az

aktiváció helyére toborozza a C5aR- pozitív mikroglia sejteket. Említésre méltó, hogy a

klasszikus reakcióút felismerő fehérjéje, a C1q (és alacsonyabb mértékben a rendszer

központi molekulája, a C3) mikroglia sejtekben folyamatosan termelődött.

1 2 3 4 5 6 7 8

aktin

31

6.3.2 Mikroglia sejtekben történő komplement génkifejeződés változása gyulladásos

stimulus hatására

A központi idegrendszerben lejátszódó gyulladási folyamatokban jelentős szerepet

játszanak a mikroglia sejtek. Láttuk, hogy nyugvó mikroglia sejtekben folyamatosan átíród-

nak a komplement fehérjéket és receptoraikat kódoló gének (8. ábra). Bakteriális lipopoli-

szacharid (LPS), egy erős gyulladásos stimulus hatását vizsgáltuk komplement gének

átíródására mikroglia sejtekben.

A

B

9. ábra Komplement gének és receptoraik transzkripciójának változása primer

mikroglia sejtekben LPS indukció hatására. Primer egér mikroglia sejteket raktunk ki 6

kamrás szövettenyésztő lemezre, majd LPS kezelés után 0, 2, 4 és 24 órával a sejtekből RNS-t

izoláltunk, amit fordított (reverz) transzkripcióval cDNS-re írtunk át. Az izolált cDNS

szolgált templátul a PCR reakciókban. (A) C5 (1), C5aR (2), cC1qR (3), C1q A lánc (4) és B

lánc (5) gének átíródásának vizsgáltuk LPS indukciót követően. A keletkező fragmentumok

mérete sorrendben: C5 638 bp, C5aR 453 bp, cC1qR 377 bp, C1qA 419 bp, C1qB 608 bp. A

belső kontrollként használt aktint (500 bp) nyíllal jelöltük. (B) C3 (1), CR3 lánc (2) és

lánc (3), clusterin (4), C9 (5) és perforin (6) expresszióját vizsgáltuk mikroglia sejtekben 0, 2,

4 és 24 órával LPS kezelés után. A reakció során keletkező fragmentumok hossza sorrendben:

C3 425 bp, CR3 84 bp, CR3 662 bp, clusterin 243 bp, C9 596 bp, perforin 703 bp. Az aktin

belső kontrollt (500bp) nyíllal jelöltük.

1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5

0 óra 2 óra 4 óra 24 óra

aktin

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

0 óra 2 óra 4 óra 24 óra

aktin

32

A két kísérlet eredménye azt mutatta, hogy a komplement receptor gének (C1qR, CR3, C5aR)

kifejeződése LPS kezelés után 2 órával jelentősen emelkedett. Ugyancsak jelentősen emelke-

dett a komplement központi komponensének, a C3 génjének kifejeződése kezelés után 2

órával. A receptorok és a C3 esetében is bekövetkező gyors transzkripciónövekedés a kezelés

után 24 óráig megfigyelhető volt. Egy szabályozó fehérje, a clusterin génjének transzkripció-

ját is vizsgáltuk (9B. ábrán a 4. sáv). Megállapítottuk, hogy nyugvó mikroglia sejtekben nem

termelődött clusterin, de LPS kezelés hatására 2 óra múlva a gén transzkripciója jelentősen

emelkedett (Sárvári és Pázmány, nem közölt eredmény). Ezek az eredmények irodalmi

adatokkal összhangban arra utalnak, hogy a mikroglia sejteken megtalálható az LPS kötésért

felelős TLR4 (Olson & Miller, 2004). Említésre méltó, hogy a C1q láncait kódoló gének

expressziója nem emelkedett számottevően. Összefoglalva, gyulladásos stimulus hatására a

mikroglia sejtekben a génexpressziós változások a jellegzetes makrofág funkciók, a migráció

és a fagocitózis támogatását szolgálják. Emellett a mikroglia komplement fehérjék növekvő

szintézisével hozzájárul a komplement aktiváció fenntartásához is.

A C1q alegység expresszióját mikroglia sejtekben fehérje szinten immunhisztokémia

módszerrel vizsgáltuk (10. ábra). Egér mikroglia sejteket fixálás után C1q antitesttel

inkubáltuk, és fluoreszcensen jelzett második antitesttel jelölve megállapítottuk, hogy

mikroglia sejtekben konstitutív C1q szintézis folyt. Tehát RNS és fehérje szinten is kimutat-

tuk, hogy az agy szöveti makrofágjai nyugvó állapotban is jelentős mennyiségű C1q fehérjét

termeltek (Sárvári és Pázmány, nem közölt eredmény).

10. ábra Mikroglia sejtekben folyó C1q szintézis immunhisztokémiai vizsgálata. Egér

mikroglia sejteket növesztettünk 6 lyukú műanyag lemezen, majd 4% PFA fixálás után humán

C1q ellen termelt nyúl antitesttel próbáltuk egy éjszakán át 4oC-on. Második antitestként

fluoreszcensen jelzett anti-nyúl IgG-t használtunk.

33

6.3.3 A peptid hatása C1q és C1-Inh gének átíródására

Eredményeink arra utaltak, hogy a C1q állandóan termelődik mikroglia sejtekben.

Mivel a mikroglia sejtek felszínén jelen van a C1qR, ezért a C1q fehérje kötését pusztuló

sejtekhez, sejttörmelékhez vagy fehérje aggregátumokhoz a mikroglia sejtek képesek

érzékelni. Az a tény, hogy mind a C1q ligand, mind receptora folyamatosan termelődik

mikroglia sejtekben, arra utal, hogy a komplement klasszikus útja kiemelt szerepet játszhat az

agyszövetben történő komplement aktivációban. Ezért a következőkben a C1q és a klasszikus

út szabályozó molekulájának, a C1-Inh génjének transzkripcióját vizsgáltuk kezeletlen és A

peptiddel kezelt mikroglia sejtekben. Az interferon (IFN a komplement gének transzkrip-

ciójának egyik fontos szabályozója, ezért az IFN kezelést pozitív kontrollként használtuk.

A B

11. ábra C1q B lánc (A) és C1-Inh (B) gén transzkripciója mikroglia sejtekben.

Kezeletlen mikroglia (1), IFN (2), A (3), IFN és A (4) kezelt mikroglia. A keletkező

frag-mentumok mérete: C1q 231 bp, C1-Inh 315 bp. A belső kontrollként használt aktint (500

bp) nyíllal jelöltük.

A kísérlet eredménye azt mutatta, hogy a C1-Inh transzkript mennyisége a kimutathatóság

határán volt. A gén átíródása IFN hatására emelkedett, A peptid hatására nem volt kimutat-

ható változás. Tehát mikroglia sejtekben a C1q gén átíródásához képest alacsonyabb szintű

C1-Inh átíródás történt (Sárvári és Pázmány, nem közölt eredmény).

C1q C1-Inh

aktin

1 2 3 4 1 2 3 4

34

A következőkben A peptid hatását vizsgáltuk a mikroglia sejtekben folyó C1q transzkrip-

cióra. A peptid hatásának koncentráció függését tanulmányoztuk kezelés után 4 órával.

12. ábra A kezelésére bekövetkező C1q transzkripcióváltozás mikroglia sejtekben 4

órával kezelés után. A koncentráció-függő hatásának tanulmányozása: 0 (1), 1M (2), 2M

(3), 5M (4) 10M (5) A1-42 peptid. IFN kontroll (6). A kezelés alatt a sejtek életképes-

ségét LDH méréssel ellenőriztük, és a médiumban található LDH nem változott. Az aktinra

normált C1q értékek sorrendben: (1) 0,07 ; (2) 0,08 ; (3) 0,08 ; (4) 0,13 ; (5) 0,19 ; (6) 0,41. A

gél alatt látható diagrammon a fenti értékeket ábrázoltuk.

A kísérlet eredménye azt mutatta, hogy az A kezelés után 4 órával a C1q átíródása a peptid

koncentrációjával arányosan emelkedett. Jelentős hatás csak magas A koncentrációnál

jelentkezett, itt a C1q átíródása több mint kétszeresére emelkedett (Sárvári és Pázmány, nem

közölt eredmény).

1 2 3 4 5 6

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

0,45

1 2 3 4 5 6

C1q

/ akt

inaktin

C1q

35

Asztroglia sejtekben kimutatható a C1-Inh gén transzkript, amelynek változását követtük

IFN és A peptid kezelést követően. IFN hatására emelkedett, A peptid hatására csökkent

a C1-Inh gén átíródása.

13. ábra C1-Inh gén átíródása asztroglia sejtekben kezelés után 24 órával. Kezeletlen

kontroll (1-2), IFN (3-4) és A (5-6) kezelt asztroglia sejtek. A keletkező 315 bp C1-Inh és a

belső kontroll aktin fragmentumokat nyíllal jelöltük. A szemmel is érzékelhető változásokat

kiértékeltük UVP Grab It software segítségével. Az aktinra normált C1-Inh mennyiségek

sorrendben: (1) 0,58 ; (2) 0,51 ; (3) 0,73 ; (4) 0,75 ; (5) 0,37 ; (6) 0,36 .

A kísérletek eredményei azt mutatták, hogy A peptid hatására a C1q és a C1-Inh gén

átíródása ellentétes módon változott. A C1-Inh transzkripciójának csökkenése (és a C1q

emelkedése) maga után vonhatja az aktiváció-inhibíció egyensúlyának eltolódását, és A

jelenlétében szabályozatlanná válhat a klasszikus reakcióúton zajló aktiváció.

1 2 3 4 5 6

Aktin

C1-Inh

36

6.4 A C1q és A közötti kölcsönhatás tanulmányozása6.4.1 Humán és egér C1q kötése A1-42 peptidhez

A C1q molekulán az A kötőhely kialakításában az A láncban egy N-terminális

közeli régió játszik döntő szerepet. Az emberi és az egér C1q A lánca nagyon hasonlít

egymáshoz, de ebben az A14-26 régióban különbözik. A két fajból izolált C1q kötését

vizsgáltuk A peptidhez.

0,00

0,10

0,20

0,30

0,40

0,50

0,60

0,70

0,80

0,90

10 100 1000 10000

C1q [ng/ml]

OD

512

14. ábra Humán és egér C1q kötése A peptidhez. Szilárd-fázisú kötési vizsgálat,

humán C1q (kék), egér C1q (lila). A pontok három független mérés átlagai. A kötés erősségét

jellemző EC50 érték humán és egér C1q esetében 50 ng/ml, illetve 105 ng/ml.

A humán és egér C1q különböző erősséggel kötődik A peptidhez (Webster és mtsai, 1999).

Ezt valószínűleg a kötésben résztvevő A lánc humán 14-26 szekvenciában található 16R és

20R hiánya okozza az egér C1q A láncában. A kötés erősségének különbségét az általunk

beállított vizsgálattal ki tudtuk mutatni (Sárvári és Pázmány, nem közölt eredmény).

37

6.4.2 Az ionerősség hatása

A kölcsönhatásban valószínűleg savas illetve bázikus oldalláncok vesznek részt. Ezért

a következőkben az ionerősség hatását tanulmányoztuk.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1 10 100 1000

C1q [ng/ml]

OD

512

15. ábra A C1q és A kötés az ionerősség függvényében: 0 (folyamatos vonal, kék

négyszög), 10mM (folyamatos vonal, fehér négyszög), 50mM (szaggatott vonal, kék

háromszög) és 100mM (szaggatott vonal, fehér háromszög) NaCl. Látható, hogy az

abszorbanciával arányos kötött C1q mennyisége a növekvő NaCl koncentrációval csökken.

Más szavakkal, a kötés erőssége fordítottan arányos az ionerősséggel, ami arra utal, hogy

ionos kölcsönhatások játszanak szerepet a kötésben. Az EC50 értékek a növekvő ionerősség

sorrendjében: 50 ng/ml, 35 ng/ml, 110 ng/ml és 460 ng/ml.

A kötés ionerősség függésének kimutatásával validáltuk az általunk beállított C1q-A kötési

tesztet. A teszt alkalmas arra, hogy nagyszámú vegyület hatását vizsgáljuk és ezáltal olyan

molekulákat azonosítsunk, amelyek gátolják a C1q kötést A peptidhez.

38

6.5 C1q kötést gátló ismert vegyületek6.5.1 Glikózaminoglikánok

A heparin és más glikózaminoglikánok kötnek a C1q molekulához, és ezáltal gátolják

az immunglobulinoktól eltérő komplement aktivátorok kötését. Egy sertés méhből izolált

(Takács és mtsai, 1982) glikózaminoglikán, a GAG1 hatását vizsgáltuk a C1q-A és C1q-

SAP kötésre.

16. ábra GAG1 gátló hatása a C1q nem-immunglobulin aktivátorokhoz való kötésére.

A kísérletek eredménye azt mutatta, hogy a vizsgált állati eredetű glikózaminoglikán gátolta a

C1q és SAP kötését az A peptidhez, és csökkentette a SAP-indukálta sejtpusztulást is

(Urbányi és mtsai, 2005).

39

6.5.2 RBI vegyületkönyvtár tesztelése a kötőhelyek különbözőségének igazolására

A vizsgált RBI könyvtár 640 farmakológiailag aktív vegyületet tartalmazott, és ezeket

vizsgáltuk szilárd fázisú C1q kötési tesztekben.

3. táblázat A C1q A kötést leghatékonyabban gátló hét vegyület gátlási állandója

vegyület IC50 [M] célpont és hatás

benextramine 3 1/2 antagonista

calmidazolium 3 Ca-ATPáz inhibítor

methoctramine 2 M2 antagonista

milrinone 3 PDEIII inhibítor

NPC-15437 1 PKC inhibítor

tamoxifen 2 SERM

thioridazine 4 D1/D2 antagonista

A hét vegyület esetében közel megegyező gátlási állandókat kaptunk A, CRP és SAP

esetében is (18. ábra). Továbbá a hét vegyület közül egy sem gátolta a C1q kötést ovalbumin-

hoz kötött anti-ovalbumin IgG-hez. Az eredmény azt támasztotta alá, hogy a C1q molekulán

két különböző kötőhely van a direkt aktivátorok, mint ACRP és SAP, valamint az IgG

számára.

A B

17. ábra Három C1q kötési tesztben mért methoctramine (A) és NPC-15437 (B) gátlási

görbék: A (kék), CRP (piros), SAP (világoskék). Az IC50 értékek a három kötési

vizsgálatban nagyon hasonlóak, A esetében 2 M, illetve 1M.

40

6.6 C1q kötést gátló új szintetikus vegyületekÚj kémiai szerkezetek azonosítására a Társaság vegyülettárát vizsgáltuk a beállított

C1q-A kötési teszttel. Háromszáznyolc olyan anyagot azonosítottunk, amelyek 1M

koncentrációban 50%-nál nagyobb mértékben gátolták a C1q kötését A peptidhez. Ezek

közül a vegyületek közül 56 gátolta a C1q kötését C-reaktív proteinhez (CRP), és 35 mielin

bázikus fehérjéhez (MBP). Tökéletes átfedés volt a 35 és az 56 vegyület között (19. ábra). A

háromszáznyolc vegyület között hét olyan vegyületet találtunk, amelyek jelentős (25%-nál

nagyobb) mértékben gátolták a C1q kötését ovalbuminhoz kapcsolódott anti-ovalbumin IgG

antitestekhez. A szelektivitási vizsgálatok eredményei megerősítették azt az elképzelésünket,

hogy a C1q molekulán található IgG és direkt aktivátor (A, CRP, MBP) kötőhelyek

különbözőek.

18. ábra A kötési vizsgálattal azonosított és szelektivitási esszékkel jellemzett találatok

csoportosítása. A vegyülettár szkrínelésekor azonosított vegyületeket újramértük, majd a

megerősített találatokat szelektivitási vizsgálatokkal jellemeztük. Háromszáznyolc vegyületet

azonosítottunk, amelyek 1M koncentrációban 50%-nál nagyobb mértékben gátolták a C1q

kötését A peptidhez. Ezek közül 56 gátolta a C1q kötését CRP-hez, és 35 MBP-hez. A 308

vegyület közül 7 vegyület gátolta 25%-nál nagyobb mértékben a C1q kötését ovalbuminhoz

kapcsolódott anti-ovalbumin antitestekhez, de ezek közül egyik sem gátolta a C1q kötését más

direkt aktivátorokhoz (Sárvári, Kósa és Pázmány, nem közölt eredmény).

MBP35

CRP56

A308

IgG7

41

A leghatékonyabb szerkezeti csoport kémiai optimalizálásával egy hatékony vezérmolekulát

(lead) állítottunk elő. Először a vegyület hatékonyságát vizsgáltuk kötési tesztekben, és

megállapítottuk, hogy a vezérmolekula hatékonyan gátolta a C1q kötést A peptidhez (19.

ábra). Több nem-immunglobulin C1q aktivátor esetében is vizsgáltuk a vegyület hatását, és

megállapítottuk, hogy gátolta a C1q kötést CRP-hez és MBP-hez is (19. ábra).

0

20

40

60

80

100

120

1,E-08 1,E-07 1,E-06 1,E-05 1,E-04

c (M)

C1q

köt

és (%

)

19. ábra A vezérmolekula jellemzése kötési vizsgálatokban. A vegyület mikromoláris

koncentrációban csökkentette a C1q kötését különböző nem-immunglobulin C1q aktivátorok-

hoz, mint A (fekete kör), CRP (fehér háromszög) és MBP (fehér kör). Nem tudtunk C1q

kötést kimutatni a fordított A40-1 peptidhez (Sárvári és mtsai, 2003). A pontok hat független

mérés átlagai, a mérést az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint végeztük.

A vegyület speciális kémiai szerkezete (apoláros jellege) miatt kiemelkedő fontosságú volt a

szelektivitás kérdése. A kérdést a vegyület fehérje-fehérje kölcsönhatásokra gyakorolt hatásá-

val vizsgáltuk.

42

0

20

40

60

80

100

120

1,E-07 1,E-06 1,E-05 1,E-04 1,E-03

c (M)

Liga

nd k

ötés

(%)

20. ábra A vezérmolekula jellemzése szelektivitási vizsgálatokban. A C1q kötést vizs-

gáltuk A (fekete kör) és IgG (fehér háromszög) molekulákhoz. SAP kötését is vizsgáltuk A

peptidhez (fehér négyzet) a vegyület jelenlétében. A vizsgálatok eredményei azt mutatták,

hogy a vegyület mikromólos koncentrációban csak az A peptidhez történő C1q kötést gátol-

ta, ugyanakkor nincs hatása más fehérje-fehérje kölcsönhatásra, beleértve az antitestekhez

történő C1q kötést is (Sárvári és mtsai, 2003). A pontok hat független mérés átlagai.

Mivel a vegyület gátolta a C1q kötést A peptidhez, de nem volt hatása a C1q kötésre IgG Fc

régiójához és a SAP kötésre A peptidhez sem, valószínűnek látszott, hogy a vezérmolekula

szelektíven gátolja a C1q kötést A peptidhez és több más nem-immunglobulin aktivátorhoz.

A vegyület hatásmechanizmusa szempontjából döntő kérdés, hogy melyik kölcsönható

partner kötőhelyéhez kapcsolódva gátolja a C1q kötését A peptidhez. A kérdést tömeg-

spektrometriás kísérletben vizsgáltuk. A módszert elterjedten használják kis molekulák és

fehérjék nem kovalens komplexeinek mennyiségi meghatározására. Az általunk használt

elektrospray technikában a tömegspektrométer közvetlenül mérte a kondenzált fázisban

jelenlévő komplexeket. A kísérletben natív körülmények között inkubáltuk az A peptidet és

a vezérmolekulát, majd a kialakult komplexeket tanulmányoztuk (Sárvári és mtsai, 2003).

43

A B

21. ábra A vezérmolekula és A peptid kölcsönhatásának vizsgálata ESI tömegspektro-

metriával. Először az A (M1) és melatonin (M2) közötti jól jellemzett kölcsönhatást vizsgál-

tuk (A). 3 óra inkubáció után az A közel 30%-a a melatoninnal kialakult komplexben talál-

ható. Ezzel szemben a vezérmolekulával az A 3%-a képzett komplexet ugyanennyi idő alatt

(B). A komplex csúcsának intenzitása 24 órás inkubáció alatt sem emelkedett számottevően.

A kísérlet eredménye bizonyította, hogy a vezérmolekula nem köt az A peptidhez. A C1q

kötést így valószínűleg a C1q A kötőhelyéhez kötve gátolja a vegyület.

44

A lead molekula hatékonyságát funkcionális vizsgálatban is ellenőriztük. Hippokampális

sejteket kezeltünk szérum jelenlétében A peptiddel, és a vegyület koncentrációfüggő védő

hatását vizsgáltuk in vitro.

0

1020

3040

5060

70

8090

100110

1,E-07 1,E-06

c (M)

Véde

lem

(%)

22. ábra A lead vegyülettel történő C1q kötés gátlása A peptidhez a komplement-

függő citotoxicitás felfüggesztését eredményezte (Sárvári és mtsai, 2003).

A kísérlet eredménye azt mutatta, hogy a C1 aktiváció nemcsak a C1r és C1s proteázok

szintjén (7. ábra), hanem a C1q A kötőhelyén is gátolható (22. ábra).

45

7. Eredmények megbeszélése7.1 A komplement aktiváció biológiai jelentősége

A keringésben az antitestek antigénekhez kapcsolódva immunkomplexeket hoznak

létre. Ha ezeket a fagociták nem takarítják el, akkor az érfalon vagy a szövetekben lerakódva

tartós gyulladást okozhatnak. Komplement hiányos állapotok bizonyítják, hogy a komplement

fontos szerepet játszik az immunkomplexek eltávolításában. C5 vagy terminális komplement

komponensek hiánya nem okoz változást, de a korai komponensek (C1q, C1r, C1s, C4, C2,

C3) hiánya gyakran immunkomplex betegséget okoz. Ez összhangban van azzal a megfigye-

léssel, hogy a klasszikus reakcióút fontos szerepet játszik a nagyméretű immunkomplexek

kialakulásának és lerakódásának megakadályozásában, míg az alternatív út működése teszi

oldhatóvá ezeket, ha mégis kialakulnának (Schifferli és mtsai, 1986).

Naponta 109 sejt pusztul el programozottan a szervezet számára nem megfelelő, hibás, rossz

helyen lévő, nem funkcióképes, potenciálisan veszélyes sejtek eliminálására. Apoptózissal

elpusztult sejtek eltávolításában fontos szerepet játszik a komplementrendszer. A pusztuló

sejtek fagocitózist elősegítő molekulákat, például foszfokolint jelenítenek meg membránjuk

extraculluláris oldalán, amihez Ca++ jelenlétében CRP kötődik (Szalai, 2004). Más membrán

struktúrákhoz IgM köt. A C1q mindkét fehérjét felismeri, ami a klasszikus út aktivációját

eredményezi. A keletkező C3b és C4b fragmentumok opszonizálják az elpusztult sejteket,

ezáltal a CRP-vel és IgM-mel jelölt apoptotikus sejteket a szöveti makrofágok sikeresen

eltakarítják. Az aktiváció azonban a C3 hasítását követően megáll, mert a CRP H-faktort köt,

és az I-faktor a C3b hasításán keresztül lefékezi az aktivációt (lásd bővebben: 12. oldal).

Részben tehát az I-faktor felelős azért, hogy az apoptózissal elpusztult sejtek nem okoznak

gyulladást, mivel a C3b hasítása révén megakadályozza a C5-konvertáz kialakulását, ezáltal

az apoptotikus sejtek környezetében nem következik be a C5 hasítása és a C5a felszabadulása.

A komplementrendszer elemei az összes testfolyadékban megtalálhatóak, és fajlagos

immunitás hiányában is biztosítani tudják a fertőző ágensek elleni hatékony védelmet. A

fertőző kórokozók elleni harcban a komplement opszonizáló, gyulladásserkentő és litikus

aktivitása egyaránt kiemelkedően fontos szerepet játszik.

A fagociták, amelyek feladata a sejttörmelékek, immunaggregátumok, baktériumok és más

mikroorganizmusok bekebelezése és feldolgozása, csak akkor tudják ellátni feladatukat, ha az

eltávolítandó sejteket meg tudják különböztetni a szervezet saját sejtjeitől. A védekező reakci-

ónak ezért az egyik feladata, hogy antitestekkel és komplement fragmentumokkal megjelölje

az eltávolítandó célsejteket a komplement receptorokkal rendelkező fagociták számára. A

46

fagociták közé tartoznak a vér monocitái és a polimorfonukleáris leukociták, valamint a

különböző szöveti makrofágok. A fagocitózisban résztvevő receptorok az antitestek Fc régió-

ját felismerő FcR, és a C3b, illetve iC3b (I-faktor által hasított C3b) fragmentumokat felisme-

rő CR1 és CR3. Elegendő számú antitest a célsejt membránján elégséges az FcR-val rendelke-

ző fagociták számára a bekebelezési folyamat beindításához. Kevesebb antitest elegendő a

klasszikus út aktivációjához, és a C4b és C3b jelölések felerősítik az opszonizációt. Azonban

a CR1 és CR3 önmagában nem mindig elégséges a bekebelezés beindításához. Bekebelezés

után a fagoszómák lizoszómákkal olvadnak össze, és a lizoszómális enzimek lebontják a

bekebelezett sejtet.

A klasszikus út aktivációja során három kisméretű fragmentum, C4a, C3a és C5a szabadul fel

(Ember és mtsai, 1998). A három molekula rokon szerkezetű, hasonló aktivitási mintázattal,

de különböző hatékonysággal rendelkeznek (C4a<<C3a<<C5a). Az anafilatoxinok vazodila-

tációt okoznak, de a hatást fokozza a hízósejtekből anafilatoxinok hatására felszabaduló

hisztamin. Ennek hatására fokozódik a vérellátás. Eközben nő az érfalak permeabilitása, ami

lehetővé teszi, hogy plazma fehérjék, köztük komplement komponensek diffundáljanak a

sérülés helyére. A hízósejtekből történő hisztamin felszabaduláshoz elengedhetetlen az

anafilatoxinok C-terminálisán az Arg jelenléte. Eltávolításáért a karboxipeptidáz N felelős,

így a C5a molekulából C5adesArg keletkezik, amely már nem köt a hízósejteken található

C5aR-hoz. A C5a a leghatékonyabb kemotaxist kiváltó anafilatoxin fagociták számára. Az

érfalak tágulása segíti a C5a szétterjedését a véráramban. A C5a kötése a vér fagocitáin

található C5aR-hoz a sejtek kitapadását, szövetbe való bejutását és a sérülés helyére vándor-

lását eredményezi. A fagocitákon fokozódik a CR1 és CR3 expressziója, miközben intracellu-

láris enzimeket és leukotriéneket szekretálnak, valamint toxikus metabolitokat termelnek, ami

növeli a sérülés helyére vándorolt fagociták citotoxikus hatékonyságát.

A vörösvértest membránon kialakuló membránkárosító komplex vizsgálatából kiderült,

hogy a C5b-8(C9)n összetételű komplex esetében a pórus mérete 3 és 10nm között van.

Fontos, hogy a 3nm pórusátmérőjű komplex (n=2) is rendelkezik litikus aktivitással. De a

sejtmaggal rendelkező sejtek többféle módon képesek kivédeni a membránkárosító komplex

litikus hatását. A komplex kialakulása után, de még a lízis előtt hirtelen megemelkedik az

intracelluláris Ca++ koncentráció, ami a komplex leválását vagy internalizációját és a javító

mechanizmusok aktivációját eredményezi. Szemben a vörösvértestekkel, amelyek kizárólag a

CD59 molekulát használják a C9 beépülésének megakadályozására, a magvas sejtek ellenálló-

ak a komplement lízissel szemben. Azonban nagyfokú komplement aktiváció esetén (105

membránkárosító komplex /sejt) még a magvas sejtek sem képesek a túlélésre, mivel a

47

komplex kialakulásával párhuzamosan depolarizálódik a sejtmembrán. Az ezt követő kom-

penzációs mechanizmusok és a Ca++ indukálta sejt aktivációs folyamatai elhasználják az

energia tartalékokat, és ez a bekövetkezett membránszerkezet sérülésekkel együtt a sejt

halálát okozza.

A komplement fontos szerepet játszik a B-sejt válasz kialakulásában. Ennek molekuláris

alapja, hogy a B-sejteken található antigénreceptor és CR2 keresztkötése alakul ki, ha a

komplement aktiváció során az antigénhez C3d kapcsolódik. A keresztkötött receptorok

sokkal erősebb B-sejt aktivációt eredményeznek, mint az antigén egyedül. Ez magasabb

antitest titer és erősebb B-sejt memória kialakulásához vezet.

7.2 A peptid által kiváltott komplement aktivációA komplement aktiváció jelentőségére az Alzheimer kór patomechanizmusában két

kulcsfontosságú megfigyelés világított rá. Az egyik megfigyelés szerint Alzheimer kórban a

komplement aktiváció antitestektől független folyamat. A C1q köt a plakkok fő alkotójához,

az A peptidhez (Rogers és mtsai, 1992). Modellezési kísérletek szerint az A 4-11 szakaszá-

ban található Asp7, Glu11 oldalláncok elektrosztatikus kölcsönhatást létesíthetnek a C1q A

láncban található Arg16, Arg19, Arg20 bázikus oldalláncokkal (Velazquez és mtsai, 1997).

Az eredmények azt sugallják, hogy Alzheimer kór esetében elsősorban a klasszikus útnak van

jelentősége, de in vitro az A C3 kötésen keresztül aktiválja a komplement alternatív útját is

(Bradt és mtsai, 1998). Ez a megfigyelés magyarázattal szolgál arra, hogyan alakul ki a

gyulladás már a betegség preklinikai szakaszában (Zanjani és mtsai, 2005), és marad fenn a

betegség során több évtizedig. Fontos megjegyezni, hogy az NFT is aktiválja a komplement

klasszikus útját (Shen és mtsai, 2001).

A másik megfigyelés szerint a komplement fehérjéknek jelentős gyulladást kiváltó hatásuk

van az agyszövetben is. Az aktiváció során felszabaduló anafilatoxinok, köztük a C5a

keletkezése aktiválja a glia sejteket, és növeli a gyulladásserkentő citokinek termelését.

Alzheimer kórban emelkedik a komplement fehérjék szintézise. A komplement aktiváció

során keletkező fragmentumok megjelölik (opszonizálják) a célsejtek membránját a fagociták

számára. Ezeket az opszoninokat (például C1q, C4b, C3b) kimutatták Alzheimer kóros

betegek agyában. Az idegsejtek membránján keletkező membránkárosító komplexek azok

pusztulását eredményezhetik (Webster és mtsai, 1997; Yang és mtsai, 2000). Kísérleteink

szerint A szérum jelenlétében a klasszikus út aktivációján keresztül hippokampális sejtek

pusztulását okozta in vitro (6. ábra).

7.3 A peptid által kiváltott komplement aktiváció a klasszikus úton történik

48

Jóllehet a klasszikus és az alternatív útvonal aktivációját is leírták A hatására in vitro,

farmakológiai szempontból fontos kérdés, hogy melyik útvonal hatása a domináns. A kérdés

megválaszolásához C1-Inh hatását vizsgáltuk az A által indukált komplement aktiváció

toxikus hatására hippokampális sejteken in vitro. Kísérleteink azt mutatták, hogy a klasszikus

reakcióút endogén szabályozó molekulája felfüggesztette a komplement aktiváció által

kiváltott sejtpusztulást (7. ábra). Ez az eredmény azt az elképzelést támasztotta alá, hogy az

A elsősorban a klasszikus útvonalon keresztül aktiválja a komplementrendszert, ami

idegsejtek pusztulását eredményezi.

Több irodalmi adat utal arra, hogy az in vitro kísérletekkel vizsgált A kiváltotta komplement

aktiváció valószínűleg in vivo is lejátszódik. Alzheimer kórban elhunyt betegek agyában, kü-

lönösen a hippokampuszban magasabb C1q szintet figyeltek meg (Yasojima és mtsai, 1999).

Emellett a betegek agyában kimutathatóak az aktiváció folyamatát bizonyító komplement

aktivációs fragmentumok, és a membránkárosító komplex (Webster és mtsai, 1997).

Vizsgálataink során RNS (8. ábra) és fehérje szinten (10. ábra) igazoltuk, hogy az agy szöveti

makrofágja, a mikroglia folyamatosan termel C1q fehérjét in vitro. RNS szintű kísérletekkel

igazoltuk, hogy a mikroglia rendelkezik komplement receptorokkal, többek között a cC1qR,

CR3 és a C5aR gén kifejeződését (8. ábra) bizonyítottuk in vitro. Valószínűsíthető, hogy

komplement aktiváció esetén a mikroglia sejtek a felszabaduló C5a hatására az aktiváció

helyére sereglenek, majd ott az aktivációt kiváltó, már opszonizált anyagot megpróbálják

eltávolítani. A felszabaduló C5a IL-1 és IL-6 szintézist indukál A stimulálta mikroglia

sejtekben. A keletkező citokinek növelik a korai komplement fehérjék szintézisét, de a C1-Inh

szintézise nem változik (Veerhuis és mtsai, 1999). Vizsgálataink azt mutatták, hogy glia

sejtekben A kezelés hatására enyhén emelkedett a C1q gének transzkripciója (12. ábra), de a

C1-Inh gén átíródása (13. ábra) változatlan maradt. Mivel a C1-Inh a klasszikus reakcióút fő

szabályozó molekulája, az aktiváció és a gátlás egyensúlya A jelenlétében felborulhat,

ezáltal a komplementrendszer aktivációja szabályozatlanná válhat.

49

7.4 C1q, a szelektív komplement gátlás lehetséges molekuláris célpontjaA komplement aktiváció szelektív gátlása bizonyos kórképekben, így Alzheimer kór

esetében is vonzó terápiás célpontnak látszik. Alzheimer kór esetében az irodalomban közölt

adatok és saját kísérleteink eredményei is azt mutatták, hogy az aktiváció túlnyomórészt a

klasszikus úton keresztül történik. Ezért molekuláris célpontként a klasszikus reakcióút fehér-

jéit vettük számba. A proteázok gátlását a szelektivitás hiánya miatt elvetettük. Ezzel szemben

a C1q több ok miatt is vonzó célpontnak látszott. Irodalmi adatok azt mutatták, hogy a C1q

molekulán az Fc és az A kötőhelyek különbözőek. Régóta ismert, hogy az immunglobulinok

Fc régiójának kötéséért a C1q globuláris doménje felelős (Duncan & Winter, 1988). Az A

kötőhelyre vonatkozóan az irodalomban ellentmondó adatok találhatóak. A C1q A lánc 14-26

szekvenciájának megfelelő peptid gátolta a C1q kötését A peptidhez. Ebből azt a következte-

tést vonták le, hogy a C1q A láncának ez a környezete felelős az A kötésért (Jiang és mtsai,

1994). Egy másik közlemény azonban a globuláris doménen lokalizálta az A kötőhelyet

(Tacnet-Delorme és mtsai, 2001). Számunkra döntő kérdés volt, hogy az Ig és A kötőhely

különböző legyen. A kérdés eldöntésére beállítottunk két szilárd fázisú kötési tesztet, az

egyikben a C1q-A, a másikban C1q-IgG kölcsönhatást vizsgáltuk. Az első, tehát a C1q-A

kötési teszttel vizsgáltuk az RBI vegyület gyűjteményét, amely 640 farmakológiailag aktív

vegyületet tartalmazott. Hét olyan vegyületet találtunk, amely hatékonyan (IC50<5M)

gátolta a C1q kötést A peptidhez (3. táblázat). A hét anyag egyike sem gátolta a C1q kötését

immobilizált antitestekhez. Eredményünk azt az elképzelést támasztotta alá, hogy a C1q

molekula eltérő kötőhellyel rendelkezik az A és az Ig kötésére. Ezek szerint az C1q

molekulán szelektíven gátolható az A kiváltotta komplement aktiváció. Két nem-immunglo-

bulin C1q aktivátor, CRP és SAP kötését is vizsgáltuk A és Ig mellett. A gátlási görbék

lefutása (17. ábra) a három nem-immunglobulin aktivátor esetében nagyon hasonlónak

bizonyult.

Miután a szelektív komplement gátlás a C1q A kötőhelyének gátlásával megvalósíthatónak

tűnt, a Társaság tulajdonában lévő vegyülettárat szűrtük a beállított kötési teszttel. A találatok

azonosítása és újramérése után szelektivitási vizsgálatokban jellemeztük őket. A 308 találat

közül 56 gátolta a C1q kötését CRP-hez, míg 35 vegyület a C1q kötését MBP-hez (18. ábra).

A leghatékonyabb szerkezeti csoport optimalizálásával vezérmolekulát állítottunk elő, ami

hatékonyan (IC50=0,7M) gátolta a C1q kötését A peptidhez (19. ábra), de nem gátolt több

fehérje-fehérje kölcsönhatást (20. ábra), köztük a C1q immunkomplexekhez történő kötését

sem. Tömegspektrometriás kísérletekkel igazoltuk (21. ábra), hogy a vegyület nem az A C1q

kötőhelyéhez, hanem a C1q molekulán található A kötőhelyhez köt.

50

A vezérmolekula funkcionális hatását egy sejtalapú modellben ellenőriztük in vitro. Hippo-

kampális sejteket kezeltünk szérum jelenlétében A peptiddel. A kezelés után öt nappal a

sejtek 30%-a elpusztult (6. ábra). A vezérmolekula a C1-Inh-hoz hasonlóan (7. ábra) felfüg-

gesztette az A komplement-függő citotoxikus hatását (22. ábra). A kölcsönhatás in vivo

relevanciáját bizonyítja az a megfigyelés, hogy az Alzheimer kór egyik állatmodelljében, APP

transzgenikus egerekben C1q hiányában, amikor a komplement-függő citotxikus hatás nem

érvényesül, alacsonyabb sejtpusztulást tapasztaltak (Fonseca és mtsai, 2004).

7.5 Valószínűleg nem az A14-26 régió a C1q molekula A kötőhelye A vezérmolekula hatékonyan gátolta a C1q kötését direkt aktivátorokhoz, és több

nagyságrenddel alacsonyabb mértékben gátolta a C1q kötését antitestekhez. Ezek az eredmé-

nyek megerősítették azt az elképzelésünket, hogy a kétféle aktivátorra, antitestekre és direkt

C1q aktivátorokra különböző kötőhelyek találhatók a C1q molekulán. A C1q A láncában a

14-26 régióról bizonyították, hogy részt vesz a CRP kötésben (Jiang és mtsai, 1992). Az

A14-26 peptid hatékonyan (IC50=0,7M) gátolta a C1q kötését CRP-hez. Mivel az általunk

kifejlesztett vezérmolekula és az A14-26 peptid azonos hatékonysággal gátolta a C1q kötést,

valószínűnek látszik, hogy a CRP kötőhely az A14-26 szekvencia környezetében található.

A vezérmolekula hatékonyan gátolta a C1q kötését egy másik akut fázis fehérjéhez, a szérum

amiloid P-hez (Ying és mtsai, 1993). Az A14-26 peptid ugyancsak gátolta a C1q kötését SAP-

hoz, de a gátlás hatékonysága közel egy nagyságrenddel (IC50=5M) alacsonyabb, mint a

CRP esetében. A gátlási hatékonyságok különbözősége arra utalhat, hogy a SAP kötőhely

nem pontosan az A14-26 régióban lokalizálható a C1q molekulán.

A vezérmolekula ugyancsak hatékonyan gátolta a C1q kötését A peptidhez. A 14-26 peptid

hatását vizsgálva megállapították, hogy gyengén (IC50=70M) gátolta a C1q kötését A

peptidhez (Jiang és mtsai, 1994). Az általunk kifejlesztett lead molekula és az A14-26 peptid

gátlási állandója közötti két nagyságrend különbség arra utal, hogy az A kötőhely nem az A

lánc 14-26 régiójában található. A következtetést alátámasztja egy friss publikáció, amely a

C1q globuláris régiójában lokalizálta az A kötőhelyet (Tacnet-Delorme és mtsai, 2001).

51

7.6 A komplementgátlás lehetséges terápiás előnyei és hátrányaiA komplementrendszer egyik biológiai funkciója, hogy az idegen sejteket felismerje és

megsemmisítse, vagy közreműködjön azok megsemmisítésében opszonizációjuk révén. A

fibrilláris amiloidot a C1q idegennek ismeri fel, és a kötés hatására aktiválódik a komplement

klasszikus reakcióútja (Rogers és mtsai, 1992; Jiang és mtsai, 1994). Az aktiváció során

felszabaduló kisméretű C3a és C5a fragmentumok az aktiváció helyére toborozzák az agy

szöveti makrofágját, a mikrogliát. Az aktivált mikroglia sejtek hatékony fagociták, és megpró-

bálják bekebelezni az opszonizált amiloid lerakódásokat. A lerakódásokat a mikroglia nem

tudja eltávolítani, ezért aktivált állapotuk elhúzódik. A fenti folyamatok kétféle úton befolyá-

solhatóak. Az egyik lehetőség a fagocitózis elősegítése, pl. anti-A antitestek segítségével

(Schenk és mtsai, 1999). A másik stratégia a komplement aktiváció gátlása révén megakadá-

lyozni a komplement és a mikroglia aktiváció citotoxikus hatásainak megjelenését. A vakcina

stratégia klinikai eredményei óvatosságra intenek, ezért ésszerűnek tűnt a második lehetőség

vizsgálata.

A komplement az immunrendszer alapvető eleme, tehát gátlása esetén kiemelkedő szempont a

szelektivitás kérdése. A kaszkád aktivációs fázisban történő gátlása kívánatos, hogy a C3

hasítása már ne történjen meg. Irodalmi és saját eredményeink alapján a C1q előnyös

molekuláris célpontak látszott az A peptid által kiváltott aktiváció gátlására.A C1q kötés

szelektív gátlása esetén az A által kiváltott komplement aktiváció első lépése gátolt. Ebben

az esetben valószínűleg nem borul fel az aktiváció-gátlás egyensúlya, tehát nem alakul ki

krónikus komplement aktiváció. Ennek következtében nem keletkezik véletlenszerűen

membránkárosító komplex az amiloid plakkok környezetében található idegsejteken. Másrészt

nem szabadulnak fel C3a és C5a anafilatoxinok, és nem toborzódik mikroglia az amiloid

lerakódásokhoz. Mivel a vezérmolekula nem gátolta a C1q kötést antitestekhez, a periférián

az IgG és IgM képes aktiválni a komplementrendszert a klasszikus reakcióúton keresztül. A

szelektivitási adatok arra is utalnak, hogy a pentraxinok által kiváltott komplement aktiváció

sérül. Ez káros lehet az apoptotikus sejtek hatékony és gyors eltávolítására, de kifejezetten

előnyös, hogy a szenilis plakkokban megtalálható SAP sem aktiválja a komplement

klasszikus útját. A legfontosabb kérdés, hogy hosszútávon a szervezet miként tolerálja a

csökkent komplement funkciót.

52

7.7 Komplement aktiváció gátlása sclerosis multiplex kezeléséreA vezérmolekula szelektivitási adatai megerősítették, hogy a komplement aktiváció a

C1q molekulán keresztül szelektíven gátolható. A vegyület hatékonyan gátolta a C1q kötést

több nem-immunglobulin aktivátorhoz, többek között MBP-hez is. A találatok csoportosítá-

sakor kapott eredményünk (18. ábra) arra utalt, hogy a C1q molekulán az MBP kötőhely

valószínűleg átfed a CRP kötőhellyel, tehát az MBP kötőhely is az A14-26 régióban található.

Természetesen az eredmények alapján nem zárható ki, hogy a kötésben egy másik, bázikus

oldalláncokban gazdag kötőhely vesz részt. Ez felveti annak a lehetőségét, hogy az általunk

kifejlesztett C1q inhibítor nemcsak Alzheimer kórban, hanem demielinizációs betegségekben,

például sclerosis multiplexben (SM) is alkalmas lehet a gyulladás kialakulásában és a neuron-

pusztuláshoz hozzájáruló komplement aktiváció szabályozására. A betegségben az axonok

mielin hüvelye sérül, ezáltal nem-immunglobulin C1q aktivátorként ismert molekulák, MBP,

mielin oligodendrocita glikoprotein (MOG) kerülhetnek felszínre, amelyek a folyamatosan

termelődő C1q révén aktiválják a klasszikus reakcióutat (Vanguri & Shin, 1986; Johns &

Bernard, 1997). Az oligodendrociták, a mielinizációért felelős glia sejtek különösen érzéke-

nyek a komplement litikus hatásaira (Scolding és mtsai, 1989; Piddlesden & Morgan,1993;

Agoropoulou és mtsai, 1998). SM betegek agyában komplement aktivációs fragmentumokat

azonosítottak (Spiegel és mtsai, 1998). Fertőzések esetén a komplement terminális szakaszá-

nak aktivációja általában előnyös a szervezet számára, de bizonyos betegségekben, különösen

autoimmun betegségekben szöveti sérülést okozhat. A membránszerkezet megbontásán túl a

szublitikus dózisú membránkárosító komplex toxikus oxigén metabolit és arachidonsav

felszabadulást okoz, ami hozzájárulhat a szöveti sérüléshez.

A betegség egyik állatmodelljében, kísérleti úton létrehozott autoimmun encephalomyelitis-

ben (EAE) komplement gátlókkal történt kezelés csökkentette az agyban zajló gyulladásos

folyamatokat, és megszűntette a mielinvesztést (Piddlesden és mtsai, 1994). Transzgenikus

egérben, amelyben asztrociták szolubilis komplement inhibítort termeltek, nem alakult ki

EAE, vagy csak enyhe tünetek jelentkeztek (Davoust és mtsai, 1999). Mindezek az eredmé-

nyek arra utalnak, hogy a komplementrendszer aktivációja jelentős mértékben hozzájárul az

SM-ben történő neuronpusztuláshoz.

Az aktivációt kiváltó anyag valószínűleg a sérült mielin hüvely egyik komponense. Az a tény,

hogy B-sejt hiányos transzgenikus egérben is létrehozható EAE (Hjelmström és mtsai, 1998),

megerősíti elképzelésünket, hogy nem-immunglobulin C1q aktivátorok felelősek a komple-

mentrendszer antitest-független aktivációjáért.

53

Az SM klinikailag heterogén, a gyulladásos reakció ugyan hasonló, de a mielinvesztés alapján

négy jól meghatározott csoport különböztethető meg (Lassman és mtsai, 2001). Az egyik

csoport a makrofág közvetített mielinvesztés, amelyben az aktivált makrofág és mikroglia

okoz sejtpusztulást. A betegség e típusának in vivo modellezésére általánosan elfogadott az

EAE, tehát a fejlesztett vegyületek ebben a modellben vizsgálhatók.

54

8 A célkitűzések megvalósulása

Kutatásaim a komplement központi idegrendszerben bekövetkező aktivációjának és

következményeinek felderítésére irányultak. A célkitűzésekben (4. fejezet, 23. oldal)

megfogalmazott kutatási célok az alábbiak szerint valósultak meg:

1. Ismert, hogy az amiloid -peptid (A) aktiválja a komplement rendszert in vitro. Az

aktiváció funkcionális hatásainak vizsgálatára egy in vitro sejtalapú rendszer kidol-

gozását tűztük ki. Megállapítottuk, hogy hippokampális sejtek érzékenyek az A által

kiváltott komplement aktiváció lítikus hatásaira. Ezt a megfigyelést felhasználva és

egy közölt módszer alapján kidolgoztunk egy sejtalapú tesztet, ami alkalmasnak

bizonyult arra, hogy az A által indukált komplement aktiváció citotoxikus hatásait

kimutassuk (Sárvári és mtsai, 2003).

2. Az A által kiváltott komplement aktivációhoz irodalmi adatok alapján mind a

klasszikus, mind az alternatív út hozzájárul. Nem jelent meg azonban összefoglaló

vizsgálat arról, hogy melyik útvonal játsza a főszerepet az aktiváció során. Ezt a

kérdést a C1r és C1s proteázokat gátló C1-Inh hatásának vizsgálatával tanulmányoz-

tuk. Megállapítottuk, hogy a klasszikus aktivációs út endogén szabályozó molekulája,

a C1-Inh védelmet biztosított hippokampális sejtek számára az A-indukálta

komplement citotoxikus hatásaival szemben (Sárvári és mtsai, 2003). Eszerint az

aktiváció döntően a klasszikus útvonalon keresztül zajlik.

3. A központi idegrendszerben több sejttípusról is kimutatták, hogy komplement

fehérjéket termelnek. A komplement komponensek jelentős részét az agy szöveti

makrofágja, a mikroglia termeli. Irodalmi adatokkal összhangban kimutattuk, hogy

mikroglia sejtekben konstitutívan kifejeződnek a komplement első komponensének

láncait kódoló gének in vitro. Megállapítottuk, hogy a mikroglia felszínén több

komplement receptor, C1qR, CR3 és C5aR található. Ezek az eredmények arra

utalnak, hogy a mikroglia komplement receptorai révén érzékeli az aktiváció során

felszabaduló aktivációs fragmentumokat, és a sejtek az aktivációt kiváltó anyag köré

sereglenek. Ebből következik, hogy a komplement aktiváció és a mikroglia sejtek

központi szerepet játszanak a központi idegrendszer gyulladásos folyamataiban.

4. Mára egyetértés alakult ki abban, hogy az A oki szerepet játszik az Alzheimer kór

kialakulásában. Tanulmányoztuk, hogy a peptid befolyásolja-e a C1q és a C1-Inh

génjeinek átíródását mikroglia sejtekben in vitro. Megállapítottuk, hogy az A

55

koncentráció-függő módon növeli a C1q génjeinek átíródását, míg csökkenti a C1-Inh

transzkripcióját (Sárvári és Pázmány, nem közölt eredmény). Ez az eredmény

megerősíti azt az elképzelést, hogy az amiloid felszabadulás és lerakódás

környezetében aktiválódik a komplementrendszer, ám az aktiváció és szabályozó

mechanizmusok egyensúlya felborul és az aktiváció krónikussá válik.

5. Az aktivációért felelős útvonal és a mikrogliális expresszió ismeretében a komplement

első komponensének q alegységét farmakológiai beavatkozásra alkalmas támadáspont-

nak választottuk (Sárvári és Pázmány, nem közölt eredmény). Irodalmi és saját

eredményeink alapján azt gondoltuk, hogy a C1q A kötőhelyének gátlása révén a

komplement aktiváció szelektíven gátolható.

6. A szakirodalomban kevés komplement inhibítort írtak le, klinikán pedig nincs szelek-

tív, kis molekulatömegű komplementgátló. Ezért először egy glikózaminoglikánt,

majd egy kereskedelmi úton beszerezhető gyűjtemény vegyületeit tanulmányoztuk a

kiválasztott támadáspontú C1q fehérje funkciójára. Megállapítottuk, hogy a

kiválasztott glikózaminoglikán és a gyűjtemény néhány (7) vegyülete gátolta a C1q

kötést A peptidhez (Urbányi és mtsai, 2005).

7. A Társaság tulajdonában levő vegyülettár mérete és szerkezeti diverzitása révén

alkalmas új kémiai szerkezetek azonosítására. Egy nagy áteresztőképességű módszer

beállítása és validálása után szűrtük a vegyülettárat. Optimalizálás után vezérmole-

kulát választunk ki (Sárvári és mtsai, 2003)).

8. A kiválasztott vezérmolekulát hatékonysági és szelektivitási vizsgálatokkal jellemez-

tük. Megállapítottuk, hogy a vegyület gátolta a C1q kötést Ab peptidhez és más nem-

immunglobulin aktivátorokhoz, de nem gátolta a kötést immunglobulinokhoz (Sárvári

és mtsai, 2003). Ezek az eredmények arra utaltak, hogy a C1q amiloid kötőhelyének

gátlása révén a komplement klasszikus útjának aktivációja szelektíven befolyásolható.

9. ESI-MS vizsgálatokkal kizártuk, hogy a vezérmolekula köt az A peptidhez. A

kísérlet eredménye megerősítette, hogy a vegyület a C1q amiloid kötőhelyéhez kötve

fejti ki hatását (Sárvári és mtsai, 2003).

10. A vezérmolekula szelektíven gátolta a komplement aktiváció első lépését. In vitro

sejtalapú tesztben vizsgáltuk, hogy a molekula felfüggeszti-e a komplement toxikus

hatását az idegsejtekre. Megállapítottuk, hogy a vezérmolekula az aktiváció első

lépését gátolva megvédte a hippokampális sejteket az A-indukálta komplement

aktiváció citotoxikus hatásaival szemben (Sárvári és mtsai, 2003).

56

9 Saját közlemények

Závodszky P, Vonderviszt F, Lakatos S, Kilár F, Simon I, Török J, Sziva D and Sárvári M (1985)

Domain structure and signal transduction within antibody molecules.

In: Multidomain proteins (Eds: Patthy L and Friedrich P), pp. 157-174. Akadémiai Kiadó, Budapest

Vonderviszt F, Lakatos S, Gál P, Sárvári M, Závodszky P (1987) A molten globule-like unfolding

intermediate of a four domains protein, the Fc fragment of the IgG molecule

Biochemical and Biophysical Research Communications 148: 92-98

Gál P, Sárvári M, Szilágyi K, Závodszky P and Schumaker V (1989) Expression of a hemolytically

active human complement component C1r proenzyme in insect cells using a baculovirus vector

Complement and Inflammation 6: 433-441

Sárvári M, Csikós G, Sass M, Gál P, Schumaker V, Závodszky P (1990) Ecdysteroids increase the

yield of recombinant protein produced in baculovirus insect cell expression system

Biochemical and Biophysical Research Communications 167: 1154-1161

Luo C, Thielens N, Gagnon P, Gál P, Sárvári M, Tseng Y, Tosi M, Závodszky P, Arlaud G and Schumaker V (1992) Recombinant human complement subcomponent C1s lacking beta-hydroxy-

asparagine, sialic acid, and one of its two carbohydrate chains still reassembles with C1q and C1r to

form a functional C1 complex

Biochemistry 31: 4254-4261

Cseh S, Gál P, Sárvári M, Dobó J, Lőrincz Z, Schumaker V and Závodszky P (1996)

Functional effects of domain deletions in a multidomain serine protease, C1r

Molecular Immunology 33: 351-359

Sárvári M, Závodszky P, Molnár K, Lőw P and Sass M (1996) Baculovirus-mediated trans-epithelial

transport of proteins in infected caterpillars

Journal of General Virology 78: 953-963

Sárvári M, Vágó I, Wéber C, Nagy J, Gál P, Mák M, Kósa J, Závodszky P, Pázmány T (2003)

Inhibition of C1q-beta-amyloid binding protects hippocampal cells against complement mediated

toxicity

Journal of Neuroimmunology 137: 12-18

57

Urbányi Z, Forrai E, Sárvári M, Likó I, Illés J, Pázmány T (2005) Glycosaminoglycans inhibit

neurodegenerative effects of serum amyloid P component in vitro

Neurochemistry International 46: 471-477

Kurkó D, Boros A, Dezső P, Urbányi Z, Sárvári M, Nagy J, Szombathelyi Z, Szendrei G (2006)

Flow cytometry-based method to analyse the change in tau phosphorylation in a hGSK-3beta and htau

over-expressing EcR-293 cell line

Neurochemistry International 48: 374-382

58

10 Irodalmi hivatkozások

Afagh A, Cummings BJ, Cribbs DH, Cotman CW, Tenner AJ (1996) Localization and

cell association of C1q in Alzheimer’s disease brain. Experimental Neurology 138: 22-32

Agoropoulou C, Piddlesden SJ, Lachmann PJ, Wing MG (1998) Neuronal protection of

oligodendrocytes from antibody-independent complement lysis. NeuroReport 9: 927-32

Akiyama H, Barger S, Barnum S, Bradt B, Bauer J, Cole GM, Cooper NR, Eikelenboom

P, Emmerling M, Fiebich BL, Finch CE, Frautschy S, Griffin WST, Hampel H, Hull M,

Landreth G, Lue LF, Mrak R, Mackenzie IR, McGeer PL, O’Banion MK, Pachter J,

Pasinetti G, Plata-Salaman C, Rogers J, Rydel R, Shen Y, Streit W, Strohmeyer R,

Tooyoma I, Van Muiswinkel FL, Veerhuis R, Walker DG, Webster S, Wegrzyniak B,

Wenk G, Wyss-Coray T (2000) Inflammation and Alzheimer’s disease.

Neurobiology of Aging 21: 383-421

Beglopoulos V, Sun X, Saura C, Lemere CA, Kim RD, Shen J (2004) Reduced -amyloid

production and increased inflammatory responses in presenilin conditional knock-out mice.

Journal of Biological Chemistry 279: 46907-14

Botto M, Dell’agnola C, Bygrave AE, Thompson EM, Cook HT, Petry F, Loos M,

Pandolfi PP, Walport MJ (1998) Homozygous C1q deficiency causes glomerulonephritis

associated with multiple apoptotic bodies. Nature Genetics 19: 56-9

Brachova L, Lue L, Schultz J, Rashidy TE, Rogers J (1993) Association cortex,

cerebellum, and serum concentrations of C1q and Factor B in Alzheimer’s disease.

Molecular Brain Research 18: 329-34

Bradt B, Kolb WP, Cooper NR (1998) Complement-dependent proinflammatory properties

of the Alzheimer’s disease -peptide. Journal of Experimental Medicine 188: 431-8

Brodsky-Doyle B, Leonard KR, Reid KBM (1976) CD and electronmicroscopy studies of

human subcomponent C1q. Biocemical Journal 159: 279-86

Campbell RD, Law SK, Reid KB, Sim RB (1988) Structure, organization, and regulation of

complement genes. Annual Reviews of Immunology 6: 161-95

Catterall CF, Lyons A, Sim RB, Day AJ, Harris TJ (1987) Characterization of the primary

amino acid sequence of human complement control protein Factor I from an analysis of

cDNA clones. Biochemical Journal 242: 849-56

59

Cseh S, Gál P, Sárvári M, Dobó J, Lőrincz Z, Schumaker N, Závodszky P (1996)

Functional effects of domain deletions in multidomain serine protease, C1r.

Molecular Immunology 33: 351-9

Cummings JL (2004) Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine 351:56-67

Davis AE, Whitehead AS, Harrison RA, Dauphinais A, Bruns GA, Cicardi M, Rosen FS

(1986) Human inhibitor of the first component of complement, C1: Characterization of cDNA

clones and localization of the gene to chromosome 11.

Proceedings of National Academy of Sciences, USA 83: 3161-5

Eggleton P, Reid KB, Tenner AJ (1998) C1q – how many functions? How many receptors?

TRENDS in Cell Biology 8: 428-31

Eikelenboom P & Stam FC (1982) Immunoglobulins and complement factors in senile

plaques. Acta Neuropathology 57: 239-42

Ember JA, Jagels MA, Hugli TE (1998) Characterization of complement anaphylatoxins

and their biological responses. Human Complement System in Health and Disease

(szerkesztők Frank MM & Volanakis J) Marcel Dekker, New York. 241-84. oldal

Erdei A (1990) C1q receptor on murine cells. Journal of Immunology 145: 1754-60

Esser AF (1994) The membrane attack complex of complement. Assembly, structure and

cytotoxic activity. Toxicology 87: 229-47

Ezekovitz RA, Sim RB, Hill H, Gordon S (1984) Local opsonization by secreted

macrophage complement components. Journal of Experimental Medicine 159: 244-60

Fonseca MI, Zhou J, Botto M, Tenner AJ (2004) Absence of C1q leads to less

neuropathology in transgenic mouse models of Alzheimer’s disease.

Journal of Neuroscience 24: 6457-65

Gaboriaud C, Thielens NM, Gregory LA, Rossi V, Fontecilla-Camps JC, Arlaud GJ

(2004) Structure and activation of the C1 complex of complement.

TRENDS in Immunology 25: 368-73.

Gasque P, Fontaine M, Morgan BP (1995) Complement expression in human brain.

Biosynthesis of terminal pathway components and regulators in human glial cells and cell

lines. Journal of Immunology 154: 4726-33

Glenner GG & Wong CW (1984) Alzheimer’s disease: Initial report of the purification and

characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein.

Biochemical Biophysical Research Communications 120: 885-90

60

Goate AM, Chartier-Harlin MC, Mullan M, Brown J, Crawford F, Fidani L, Guiffra L,

Haynes A, Hardy JA (1991) Missense mutation int he amyloid precursor protein gene with

Familial Alzheimer Disease. Nature 349: 704-6

Hsiao KK, Chapman P, Nilsen S, Eckman C, Harigaya Y, Younkin S, Yang F, Cole G

(1996) Correlative memory deficits, A elevations, and amyloid plaques in transgenic mice.

Science 274: 99-102

Jenne D & Stanley KK (1985) Molecular cloning of S-protein, a link between complement,

coagulation and cell-substrate adhesion. EMBO Journal 4: 3153-7

Jiang H, Robey FA, Gewurz H (1992) Localization of sites through which C-reactive

protein binds and activates complement to residues 14-26 and 76-92 of the human C1q A

chain. Journal of Experimental Medicine 175: 1373-9

Jiang H, Burdick D, Glabe CG, Cotman CW, Tenner AJ (1994) B-amyloid activates

complement by binding to a specific region of the collagen-like domain of the C1q A chain.

Journal of Immunology 152: 5050-9

Johns TG & Bernard CC (1997) Binding of complement component C1q to myelin oligo-

dendrocyte glycoprotein: A novel mechanism for regulating CNS inflammation.

Molecular Immunology 34: 33-8

Kirszbaum L, Sharpe JA, Murphy B, d’Appice AJ, Classon B, Hudson P, Walker ID

(1989) Molecular cloning and characterization of the novel, human complement-associated

protein, SP-40,40: a link between the complement and reproductive systems.

EMBO Journal 8: 711-8

Kristensen T & Tack BF (1986) Murine protein H is comprised of 20 repeating units, 61

amino acids in length. Proceedings of National Academy of Sciences, USA 83: 3963-7

Lassman H, Brück W, Lucchinetti C (2001) Heterogeneity of multiple sclerosis patho-

genesis: Implications for diagnosis and therapy.

TRENDS in Molecular Medicine 7: 115-21

Law SK & Levine RP (1977) Interaction between C3 and cell surface macromolecules.

Proceedings of National Academy of Sciences, USA 74: 2701-5

Lim GP, Yang F, Chu T, Chen P, Beech W, Teter B, Tran T, Ubeda O, Hsiao Ashe K,

Frautschy SA, Cole GM (2000) Ibuprofen suppresses plaque pathology and inflammation in

a mouse model for Alzheimer’s disease. Journal of Neuroscience 20: 5709-14

Lublin DM, Liszewski MK, Post TW, Arce MA, Le Beau MM, Rebentisch MB (1988)

Molecular cloning and chromosomal localization of human membrane cofactor protein:

Evidence for inclusion in the multi-gene family of complement-regulatory proteins.

61

Journal of Experimental Medicine 168: 181-9

Luo C, Thielens N, Gagnon P, Gál P, Sárvári M, Tseng Y, Tosi M, Závodszky P, Arlaud

G and Schumaker V (1992) Recombinant human complement subcomponent C1s lacking

beta-hydroxyasparagine, sialic acid, and one of its two carbohydrate chains still reassembles

with C1q and C1r to form a functional C1 complex. Biochemistry 31: 4254-62

Mackenzie IR & Munoz DG (1998) Nonsteroidal anti-inflammatory drug use and

Alzheimer-type pathology in aging. Neurology 50: 986-90

Masters CL, Simms G, Weinman NA, Multhaup G, McDonald BL, Beyreuther K (1985)

Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome.

Proceedings of National Academy of Sciences, USA 82: 4245-9

Matsuoka Y, Picciano M, Malester B, LaFrancois J, Zehr C, Daeschner JM, Olschowka

JA, Fonseca MI, O’Banion MK, Tenner AJ, Lemere CA, Duff K (2001) Inflammatory

responses to amyloidosis in a transgenic mouse model of Alzheimer’s disease.

American Journal of Pathology 158: 1345-54

McGeer PL, Akiyama H, Itagaki S, McGeer EG (1989) Immune system response in

Alzheimer disease. Canadian Journal of Neurological Sciences 16: 516-27

McGeer PL, McGeer E, Rogers J, Sibley J (1990) Anti-inflammatory drugs and Alzheimer

disease. Lancet 335: 1037-9

McGeer PL & McGeer EG (1998) The importance of inflammatory mechanisms in

Alzheimer disease. Experimental Gerontology 33: 371-8

Medof ME, Lublin DM, Holers M, Ayers DJ, Getty RR, Leykam JF, Atkinson JP,

Tykocinski ML (1987) Cloning and characterization of cDNAs encoding the complete

sequence of decay-accelerating factor of human complement.

Proceedings of National Academy of Sciences, USA 84: 2007-11

Müller-Eberhard HJ, Dalmasso AP, Calcott MA (1966) The reaction mechanism of C3 i n

immune hemolysis. Journal of Experimental Medicine 123: 33-49

Müller-Eberhard HJ (1988) Molecular organization and function of the complement system.

Annual Review of Biochemistry 57: 321-47

Nagy J & László L (2002) Increased sensitivity to NMDA is involved in alcohol-withdrawal

induced cytotoxicity observed in primary cultures of cortical neurons chronically pre-treated

with ethanol. Neurochemistry International 40: 585-91

Olson JK & Miller SD (2004) Microglia initiates central nervous system innate and adaptive

immune responses through multiple TLRs. Journal of Immunology 173: 3916-24

62

Pangburn MK & Müller-Eberhard HJ (1980) Relation of a putative thioester bond in C3 to

activation of the alternative pathway and the binding of C3b to biological targets of

complement. Journal of Experimental Medicine 152: 1102-14

Pangburn MK, Schreiber RD, Müller-Eberhard HJ (1981) Formation of the initial C3

convertase of the alternative complement pathway.

Journal of Experimental Medicine 154: 856-67

Piddlesden SJ & Morgan Morgan BP (1993) Killing of rat glial cells by complement:

Deficiency of the rat analogue of CD59 is the cause of oligodendrocyte susceptibility to lysis.

Journal of Neuroimmunology 48: 169-76

Podack ER, Tschopp J, Müller-Eberhard HJ (1982) Molecular organization of C9 within

the membrane attack complex of complement.

Journal of Experimental Medicine 156: 268-82

Prechl J & Erdei A (2000) Immunomodulatory functions of murine CR1/2.

Immunopharmacology 49: 117-24

Reid KB & Porter RR (1976) Subunit composition and structure of subcomponent C1q of

the first component of human complement. Biochemical Journal 155: 19-23

Rent R, Myhrman R, Fiedel A, Gewurz H (1976) Potentiation of C1 esterase inhibitor

activity by heparin. Clinical & Experimental Immunology 23: 264-71

Rogers J, Cooper NR, Webster S, Schultz J, McGeer PL, Styren SD, Civin WH,

Brachova L, Bradt B, Ward P, Lieberburg I (1992) Complement activation by -amyloid

in Alzheimer disease. Proceedings of National Academy of Sciences, USA 89: 10016-20

Roses AD (1996) Apolipoprotein E alleles as risk factors in Alzheimer disease.

Annual Reviews in Medicine 47: 387-400

Sárvári M, Csikós Gy, Sass M, Gál P, Schumaker VN, Závodszky P (1990) Ecdysteroids

increase the yield of recombinant protein produced in baculovirus insect cell expression

system. Biochemical and Biophysical Research Communications 167: 1154-61

Schifferli JA, Ng NC, Peters DK (1986) The role of complement and its receptor in the

elimination of immune complexes. New England Journal of Medicine 315: 488-91

Schultz J, Schaller J, McKinley M, Bradt B, Cooper NR, May P, Rogers J (1994)

Enhanced cytotoxicity of amyloid -peptide by a complement dependent mechanism.

Neuroscience Letters 175: 99-102

Schumaker VN, Zavodszky P, Poon PH (1987) Activation of the first component of

complement. Annual Review of Immunology 5: 21-42

63

Scolding NJ, Houston WA, Morgan BP, Campbell AK, Compston DA (1989) Reversible

injury of cultured rat oligodendrocytes by complement. Immunology 67: 441-6

Shen Y, Lue L, Yang L, Roher A, Kuo Y, Stromeyer R, Goux WJ, Lee V, Johnson GV,

Webster SD, Cooper NR, Bradt B, Rogers J (2001) Complement activation by

neurofibrillary tangles in Alzheimer’s disease. Neuroscience Letters 305: 165-8

Skribanek Z, Balaspiri L, Mak M (2001) Interaction between synthetic amyloid -peptide

(1-40) and its aggregation inhibitors studied by electrospray ionization mass spectrometry.

Journal of Mass Spectrometry 36: 1226-9

Spiegel K, Emmerling MR, Barnum SR (1998) Strategies for inhibition of complement

activation int he treatment of neurodegenerative diseases. Neuroinflammation (szerkesztő

Wood PL), Humana Press, Totowa, NJ. 129-76 oldal

Super M, Thiel S, Lu J, Levinsky RJ, Turner MW (1989) Association of low levels of

mannan-binding protein with a common defect of opsonisation. Lancet 2: 1236-9

Suzumura A, Mezitis SG, Gonatas NK, Silberberg DH (1987) MHC antigen expression on

bulk isolated macrophage-microglia from newborn mouse brain: induction of Ia antigen

expression by gamma-interferon. Journal of Neuroimmunology 15: 263-78

Tacnet-Delorme P, Chevallier S, Arlaud GJ (2001) Beta-amyloid fibrils activate the C1

complex of complement under physiological conditions: evidence for a binding site for A beta

on the C1q globular region. Journal of Immunology 167: 6374-81

Takács I, Kerey G, Illés J, Rudolf P, Gere P, Czebe L, Neszmélyi E (1982) Process for

production of organ extracts with high heparin content. US 4.315.923.

Tan F, Weerasinghe DK, Skidgel RA, Tamei H, Kaul RK, Roninson IB, Schilling JW,

Erdős EG (1990) The deduced protein sequence of human carboxypeptidase N high

molecular weight subunit reveals the presence of leucine-rich tandem repeats.

Journal of Biological Chemistry 265: 13-9

Tosi M, Duponchel C, Meo T, Julier C (1987) Complete cDNA sequence of human

complement C1s and close physical linkage of the homologous genes C1s and C1r.

Biochemistry 26: 8516-24

Van den Berg RH, Faber-Krol MC, Sim RB, Daha MR (1998) The first subcomponent of

complement, C1q, triggers the production of IL-8, IL-6, and MCP-1 by human umbilical vein

endothelial cells. Journal of Immunology 161: 6924-30

Vanguri P & Shin ML (1986) Activation of complement by myelin: Identification of C1

binding proteins of human myelin from the central nervous tissue.

Journal of Neurochemistry 46: 1535-41

64

Velazquez P, Cribbs DH, Poulos TL, Tenner AJ (1997) Aspartate residue 7 in amyloid -

protein is critical for classical complement pathway activation.

Nature Medicine 3: 77-9

Walker DG, Kim SU, McGeer PL (1995) Complement and cytokine gene expression in

cultured microglia derived from postmortem human brains.

Journal of Neuroscience Research 40: 478-93

Walker DG, Kim SU, McGeer PL (1998) Expression of complement C4 and C9 genes by

human astrocytes. Brain Research 809: 31-8

Walport MJ (2001) Complement. New England Journal of Medicine 344: 1058-66

Webster S, Lue LF, Brachova L, Tenner AJ, McGeer PL, Terai K, Walker DG, Bradt B,

Cooper NR, Rogers J (1997) Molecular and cellular characterization of the membrane attack

complex, C5b-9, in Alzheimer’s disease. Neurobiology of Aging 18: 415-21

Webster S, Tenner AJ, Poulos TL, Cribbs DH (1999) The mouse C1q A-chain sequence

alters b-amyloid induced complement activation. Neurobiology of Aging 20: 297-304

Wisniewski KE, Dalton EJ, McLachlan DRC, Wen GY, Wisniewski HM (1985)

Alzheimer’s disease in Down’s syndrome:clinico-pathologic studies. Neurology 17: 278-82

Wyss-Coray T & Mucke L (2002) Inflammation in neurodegenerative disease: a double-

edged sword. Neuron 35: 419-32

Yang LB, Li R, Meri S, Rogers J, Shen Y (2000) Deficiency of complement defense protein

CD59 may contribute to neurodegeneration in Alzheimer’s disease.

Journal of Neuroscience 20: 7505-9

Yasojima K, Schwab C, McGeer EG, McGeer PL (1999) Up-regulated production and

activation of the complement system in Alzheimer’s disease brain.

American Journal of Pathology 154: 927-36

Ying SC, Gewurz AT, Jiang H, Gewurz H (1993) Human serum amyloid P component

oligomers bind and activate the classical complement pathway via residues 14-26 and 76-92

of the A chain collagen-like region of C1q. Journal of Immunology 150: 169-76

Zalman LS, Wood LM, Müller-Eberhard HJ (1986) Isolation of a human erythrocyte

membrane protein capable of inhibiting expression of homologous complement

transmembrane channels. Proceedings of National Academy of Sciences, USA 83: 6975-9

Zanjani H, Finch CE, Kemper C, Atkinson J, McKeel D, Morris JC, Price JL (2005)

Complement activation in very early Alzheimer disease.

Alzheimer’s Disease Associated Disorders 19: 55-66

65

Ziccardi RJ. (1985) Demonstration of the interaction of native C1 with monomeric immuno-

globulins and C1 inhibitor. Journal of Immunology 134: 2559-63.

66