a maite - udelar
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A Maite
Agradecimientos
A Pilar y Germán por todo lo que me enseñaron de estos bichitos verdes (como dijo
Tommy un día).
A todos los compañeros del Laboratorio de Bioquímica de Facultad de Agronomía por el
apoyo y compañerismo tanto en lo que respecta a la tesis como en los momentos de
distracción. Santi, Esteban, Leti, Sabri, Yolanda, Marthita, Jorge, Maxi, Flor…
A Pedro por asistirme con el HPLC y la puesta a punto para el análisis de los MAAs,
invalorable tu apoyo!
A Omar por toda la ayuda brindada con todo lo referente a estrés oxidativo.
A Donat-P. Häder por enviarnos los estándares para el análisis de MAAs y responder más
de una duda que surgió en el camino.
A las 10 de Ciencias, por los grupos de estudio, salidas, viajes, despedidas y bienvenidas…
A mis amigas de la vida, especialmente a Maite que me “invitó” a empezar juntas esta
carrera tan linda y enriquecedora.
A mi familia por bancarme siempre.
Este trabajo comenzó con la participación en un proyecto financiado por CSIC: Incidencia
de la radiación UV sobre cianobacterias aisladas de arrozales uruguayos, y luego continuó
con una Beca de iniciación a la investigación de la ANII cuyos resultados son los que
comunico.
Como este trabajo surgió como consecuencia de los resultados obtenidos en el proyecto
CSIC, adjunto el artículo producto del mismo de la que soy segunda autora. La misma ha
sido aceptada para su publicación en la revista Advances in Microbiology.
Deseo agradecer a la Comisión Sectorial de Investigación Científica de la UdelaR y a laAgencia Nacional de Investigación e Innovación que financiaron esta investigación.
Lista de abreviaturas
APX Ascorbato peroxidasa
BHT Butil hidroxi tolueno
CAT Catalasa
DAB Diaminobenzidina
EDTA Ácido etilendiaminotetracético
ERO Especie reactiva del oxígeno
FBN Fijación biológica de nitrógeno
FS Fotosistema
FS I Fotosistema I
FS II Fotosistema II
Fv/Fm Eficiencia cuántica máxima de la fotoquímica del FS II
HEPES Ácido 4(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico
HPLC Cromatografía líquida de alta performance
MAA Aminoácido del tipo de las micosporinas
MCA Metanol cloroformo agua
MDA Malonaldehído
NBT Azul de nitrotetrazolio
PAR Radiación fotosintéticamente activa
PEG Polietilenglicol
PMSF Fluoruro de fenilmetil sulfonilo
PS Peso seco
SOD Superóxido dismutasa
TBA Ácido tiobarbitúrico
TBARS Sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico
UV Ultravioleta
1. ÍNDICE
1. Índice.................................................................................................................................................... 1
2. Resumen.............................................................................................................................................. 3
3. Introducción ...................................................................................................................................... 4
3.1. Las cianobacterias ....................................................................................................................................4
3.2. Cianobacterias y arrozales....................................................................................................................4
3.3. Radiación UV...............................................................................................................................................6
3.4. Cianobacterias y estrés...........................................................................................................................7
3.4.1. Cianobacterias y exposición a la radiación UV ....................................................................7
3.4.1.1. Reparación y defensa frente a la radiación…………………………………………..…10
3.4.2. Cianobacterias y estrés osmótico...........................................................................................14
3.5. Justificación del trabajo..................................................................................................................15
4. Objetivos ...........................................................................................................................................17
5. Materiales y métodos ...................................................................................................................18
5.1. Organismos y condiciones de crecimiento..................................................................................18
5.2. Estrés osmótico y lumínico................................................................................................................18
5.3. Extracción proteica ...............................................................................................................................18
5.4. Determinación de peso seco .............................................................................................................19
5.5. Espectro de absorción .........................................................................................................................19
5.6. Espectros de emisión y excitación de fluorescencia ...............................................................19
5.7. Evolución fotosintética de oxígeno ................................................................................................19
5.8. Parámetros de fluorescencia in vivo de clorofila ......................................................................20
5.9. Actividad nitrogenasa..........................................................................................................................20
5.10. Determinación in situ de peróxido de hidrógeno y superóxido. .....................................20
5.11. Determinación de la peroxidación lipídica...............................................................................21
5.12. Determinación de actividad de enzimas antioxidantes ......................................................21
5.13. Extracción y determinación del contenido de prolina.........................................................22
5.14. Extracción y análisis de aminoácidos del tipo de las micosporinas (MAA)................22
5.15. Análisis estadístico.............................................................................................................................22
6. Resultados........................................................................................................................................24
6.1. Espectro de absorción .........................................................................................................................24
6.2. Espectros de emisión y excitación de fluorescencia. ..............................................................24
6.3. Parámetros de fluorescencia in vivo de clorofila. .....................................................................26
6.4. Evolución fotosintética de oxígeno ................................................................................................26
6.5. Actividad nitrogenasa..........................................................................................................................26
6.6. Detección in situ de peróxido de hidrógeno y superóxido ...................................................27
6.7. Peroxidación lipídica............................................................................................................................28
6.8. Actividad de enzimas antioxidantes ..............................................................................................28
6.9. Contenido de prolina............................................................................................................................29
6.10. Aminoácidos del tipo de las Micosporinas (MAAs) ..............................................................30
7. Discusión...........................................................................................................................................32
7.1. Fotosíntesis ..............................................................................................................................................32
7.2. Fijación de nitrógeno ...........................................................................................................................34
7.3. Daño oxidativo........................................................................................................................................35
7.4. Prolina ........................................................................................................................................................37
7.5. Aminoácidos del tipo de las micosporinas..................................................................................37
8. Referencias bibliográficas..........................................................................................................40
2. Resumen
Las cianobacterias en el suelo cultivado están expuestas a diversos tipos de estrés
ambiental, lo que puede determinar una baja sobrevivencia de las mismas cuando se las
utiliza como inoculante en cultivos de arroz. En trabajos previos se evaluó el efecto de una
única condición de estrés sobre una cepa de Calothrix sp. Dado que en el arrozal, en el
suelo y el agua de inundación, las cianobacterias están expuestas a más de una condición
de estrés, en este trabajo se sometió a una la misma cepa de Calothrix sp. a la combinación
de estrés osmótico, inducido por polietilenglicol, y lumínico, por aplicación durante
distintos períodos de radiación UV-B, y se estudiaron sus efectos sobre diferentes
actividades bioquímicas. La combinación de estrés produjo cambios en la capacidad de
absorción y transferencia de energía por parte de los pigmentos fotosintéticos. El
rendimiento cuántico del fotosistema II y la evolución fotosintética del oxígeno
disminuyeron con el aumento de las condiciones de estrés, aunque la producción de O2 no
disminuyó más por la exposición a UV-B que lo que ocurrió con el estrés osmótico.
Calothrix sp. BI22 presenta aminoácidos del tipo de la micosporina constitutivos, los
cuales podrían estar funcionando como protectores contra la radiación UV-B. Sólo el estrés
osmótico disminuyó en forma drástica la actividad nitrogenasa. El contenido de prolina
aumentó con ambos estrés y no cuando se aplicaban separados. Se ajustó la técnica para la
detección in situ de peróxido de hidrógeno y superóxido que permitió observar
acumulación de este último al intensificarse las condiciones de estrés. Solo se detectó
aumento de la peroxidación lipídica cuando la exposición a estrés lumínico fue más
duradera (5h). Las actividades enzimáticas antioxidantes evaluadas siguieron diferentes
tendencias, con un aumento en la actividad catalasa y la disminución de la actividad
superóxido dismutasa. Esta cepa de Calothrix que había sido elegida como promisoria por
su tolerancia a la radiación UV-B, al ser sometida a más de un estrés simultáneamente era
afectada en características como la fijación biológica de nitrógeno. Estos resultados
demuestran que Calothrix sp. BI22 es sensible a la combinación de estrés aplicada, pero
algunas respuestas implican modificaciones fisiológicas que la preparan para preservarse
ante otra situación estresante. Esta plasticidad fenotípica que mejoría su adaptación al
agroecosistema del arrozal merece seguir estudiándose. Los resultados obtenidos en el
laboratorio permiten avanzar en la comprensión de los factores que pueden controlar la
sobrevivencia de las cianobacterias en condiciones de campo debido a la exposición a más
de una condición de estrés.
3. INTRODUCCIÓN
3.1. Las cianobacterias
Las cianobacterias son un grupo filogenéticamente primitivo de procariotas gram-
negativos. Son bacterias fotosintéticas oxigénicas, con una fotosíntesis del tipo de las
plantas superiores, algunas de las cuales son capaces de fijar dinitrógeno (Whitton y Potts,
2000). Han habitado la mayor parte de la superficie de la tierra por billones de años
(Knoll, 2008), y hoy son responsables de una parte significativa de la fijación biológica de
nitrógeno (FBN) (Ladha y Reddy, 2003). Las estimaciones en cuanto a la contribución de la
FBN al ciclo global del nitrógeno varían, pero se asume que las cianobacterias fijan
alrededor de 35 millones de toneladas de nitrógeno anualmente (Shina et al., 1996; Kumar
y Kumar, 2011). Estas bacterias son organismos ampliamente distribuidos en todo el
mundo y pueden encontrarse en hábitats extremos, desde fuentes termales a regiones
árticas (Whitton y Potts, 2000). La colonización de océanos, lagos, ríos, aguas termales y
suelos; y su presencia como organismos simbióticos de hongos y plantas, requiere una
gran capacidad de adaptarse a diversos factores ambientales. Las poblaciones de
cianobacterias ocupan un lugar importante tanto en ecosistemas acuáticos como
terrestres, logrando una fotosíntesis neta incluso en temperaturas tan bajas como -7ºC y
tan altas como 78ºC (revisado por Sinha et al., 1996). Entre todos los ecosistemas en los
que pueden ser encontradas, los suelos húmedos son un ambiente ideal para el
crecimiento de estas bacterias (Vaishampayan et al., 2001).
La diversidad de cianobacterias se refleja también a nivel genómico. Trabajos de
secuenciación en los últimos años han demostrado claramente que los genomas del filo
cianobacteria varían considerablemente en aspectos como el tamaño (~1.4-
9.1 Mbps), contenido en G + C (31 a 63%), el número de genes codificantes de
proteínas (1,214-8,446) y la proporción de nucleótidos codificantes (52-94%). Las
fluctuaciones genómicas de las cianobacterias reflejan rasgos evolutivos, de desarrollo y
adaptativos (Larsson et al., 2011).
3.2. Cianobacterias y arrozales
La independencia trófica de las cianobacterias las hace adecuadas para su uso
como biofertilizantes. Los biofertilizantes son preparaciones que contienen formas viables
de microorganismos que se aplican a semillas o al suelo. Los mejores resultados de
inoculación con cianobacterias se han obtenido al utilizar cepas o especies nativas ya que
las, especies exóticas difícilmente sobreviven cuando son introducidos en un hábitat de
dura competición y depredación por zooplancton (revisado por Irisarri, 2006).
El rol de las cianobacterias diazotrofas en la mejora de la fertilidad del suelo,
particularmente en los arrozales inundados, ha sido profusamente documentada
(Venkataraman, 1981). La existencia de un potencial agronómico de las cianobacterias en
los cultivos de arroz fue reconocida por De (1939), quien atribuyó la fertilidad natural de
los campos de arroz tropicales a la fijación biológica por estos organismos. Desde
entonces, experimentos a largo plazo y mediciones de fijación de nitrógeno confirmaron la
importancia de las cianobacterias y otros organismos fijadores de nitrógeno en el
mantenimiento de una producción de arroz, moderada pero constante en campos no
fertilizados con nitrógeno (Vaishampayan et al, 2001).
Roger (1991) muestra que la contribución de las cianobacterias al balance de
nitrógeno en campos de arroz no inoculados es significativa, con valores promedio
alrededor de 13 kg N.ha-1. En una arrozal templado en Uruguay se estimó una entrada
mínima bruta de 1 kg N.ha-1 por cultivo por el ensayo de reducción de acetileno (Irisarri,
2006). Utilizando 15N se ha demostrado que el nitrógeno fijado por las cianobacterias
realmente es tomado por las plantas durante el ciclo del cultivo (Irisarri et al., 2007). El
ecosistema del arrozal inundado constituye un ambiente favorable para el crecimiento de
cianobacterias con respecto a sus necesidades de luz, agua, alta temperatura, y
disponibilidad de nutrientes (Roger et al., 1980).
La inundación cambia la química, las características microbiológicas, y la capacidad
de suministro de nutrientes del suelo. Esto lleva a la diferenciación de macro y
microambientes diferentes en el estado redox, propiedades físicas y el estado de luz y de
nutrientes que sustenta una amplia gama de microorganismos activos. En particular, todo
tipo de microorganismos fijadores de N (aerobios, facultativos y anaerobios estrictos,
heterótrofos, fotótrofos, de vida libre y simbióticos) pueden crecer en los campos de arroz
anegados, lo que resulta en un agroecosistema único (Metting, 1992).
Si bien el arrozal constituye un ecosistema favorable para las cianobacterias, el
destino de las mismas depende de su habilidad de crecer, colonizar y sobrevivir en el
suelo. La sobrevivencia depende de la capacidad de sobreponerse a las condiciones de
crecimiento adversas como desecación, depredación por invertebrados, aplicación de
fertilizantes nitrogenados, suelos ácidos, radiación UV, pesticidas (Tomaselli y Giovanetti,
1993). De los factores del hábitat que afectan a las fluctuaciones estacionales del
fitoplancton en los campos de arroz, la más importante es la luz (Roger et al., 1980).
3.3. Radiación UV
Diferentes actividades humanas, incluyendo la producción de clorofluorocarburos,
han reducido la concentración del ozono estratosférico, lo que resulta en un aumento en el
flujo de radiación ultravioleta que alcanza la superficie de la tierra y a profundidades
significantes del océano (Smith et al., 1992). La radiación solar en la parte superior de la
atmósfera contiene una cantidad significativa de radiaciones de longitudes de onda corta,
y por ende más energética que la luz visible (400-700 nm). Las longitudes de onda en el
rango de 100-400 nm constituyen la región ultravioleta del espectro. Las más cortas de
estas longitudes de onda (UV-C, 100-280 nm) son completamente bloqueadas
(absorbidas) por el oxígeno atmosférico (O2) y el ozono (O3). Longitudes de onda en el
rango UV-B (280-315 nm) son absorbidas eficientemente pero no completamente por el
O3, mientras que longitudes de onda UV-A (315-400 nm) son absorbidas pobremente por
el O3 y son, por lo tanto, más fácilmente transmitidas a la superficie terrestre (Madronich
et al., 1998).
La exposición a la radiación UV-B ha sido una parte integral de la evolución de
organismos acuáticos. Durante la mayor parte de la evolución, estos organismos se han
visto limitados a ambientes acuáticos donde el agua ofrece cierta protección contra los
niveles dañinos de la radiación UV-B ambiental (Williamson, 1995). Si bien existe vida en
el planeta desde hace más de 3 x 109 años, no fue sino hasta 400-450 x 106 años atrás que
el ozono se volvió lo suficientemente abundante en la atmósfera para proteger la vida de
la radiación UV-B, permitiendo a los organismos acuáticos hacer la transición a hábitats
terrestres (Fischer, 1965).
El interés en el rol de la radiación UV-B en ecosistemas acuáticos y terrestres ha
aumentado por la evidencia de que los niveles de radiación UV-B han aumentado debido al
agotamiento del ozono estratosférico (Williamson, 1995). En condiciones atmosféricas de
alta penetración de radiación, entre las longitudes de la zona ecuatorial, la radiación UV-B
es 7-8 W m-2 y la UV-A 45-50 W m-2 aproximadamente, en comparación con los valores por
encima de 1100 W m-2 de las longitudes de onda visibles (Castenholz y Garcia-Pichel,
2000). Excepto por una pequeña porción del UV-A cercano, la radiación UV no es
fotosintéticamente activa. Por lo tanto, la radiación UV es algo para tolerar, contrarrestar o
evitar. Debido a que la radiación UV se vuelve progresivamente más perjudicial al
disminuir la longitud de onda, el daño potencial a las células aumenta exponencialmente
(Castenholz y Garcia-Pichel, 2000).
3.4. Cianobacterias y estrés
Las cianobacterias son en general fotoautotróficas, y al exponerse a la luz lo hacen
no solo a la porción visible del espectro solar, sino también a las longitudes de onda cortas
(UV). Por lo tanto, deben poseer mecanismos eficaces para prevenir o contrarrestar los
efectos nocivos de la radiación solar (Castenholz et al., 2000; Han et al., 2003). Dosis
perjudiciales de radiación UV-B y UV-A pueden atravesar la columna de agua y tener
efectos perjudiciales sobre los ecosistemas inundados como los arrozales. La radiación UV-
B de alta energía es la que tiene mayor potencial de daño celular tanto por sus efectos
directos sobre el ADN y las proteínas así como indirectos por la producción de especies
reactivas del oxígeno (Sinha y Häder, 2008). La radiación UV-B cuando tiene como blanco
directo al ADN, resulta en dímeros de pirimidina y otros daños mutagénicos (Castenholz y
Garcia-Pichel, 2000). Los principales procesos bioquímicos y fisiológicos afectados por la
radiación UV son la sobrevivencia, pigmentación, producción fotosintética de oxígeno,
movilidad, absorción de nitrógeno, composición de las ficobiliproteínas y absorción de
CO2. Muchas cianobacterias han desarrollado mecanismos para reducir los efectos
deletéreos de la luz UV tales como reparación del daño inducido sobre el ADN,
acumulación de enzimas detoxificantes y antioxidantes y síntesis de compuestos
protectores frente a UV (Sinha y Häder, 2008).
Las condiciones de estrés individuales son objeto de abundantes investigaciones,
sin embargo en el campo las cianobacterias están expuestas a la combinación de diferentes
tipos de estrés. Estudios recientes en plantas revelan que las respuestas moleculares y
metabólicas a una combinación de sequía y calor por ejemplo, no pueden extrapolarse
directamente de la respuesta a estos tipos de estrés aplicados individualmente (Mittler,
2006; Lüttge, 2011).
3.4.1. Cianobacterias y exposición a la radiación UV
La susceptibilidad a elevada radiación UV está determinada por la compleja
interacción entre protección, reparación y otros factores que llevan a una gran variación
en la susceptibilidad entre diferentes especies de cianobacterias (Zeeshan y Prasad, 2009).
La exposición de las cianobacterias a radiación PAR o UV-A/UV-B elevadas lleva a
la fotoinhibición de la fotosíntesis, limitando así el aprovechamiento de la energía lumínica
(Shing et al., 2002). Ha sido demostrado que la fotoinhibición del FSII implica la
degradación proteolítica de la proteína D1 que, junto con la proteína D2, constituye
el centro de reacción P680 (Latifi, 2008). En el proceso de recuperación, el precursor de la
proteína D1 es sintetizado de novo, incorporado al complejo FS II, y luego procesado para
rendir proteína D1 activa, obteniendo como resultado complejo FS II activo (Shing et al.,
2002). La incorporación de la proteína D1 recién sintetizada se ha demostrado
en numerosas cepas de cianobacterias y para diferentes estrés ambientales, entre ellos la
radiación UV-B (Latifi, 2008). El grado de fotoinhibición depende del balance entre la
inactivación del complejo FS II y su recuperación desde el estado inactivo (Shing et al.,
2002).
Se cree que las proteínas son uno de los principales blancos de la radiación UV-B,
ya que los aminoácidos aromáticos absorben en ese rango de longitudes de onda (Mitchell
y Karentz, 1993). Durante la irradiación con UV-B las proteínas pueden sufrir una serie de
modificaciones, incluyendo fotodegradación, aumento de la solubilidad en agua de
proteínas de membrana y fragmentación de cadenas peptídicas, llevando a la inactivación
de las mismas y la disrupción de sus entidades estructurales (Vincent y Neale, 2000).
Entre las proteínas de membrana sensibles a la luz UV-B se incluyen la proteína D1 del
centro de reacción del FSII y la ATPasa de la membrana plasmática (Bouchard et al., 2005).
Tanto la radiación UV-A como UV-B inducen la producción de especies reactivas
del oxígeno (EROs) en varios puntos del transporte electrónico respiratorio y
fotosintético, así como en varias reacciones bioquímicas en sistemas celulares (Zeeshan y
Prasad, 2009). Fotones altamente energéticos en el rango UV-B son absorbidos por grupos
cromofóricos de moléculas biológicamente importantes como clorofilas, ficobiliproteínas y
quinonas (Latifi, 2008). Estas moléculas pueden actuar como fotosensibilizadores para la
producción de EROs (He y Häder, 2002).
El hecho de que las cianobacterias producen constantemente oxígeno bajo
iluminación hace que sea crucial para ellas evitar el escape de electrones desde las vías
normales de transferencia al oxígeno, evitando así el estrés oxidativo tanto como sea
posible (Latifi, 2008). Durante condiciones de estrés, disminuye la tasa de fijación de CO2
por el ciclo de Calvin. Cuando se combina con alta intensidad lumínica, el flujo de
electrones en la cadena de transporte de electrones es suprimido por la insuficiencia del
aceptor de electrones NADP+, dando lugar a la producción de oxígeno singulete en el
centro de reacción FS I y la acumulación de EROs (Shina et al., 1997). Las especies
reactivas del oxígeno incluyen el radical superóxido (O2·-), el radical hidroxilo (OH·), el
peróxido de hidrógeno (H2O2) y el oxígeno singulete (1O2). Estas moléculas generan un
gran deterioro en las estructuras y funciones celulares (Zeeshan y Prasad, 2009).
La reactividad del peróxido de hidrógeno es moderada, es la ERO más estable, y se
considera que es una molécula mensajera necesaria en plantas (He y Häder, 2002). Las
especies más tóxicas son el oxígeno singulete y el radical hidroxilo, ya que tienen un
electrón no apareado que los hace altamente reactivos con las biomoléculas (Latifi, 2008).
Estas moléculas pueden iniciar la reacción en cadena de peroxidación lipídica para formar
más radicales tóxicos centrados en el oxígeno, que pueden romper hebras de la molécula
de ADN y oxidar guanosinas (He y Häder, 2002). Especialmente, el radical hidroxilo
conocido por su reactividad extrema, puede reaccionar con casi todos los tipos de
moléculas que se encuentran en los organismos vivos. El radical hidroxilo puede formarse
a partir de peróxido de hidrógeno, en presencia de superóxido e iones metálicos como Fe2+
(Thichy y Vermaas, 1999).
Se considera que la mayor producción de EROs es una característica universal de
las condiciones de estrés. Además, se cree que estas especies son una señal de alarma
general que sirve para alertar al metabolismo y activar la expresión génica para posibles
modificaciones (He y Häder, 2002). Las EROs actuarían como mensajeros secundarios
para regular la transducción de señales, tales como la respuesta de defensa antioxidante y
el aumento de la síntesis de proteínas D1 o disminución de la síntesis de la subunidad
mayor de la RubisCO (Singh et al., 2002).
El oxígeno singulete y el radical hidroxilo inician la peroxidación lipídica y la
producción de peróxidos de lípidos e hidroperóxidos lipídicos que son también altamente
reactivos (He y Häder, 2002). Los átomos de hidrógeno adyacentes a los enlaces olefínicos
son susceptibles al ataque oxidativo, especialmente aquellos entre enlaces olefínicos no
conjugados. Los lípidos son ricos en este tipo de enlaces, por lo tanto son los objetivos
principales de las reacciones oxidativas (Lütge, 2011). La oxidación lipídica es
problemática, ya que muchas reacciones químicas oxidativas no están controladas y
limitadas por enzimas y pueden mostrar tasas de reacción exponenciales. Algunos de los
productos del ataque son especies altamente reactivas que modifican las proteínas y el
ADN. Se ha demostrado que los niveles de peroxidación lipídica aumentan en condiciones
de estrés por sequía (Singh et al., 2002). Las sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico
permiten estimar el daño de lípidos de membrana, y se usó esta técnica para evaluar la
peroxidación lipídica en Calothrix sp. BI22 expuesta a la combinación de estrés. Los
hidroperóxidos y el malonaldehído (MDA) son frecuentemente considerados como
indicadores de daño en la membrana. Los hidroperóxidos son los productos iniciales de la
peroxidación lipídica y por lo general representan la mayor parte de oxígeno unido
medido por el índice de peroxidación. El MDA y una variedad de aldehídos son
reconocidos como productos secundarios derivados de la degradación de los
hidroperóxidos de lípidos (Singh et al., 2002). Las EROs también están asociadas a la
fotodescoloración de clorofilas, degradación de ficobiliproteínas e inhibición del
crecimiento (Castenholz y Garcia-Pichel, 2000).
La disminución de la actividad fotosintética de cianobacterias causada por UV-B es
ocasionada por diversos factores: la disrupción de la integridad de la membrana celular, la
inhibición de la enzima RubisCO (ya sea por inactivación o destrucción), menor suministro
de ATP y NADPH2, fotodestrucción de pigmentos, inactivación del centro de reacción del
FSII y degradación proteolítica de las proteínas D1 y D2 (Shina et al., 1997; Han et al.,
2003, Castenholz et al., 2000). Varias enzimas del ciclo de Calvin son extremadamente
sensibles al peróxido de hidrógeno, los elevados niveles de éste radical inhiben
directamente la fijación de CO2 (Scandalios, 1993).
3.4.1.1. Reparación y defensa frente a la radiación UV
Los factores clave en la tolerancia a la radiación UV-B son la presencia de
pigmentos que absorben luz UV-B, como scitonemina y aminoácidos del tipo de la
micosporina, la regulación de los niveles de las especies reactivas del oxígeno y la
actividad de antioxidantes, y mecanismos efectivos de reparación del fotosistema II
(Zeeshan et al., 2009).
Existen numerosos informes sobre el movimiento hacia abajo de cianobacterias
móviles "oscilatorias" de las superficies del tapete microbiano o en los sedimentos blandos
durante los períodos de la radiación solar. Si bien esos movimientos ascienden solo a 1mm
o menos, la atenuación de la luz visible o la radiación UV en esa corta distancia es extrema.
Ejemplos de estas cianobacterias son Oscillatoria sp. y Spirulina cf. subsalsa (Castenholz y
Garcia-Pichel, 2000). Algunas cianobacterias planctónicas presentan vacuolas gaseosas.
Éstas son conocidas por ser capaces de regular ligeramente su posicionamiento vertical en
la columna de agua. Son movimientos que ocurren diariamente de manera natural para
evitar los períodos de incidencia de alta irradiación solar (Ehling-Schulz y Scherer, 2010).
La aclimatación de las células a la radiación UV puede implicar mecanismos de
reparación activos, mediante los cuales se sustituyen sus blancos dañados o son reparados
sin la necesidad de sintetizar de novo todos sus componentes. Alternativamente, la
expresión aumentada de las proteínas dañadas, o la posible síntesis de formas resistentes
a radiación UV de las mismas también pueden estar involucradas en la aclimatación
(Pattanaik et al., 2007). Estos mecanismos de síntesis y reparación no son constitutivos;
esto es evidente al observar el curso temporal del crecimiento luego de la exposición a la
radiación UV, en el cual se observa una depresión inicial del crecimiento seguida por la
recuperación en cuestión de horas/días (Castenholz et al., 2000). La exposición a la
radiación UV promueve la síntesis de novo de algunas proteínas conocidas (RecA,
chaperonas, proteínas D1 y D2) y muchos péptidos no identificados (Pattanaik et al.,
2007).
Aunque la producción de especies de oxígeno es sólo varios puntos porcentuales
por debajo del intercambio de oxígeno total, su barrido eficaz es indispensable para la
supervivencia de las células bajo condiciones aeróbicas (Obinger, 1998). Para prevenir
esos efectos dañinos causados por las EROs, los organismos desarrollaron extintores de
radicales y antioxidantes que proveen protección capturando esos radicales o especies
reactivas del oxígeno (Zeeshan y Prasad, 2009). Las moléculas antioxidantes incluyen
ascorbato, glutatión reducido, carotenoides, tocoferoles; y las enzimas antioxidantes
incluyen la superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT), glutatión peroxidasa y las
enzimas involucradas en el ciclo del ascorbato y glutatión, como la ascorbato peroxidasa
(APX), monodehidroascorbato peroxidasa (MDHAR), dehidroascorbato reductasa (DHAR)
y glutatión reductasa (GR). Sin embargo, las defensas antioxidantes no enzimáticas no se
consideran como los agentes más eficientes (Pattanaik et al., 2007). La regulación
transcripcional y traduccional de los genes antioxidantes está estrechamente relacionada
con los cambios en la generación de EROs in vivo (He y Häder, 2002). El superóxido es
eficientemente barrido por la SOD, la actividad de esta enzima es suficiente para limitar el
daño inducido por este radical (Canini et al., 1992). Las enzimas CAT y APX son las
principales enzimas con actividad de barrido del peróxido de hidrógeno (Tichy y Vermaas,
1999). La SOD se ha asociado con la protección contra los efectos tóxicos de oxígeno en
todos los organismos aeróbicos (Eloff et al., 1976). Cuando el equilibrio entre los niveles
de oxidantes y la producción de antioxidante se pierde, los organismos sufren una
variedad de daños que van desde, por ejemplo, la muerte celular de las
bacterias a patologías graves en los organismos superiores (Latifi, 2008).
Como las cianobacterias fueron los primeros procariotas fotosintéticos, es
probable que durante su evolución, hayan enfrentado ambientes con alta radiación solar
UV-B adquiriendo así la habilidad de acumular moléculas de detección de UV-B/UV-A para
atenuar el daño inducido por dicha radiación (Zeeshan y Prasad, 2009). Es conocido en
muchos organismos el uso de compuestos que absorben radiación UV como protectores
solares. Esto representa un mecanismo pasivo de protección; la radiación UV es, hasta
cierto punto, absorbida por dichos protectores sin poder interaccionar con sus blancos
celulares potenciales (Castenholz et al., 2000).
La scitonemina es un pigmento que se ubica en la vaina extracelular de algunas
cianobacterias. Éste presenta máximos de absorción en el UV-A y UV-C, así como una
absorción sustancial en el UV-B (Sinha y Häder, 2006). La síntesis de scitonemina es
inducida por radiación UV-A principalmente (Flemming y Castenholz, 2007). Este
pigmento actúa como protector solar (Garcia-Pichel et al., 1992), al absorber parte de la
radiación UV incidente. Se han sugerido muchos otros compuestos y estructuras en
cianobacterias con posibles funciones de protección solar, como por ejemplo los depósitos
de CaCO3, vesículas de gas intracelulares, carotenoides, FeCl3 y un pigmento marrón que es
liberado al medio (Castenholz y Garcia-Pichel, 2000).
Shibata (1969) descubrió que en células cianobacterianas se acumulaban
pigmentos incoloros en grandes cantidades. Ahora se sabe que dichos compuestos
pertenecen a la familia de los derivados de aminoácidos del tipo de las micosporinas
(MAAs), los cuales reducen la radiación dañina que llega a las células (Jiang et al., 2008).
Estos compuestos de bajo peso molecular, solubles en agua, tienen un único máximo de
absorción en el rango de radiaciones solares del UV. Los MAAs monosustituídos tienen un
máximo de absorción alrededor de los 310 nm, mientras que los bisustituídos tienen
máximos de absorción a longitudes de onda mayores (entre 320 y 360 nm) (Castenholz et
al., 2000). Su síntesis se origina probablemente en la primer parte de la vía del shikimato
(Oren y Gunde-Cimerman, 2007). Hongos, micro y macroalgas eucariotas y líquenes
presentan grandes concentraciones de MAAs, también ocurren en una variedad de
invertebrados marinos, en los que se cree que fueron obtenidos de la dieta (Rezanka et al.,
2004). Bajo todas las condiciones de crecimiento, las cianobacterias parecen tener un nivel
constitutivo de MAAs, el cual puede aumentar rápidamente luego de una exposición a
radiación UV-A/B con un máximo a 320 nm (Castenholz et al., 2000). La concentración de
los protectores solares no es muy alta, menos del 1% del peso seco en la mayoría de los
casos (Oren y Gunde-Cimerman, 2007). Como pequeños solutos en el citoplasma, están
obligados a ejercer una cierta presión osmótica intracelular y contribuir a la turgencia, en
consecuencia su acumulación en grandes cantidades puede causar efectos fisiológicos
secundarios; por lo que es necesario regular dicha acumulación para mantener la
homeostasis (Potrwich y García-Pichel, 1999). Esto es consistente con el hecho de
poblaciones de cianobacterias halotolerantes tienen contenidos de MAAs inusualmente
altos, y con el descubrimiento que un aumento en la salinidad del medio incrementa el
contenido de MAAs en Microcoleus chtonoplastes tanto en condiciones basales como
inducidas por UV (Oren y Gunde-Cimerman, 2007). La ventaja adaptativa obtenida al
evadir las limitaciones osmóticas y el aumento en la eficiencia óptica puede haber llevado
a la evolución de MAAs extracelulares (Castenholz et al., 2000).
Inicialmente a los MAAs se les atribuyeron la función de protectores solares
naturales, luego se le sumaron roles adicionales. Por ejemplo, pueden servir como
molécula antioxidante barriendo radicales tóxicos del oxígeno, funcionan como solutos
compatibles para proteger las células del estrés salino, están involucrados en la protección
contra el estrés térmico o por desecación en algunos organismos, así como también
pueden servir como reserva intracelular de nitrógeno (Oren y Gunde-Cimerman, 2007).
Los osmolitos compstibles son moléculas orgánicas que demuestran en
concentraciones altas compatibilidad con el metabolismo celular y su acumulación se
observa frecuentemente en la aclimatación de los organismos a condiciones ambientales
adversas (Klähn y Hagemann, 2011). Una respuesta fisiológica frente a estrés por
desecación es la síntesis de osmolitos compatibles que estabilizan macromoléculas y
membranas (Lüttge, 2011). El aminoácido prolina es esencial para el metabolismo
primario, su acumulación está relacionada a condiciones desfavorables en plantas
(Szabados y Savouré, 2009) y cianobacterias (Chris et al., 2006). La acumulación de
prolina en plantas ha sido reportada durante condiciones de sequía, alta salinidad, elevada
irradiancia y radiación UV, metales pesados, estrés oxidativo y en respuesta a estrés
abiótico (Szabados et al., 2010). Si bien la prolina ha sido considerada como un osmolito
compatible, los resultados recientes resaltan sus múltiples funciones en la adaptación al
estrés, la recuperación y señalización. La estabilización de las proteínas y complejos
proteicos en los cloroplastos y el citosol de las plantas, la protección del aparato
fotosintético y enzimas que intervienen en la destoxificación de especies reactivas del
oxígeno son algunas de las funciones importantes de la acumulación de prolina durante el
estrés. Además de modular las respuestas a estrés abiótico y biótico, este aminoácido
parece funcionar como una señal metabólica que regula los pools metabólicos y el
equilibrio redox, controla la expresión de numerosos genes y el crecimiento, influenciando
el desarrollo en plantas (Szabados y Savouré, 2009). En condiciones de estrés salino se ha
propuesto que este aminoácido protege membranas al interaccionar con fosfolípidos
(Fatma et al., 2007). Estos mismos autores indicaron que los metales pesados, pesticidas y
estrés salino inducen un aumento en el contenido intracelular de prolina en la
cianobacteria Westiellopsis prolifica, haciéndola más resistente al estrés ambiental.
3.4.2 Cianobacterias y estrés osmótico
Csonka (1989) define al estrés osmótico como una disminución o un aumento de la
fuerza osmótica del ambiente en que vive un organismo, y define regulación osmótica u
osmorregulación a los procesos activos llevados a cabo por los microorganismos para
hacer frente al estrés osmótico. La fuerza osmótica del medio ambiente es uno de los
parámetros físicos que determina la capacidad de los organismos de proliferar en un
hábitat determinado (Potts, 2001).
La exposición de las células a una elevada osmolaridad exterior resulta en el eflujo
de agua del interior, lo que produce la reducción en la presión de turgencia y la
contracción del volumen citoplasmático. Como consecuencia de esto, la concentración de
todos los metabolitos intracelulares aumenta, esto puede ser inhibitorio para procesos
celulares (ej. Inhibidores de enzimas específicas pueden alcanzar concentraciones
nocivas) o el aumento de las concentraciones de los iones puede llegar a ser tóxico
(Csonka, 1989). La alteración pasiva del volumen celular no es adecuada para la
adaptación a cambios en la osmolaridad en el ambiente. En lugar de una regulación de
volumen pasivo, los organismos por lo general responden al estrés osmótico mediante el
aumento de las concentraciones de un número limitado de solutos. Existen notables
similitudes entre las bacterias y las plantas en sus respuestas celulares al estrés osmótico,
porque los organismos de ambos reinos acumulan el mismo conjunto de solutos
citoplasmáticos con la exposición a condiciones de elevada concentración de moléculas
osmóticamente activas (estrés hiperosmótico) (Close y Lammers, 1993). Dado que las
moléculas que se acumulan en condiciones de estrés osmótico no son inhibidoras de los
procesos celulares, han sido denominadas solutos compatibles. Está ampliamente
aceptado que la acumulación intracelular de solutos sirve como un medio para mantener
la turgencia cuando el potencial químico del agua del medio disminuye (Close y Lammers,
1993). Los solutos compatibles destacados encontrados en las bacterias son los iones K+,
los aminoácidos glutamato, glutamina, prolina, aminobutirato y alanina, la amina
cuaternaria glicinbetaína y otros derivados y los azúcares sacarosa, trehalosa y
glucosilglicerol. Como se espera de los compuestos que se acumulan en altas
concentraciones intracelulares, los solutos compatibles no son capaces de atravesar las
membranas celulares rápidamente sin la ayuda de los sistemas de transporte (Close y
Lammers, 1993). En la mayoría de los casos los solutos compatibles no llevan una carga
eléctrica neta cerca de pH 7, lo cual es beneficioso porque las moléculas sin carga se
pueden acumular a las altas concentraciones intracelulares, sin perturbar en gran medida
las estructuras de las macromoléculas celulares. Sin embargo, los iones K+ y el glutamato
son notables excepciones a esta generalización, y estos dos solutos no pueden ofrecer la
protección eficaz contra el estrés hiperosmótico como algunos de los metabolitos sin carga
(Csonka, 1989).
Los solutos compatibles pueden ser acumulados por las bacterias por síntesis de
novo o por transporte desde el medio de cultivo. Existen diferencias en los efectos de
varios solutos compatibles en la tolerancia al estrés osmótico de las células, ya que algunos
pueden provocar una estimulación dramática de las tasas de crecimiento de las células en
los medios de cultivo de alta osmolaridad cuando se añaden a la medio, mientras que otros
no tienen efectos detectables sobre el crecimiento de las células. (Lüttge, 2011).
Es posible que las sustancias que pueden paliar la inhibición osmótica tengan
cierto grado de interacción especial con macromoléculas celulares resultando en una
mayor estabilidad de estas macromoléculas en las células cultivadas en medios de alta
osmolaridad, por esto se los llama osmoprotectores. (Szabados y Savouré, 2009). Se ha
propuesto también que la porción alifática del anillo de la prolina se une a residuos
apolares de proteínas a través de interacciones hidrofóbicas, y debido a los grupos
cargados carboxilo y amino, la prolina interacciona con el agua. Esta interacción resulta en
proteínas con una cubierta hidrofílica que mejora su solubilidad (Csonka, 1989).
Fernandes et al. (1993) observaron la disminución del crecimiento de Anabaena
sp. L-31 a causa del estrés osmótico impuesto con sacarosa. Este estrés no tuvo efecto
inhibitorio sobre la actividad nitrogenasa, por el contrario ésta aumenta
significativamente (2,2 a 2,5 veces). También observaron la inducción y represión de
proteínas en respuesta al estrés osmótico (en gel en gradiente de poliacrilamida).
Allakhverdiev et al. (2000) comunicaron que el estrés osmótico debido a sorbitol 1M
inactivó la maquinaria de evolución de O2 del FS II e interrumpió la actividad de transporte
del fotosistema I en células de Synechococcus intactas. El efecto fue mayor en el FS II que
en el FS I.
3.5. Justificación del trabajo
La contribución de las cianobacterias a la economía nitrogenada de arrozales en
nuestro país ha sido estudiada (Irisarri et al., 2007). Sin embargo, la viabilidad y el
potencial fijador de nitrógeno de estos microorganismos son afectados por diferentes
factores de estrés (Lütge, 2011). Si bien son muy abundantes las comunicaciones sobre el
efecto de la luz UV así como el estrés hídrico sobre las cianobacterias, son más escasos los
reportes sobre las consecuencias de someter a las mismas a más de un estrés
simultáneamente (Chris et al., 2006). Estos mismos autores demostraron que la
susceptibilidad de un organismo a un estrés en particular puede verse alterada debido a
otros estrés, como el caso de una cianobacteria con heterocisto del género
Cylindrospermum que sometida previamente a estrés salino fue menos inhibida por luz
UV-B que una control. Como las cianobacterias en el suelo están sometidas a más de una
condición de estrés, la hipótesis de este trabajo fue que la respuesta de una cianobacteria
en el laboratorio a dos tipos de estrés diferentes sería distinta a la que tendría de estar
expuesta solamente a uno de ellos. Para comprobarlo se ensayó simultáneamente el efecto
de la exposición a luz UV-B y al estrés osmótico (inducido por polietilenglicol, PEG) sobre
una cianobacteria del género Calothrix aislada de suelo de un arrozal del este uruguayo.
Las dosis de UV-B usadas en los experimentos fueron comparables a la radiación UV-B que
alcanza la latitud de Uruguay en verano durante la época de crecimiento del arroz (Aubriot
et al., 2005).
4. OBJETIVOS
Objetivo general:
Evaluar algunos efectos de la combinación de estrés osmótico y por luz UV-B en Calothrix
sp. BI22.
Como objetivos específicos se plantearon:
1. Determinar el efecto sobre la fotosíntesis y actividad nitrogenasa de la luz UV-B
sumado al estrés osmótico sobre este aislamiento.
2. Determinar la producción de compuestos fotoprotectores inducidos por la luz UV-
B en Calothrix BI22.
3. Evaluar la producción de EROs y la actividad de algunas enzimas detoxificantes
inducidas por ambos estrés, como catalasa, ascorbato peroxidasa y superóxido
dismutasa.
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. Organismos y condiciones de crecimiento
Calothrix sp. BI22 es una cianobacteria filamentosa formadora de heterocistos, que
fue aislada de un arrozal de Treinta y Tres (Irisarri et al., 1999). Los cultivos fueron
crecidos de forma axénica en medio BG 11 sin nitrógeno (Rippka et al., 1979) usando
como tampón HEPES 10 mM pH 7.6. La temperatura de crecimiento fue 25±2 °C, y la luz
blanca fue aportada por lámparas fluorescentes con una densidad de flujo de fotones de 50
μE m-2s−1. Los cultivos en crecimiento exponencial fueron utilizados para los diferentes
experimentos. Las muestras de cultivo fueron tomadas bajo condiciones de esterilidad
luego de homogeneizarlos con un mortero Potter y la biomasa fue estimada por peso seco.
5.2. Estrés osmótico y lumínico
Las cianobacterias fueron sometidas a estrés osmótico consistente en agregar
polietilen glicol (PEG) 8000 al 10% al medio BG11 durante 24 h en agitación constante.
Luego la suspensión de cianobacterias homogeneizadas fue vertida en una placa de petri
abierta (22 cm Ө). Los cultivos fueron expuestos a radiación UV-B artificial (0.034 mWcm-
2) y UV-A (15.54 μWcm-2) durante 1 h y 3 h con agitación constante para evitar el auto-
sombreado. Se reservó cultivo sin estrés lumínico como control de estrés osmótico. La
radiación UV-B fue provista por una lámpara Hi-Tech lampG25T8E, Japón. La irradiancia
de la fuente lumínica fue determinada con un radiómetro/fotómetro IL1400A
(International Light, Inc.) equipado con sensores UVAR y UVBR. Todos los experimentos se
realizaron por duplicado y en cada caso se realizaron tres repeticiones, excepto que se
aclare lo contrario en el texto.
5.3. Extracción proteica
Luego de la exposición a la combinación de estreses, los cultivos fueron
centrifugados (6000g durante 10 min) y los pellets resuspendidos en buffer de extracción
(100 mM Tris; 50 mM EDTA; NaCl 100 mM; PMSF 1% fc; pH 8) y sonicados tres veces con
un homogeneizador ultrasónico 4710 Series (Cole Parmer Inst. Co., Chicago) durante 30s y
conservados a 4°C overnight. Este proceso fue llevado a cabo en un baño de hielo para
evitar el calentamiento de las muestras. Por último se centrifugó durante 10 min a 4°C
(8000 g). El extracto proteico fue cuantificado por el método de Lowry et al., (1951) y
conservado a -80°C hasta su uso.
5.4. Determinación de peso seco
Los cultivos celulares fueron concentrados por centrifugación (15 min 20000g).
Los pellets fueron lavados dos veces con agua destilada estéril y recogidos por
centrifugación. Las muestras fueron secadas en microtubos eppendorff de 1 mL a 60 ºC
por al menos 3 días, para permitir la completa evaporación del líquido antes del pesado.
5.5. Espectro de absorción
Las suspensiones de cultivo previamente sometidas al tratamiento con PEG fueron
homogeneizadas y se mezclaron con agarosa 0,7% (w/v) en una celda de cuarzo de 3 mL.
A estos cultivos se les realizó un espectro de barrido (300-750 nm) con diferentes
períodos de tiempo de exposición a luz UV-B (Donkor y Häder, 1996). El objetivo de este
estudio fue ver el efecto de la exposición a los tipos de estrés aplicados sobre los
pigmentos fotosintéticos.
5.6. Espectros de emisión y excitación de fluorescencia
A los cultivos inmersos en agarosa como se describió previamente, se les realizó
los espectros de emisión y excitación de fluorescencia que informan de aquellos pigmentos
que únicamente fluorescen in vivo. Los espectros de emisión fueron medidos con un
espectrofluorímetro (RF-1501, Shimadzu) a temperatura ambiente con una longitud de
onda de excitación de 445 o 580 nm y una longitud de onda de emisión entre 600 y 780
nm. Cuando la excitación se hace con luz de 440 nm hay menor rendimiento de la
fluorescencia que cuando se excita con 580nm, en parte debido a menor intensidad de la
luz de excitación, pero también a la menor eficiencia de la clorofila a para captar
directamente la energía luminosa.
El intervalo de longitudes de onda de excitación para el espectro de excitación fue
400-660 nm y la longitud de onda de emisión 685 nm. Las suspensiones de cultivo
homogeneizadas se mezclaron con agarosa 0,7% (w/v) en una celda de cuarzo de 3 mL
(Serrano, 1992).
5.7. Evolución fotosintética de oxígeno
La fotosíntesis fue medida como evolución de O2 con un electrodo de O2 tipo Clark
(Hansatech Instruments Ltd.) como se describe en Irisarri et al., 1999. Alícuotas de
suspensiones celulares de 2 ml, previamente expuestas a tratamientos de estrés con UV-B
y PEG 8000, fueron colocadas en una cubeta a 27ºC e iluminadas con una densidad de flujo
cuántico de 400 μE m−2 s−1.
5.8. Parámetros de fluorescencia in vivo de clorofila
La medición de la fluorescencia emitida por las clorofilas es una técnica útil, rápida
y no invasiva que permite determinar el estado fisiológico de las plantas. Así, algunos
parámetros fotosintéticos, en particular la eficiencia cuántica máxima de la fotoquímica
del FSII (Fv/Fm), se usan para monitorear el estado de los organismos fotosintéticos
cuando se encuentran sometidas a distintos tipos de estrés, pudiendo proveer información
del estatus de aclimatación.
La fluorescencia in vivo de la clorofila de las cianobacterias se midió con un
fluorímetro FMSI (Hansatech Instrumento Ltd., King's Lynn, Reino Unido) según lo
descrito por Häder et al. (1999). La medición de fluorescencia de clorofila se realizó
utilizando luz actínica saturante (8000 μmol m-2 s-1) durante 0,8 s. Antes de la medición,
las cianobacterias fueron adaptadas 30 minutos a la oscuridad. Los parámetros de
fluorescencia se calcularon según lo descrito por Rohácek y Barták (1999).
5.9. Actividad nitrogenasa
Para determinar la respuesta de la actividad nitrogenasa al estrés osmótico y
lumínico, se realizó el ensayo de reducción de acetileno. Alícuotas de 10 mL de
suspensiones celulares se colocaron en viales de 22 mL luego de la exposición a las
situaciones de estrés ya mencionadas. El tiempo de incubación con acetileno fue de 60
min. La formación de etileno fue medida con un cromatógrafo de gases HP 5890 equipado
con una columna Porapack N. La actividad nitrogenasa se expresó como μmol etileno
mg−1peso seco h−1 (Irisarri et al., 1999).
5.10. Determinación in situ de peróxido de hidrógeno y superóxido
La detección in situ de H2O2 se hizo siguiendo el protocolo de Thordal-Christensen
et al. (1997). Los filamentos se infiltraron con ayuda de vacío con buffer fosfato de potasio
10 mM, Na2N310 mM y 3,3'diaminobenzidina (DAB) 0 .1% (w/v), pH 7 .8, en un volumen
suficiente para cubrirlos (aproximadamente 3 mL) y se incubaron toda la noche en
oscuridad. Para preservar el precipitado y mejorar la visualización, las cianobacterias se
dejaron en ácido tricloroacético 0,15% en etanol:cloroformo (4:1) durante 5 días,
cambiando la solución de decoloración a las 24 h.
La detección del radical superóxido (O2·-) se realizó siguiendo el protocolo
propuesto por Jabs et al., (1996). Los filamentos se infiltraron con ayuda de vacío en
tampón fosfato 10mM pH 7.8, NaN3 10 mM conteniendo nitro azul de tetrazolio (NBT)
0.1%, en un volumen suficiente para cubrirlos (aproximadamente 3 mL) y se incubaron
bajo un tubo de luz de 20W durante 20 min. Para preservar el precipitado y mejorar la
visualización, las cianobacterias se dejaron en ácido tricloroacético 0,15% en
etanol:cloroformo (4:1) durante 5 días cambiando la solución de decoloración a las 24 h.
La visualización de los filamentos se realizó en un microscopio Nikon labophot-2.
5.11. Determinación de la peroxidación lipídica
Las sustancias que reaccionan con el ácido tiobartitúrico (TBARS) permiten
estimar el daño de lípidos de membrana, y se usó esta técnica para evaluar la peroxidación
lipídica en Calothrix BI22 expuesta a la combinación de estreses.
Los lípidos peroxidados se determinaron a través de las sustancia reactivas al
ácido tiobarbitúrico (TBARS), según Minotti y Aust, 1987. Para ello se maceraron 0.15 g de
homogenado con 1 mL de ácido metafosfórico al 5% (w/v) y 30 μL de butil hidroxi tolueno
(BHT) al 2% (w/v) en etanol. Se centrifugó a 15000 g durante 20 min a 4ºC.
Para el desarrollo del cromógeno se mezclaron 500 μL del sobrenadante con 50 μL
de BHT al (2%), 250μL de ácido tiobarbitúrico (TBA) al 1% (w/v) disuelto en NaOH
50mM- y 250 μL de HCl al 25% (v/v). La mezcla de reacción se incubó a 95 ºC durante 30
minutos. La reacción se detuvo al enfriar las muestras en baño con hielo. Se preparó un
blanco reemplazando la muestra con medio de extracción (ácido metafosfórico). Los
controles se hicieron reemplazando TBA por NaOH 50 mM. Para la determinación se
extrajo el cromógeno con 1.5 mL de 1-butanol y se agitó vigorosamente. Se extrajo la fase
orgánica y se leyó la absorbancia a 532 nm según Rustérucci et al., 1996.
5.12. Determinación de actividad de enzimas antioxidantes
La actividad CAT se determinó mediante seguimiento del consumo de H2O2
(coeficiente de extinción 39.4 mM cm-1) a 240 nm durante 5 min. La mezcla de reacción
contenía buffer fosfato de potasio 100 mM (pH 7.0) y extracto proteico en un volumen de
3mL. La reacción se inició al agregar 10 μL de H2O2 30% (w/v) (Rao et al; 1996).
La actividad de la enzima APX se determinó por seguimiento del descenso en la
absorción a 290 nm durante 3 min (coeficiente de extinción 2.8 mM cm-1). La mezcla de
reacción de 1 mL contenía buffer fosfato de potasio 100 mM (pH 7.5), ascorbato 0.5 mM,
H2O2 0.2 mM, a 25°C y extracto proteico (Chen y Asada, 1989; Rao et al; 1996).
La determinación de la actividad de la enzima SOD se basó en el método de
Beauchamp y Fridovich (1971) modificado por Dhindsa y Matowe (1981), que mide la
inhibición en la reducción fotoquímica del NBT. En el ensayo espectrofotométrico la
mezcla de reacción de 1 mL contenía buffer fosfato 50 mM (pH 7.8), EDTA 0.1 mM,
metionina 13 mM, NBT 75 μM, riboflavina 2 μM, y extracto proteico. La riboflavina se
agregó por último a la mezcla y la reacción se inició al poner los tubos bajo dos lámparas
fluorescentes de 15 W. La reacción se frenó a los 10 min tras remover los tubos de la luz.
Reacciones iluminadas y sin iluminar sin sobrenadante sirvieron como estándares de
calibración. El producto de reacción fue medido a 560 nm. El volumen de sobrenadante
correspondiente a un 50% de inhibición de la reacción fue asignado como 1 unidad
enzimática (Beauchamp y Fridovich, 1971; Donahue et al; 1997).
5.13. Extracción y determinación del contenido de prolina
La extracción de prolina se realizó según Charest y Phan (1990). Se maceró 0.1 g
de muestra en 1 mL de una mezcla de metanol-cloroformo-agua (MCA 12:5:1). El
homogenado se centrifugó a 5000 g durante 2 minutos a temperatura ambiente, se recogió
el sobrenadante y al precipitado se adicionaron 2mL de MCA se agitó durante un minuto,
se centrifugó nuevamente y el sobrenadante se juntó con el sobrenadante anterior.
Seguidamente se adicionó 0,375 mL de agua y 0,25 mL de cloroformo, se centrifugó a
5000g por 1 min. La fase acuosa (superior) se utilizó para la determinación de prolina.
La prolina se cuantificó según Troll y Lindsley (1955). A la fase acuosa que
contenía prolina se le agregaron 1 mL de ácido acético y 1 mL de reactivo de ninhidrina
ácida, consistente en H3PO4 6 M; ácido acético 12.6 M y ninhidrina 0.14 M. Se usaron tubos
con tapón de rosca que se calentaron en baño de agua a 90ºC durante 1 h y se dejaron
enfriar a temperatura ambiente. A cada tubo se le adicionó 1 mL de tolueno, se agitó
vigorosamente durante 5 min y se dejó decantar hasta la formación de dos fases
(aproximadamente 12 h). Para cuantificar la prolina se tomaron muestras de la fase
superior y se leyó la absorbancia a 515 nm. Como estándar se usó L-prolina (SIGMA).
5.14. Extracción y análisis de aminoácidos del tipo de las micosporinas (MAA)
La extracción y determinación de estos aminoácidos se realizó según Sinha et al.
(1999) con algunas modificaciones. Las células fueron colectadas por centrifugación a
8000 g por 5 min a temperatura ambiente. Los pellets se incubaron en metanol 20% (v/v)
a 45°C durante 2,5 horas y luego se centrifugaron (6000 g; 5 min) a 6-8°C. Este proceso se
repitió y los sobrenadantes se juntaron. Los extractos se filtraron usando membranas de
nitrocelulosa (0,45 μm) y se caracterizaron por HPLC (Shimadzu SPD – 10A UV-VIS
detector. Kyoto, Japón) equipado con una columna LiChrosorb RP-18. La longitud de onda
de detección fue 330 nm con un flujo de 1,0 mLmin-1 a 25ºC con una fase móvil de ácido
acético al 0,2 %. Los aminoácidos separados por la columna fueron caracterizados con un
detector de arreglo de fotodiodo. La identificación de los MAAs se realizó comparando el
espectro de absorción y los tiempos de retención con estándares secundarios obtenidos de
Corallina officinalis (shinorine y palythine) y Porphyra sp. (porphyra-334 y shinorine).
Estos estándares fueron amablemente proporcionados por el Dr. Donat-P. Häder de
Alexander Universität (Erlangen, Germany). También se consultó para su identificación la
base de datos http://www.biologie.uni-erlangen.de/botanik1/index.html.
5.15. Análisis estadístico.
Los análisis estadísticos para cada parámetro estudiado (producción de O2, Fv/Fm,
actividad nitrogenasa, TBARS, prolina, activides enzimáticas) se realizaron con el
programa estadístico INFOSTAT® 2009. Se realizaron análisis de varianza y las
repeticiones fueron 3, salvo que se establezca lo contrario en el texto. La distribución de
los datos fue normal y en ningún caso fue necesario transformarlos. Cuando las diferencias
fueron significativas, las medias para cada tratamiento se compararon con el test de Tukey
(α=0,05).
6. RESULTADOS
6.1. Espectro de absorción.
En el espectro realizado con cianobacterias expuestas a estrés osmótico con PEG
por 24 h y distintas dosis de UV-B (Fig. 1) se observan los picos correspondientes a
clorofila a (681,5 nm), ficocianinas (626 nm), ficoeritrinas (566,5 nm), carotenoides
(picos entre 450 y 510 nm) y clorofila a- banda de Soret (442,5nm). En los tratamientos a
los que se adiciona el estrés por radiación UV se ve un aumento en la absorción, y la
pérdida de los picos correspondientes a ficoeritrinas y carotenoides (Tabla 1).
Figura 1. Efecto de la luz UV (diferentes tiempos de exposición) en la pigmentación de Calothrix sp. BI22 previamente sometida a estrés osmótico. La figura muestra el espectro de absorción de los homogenados de células.
Tabla 1. Picos obtenidos en el espectro de absorción.de Calothrix BI22 sometda a distintos tiempos de exposición a UV-B después de crecer por 24 h en medio con polietilen glicol (PEG)
24h PEG 0h UV 24h PEG 1h UV 24h PEG 3h UV
Longitud de onda (λ)
Absorción Longitud de onda (λ)
Absorción Longitud de onda (λ)
Absorción
681,5 0,511 681,5 0,564 681,5 0,565626 0,462 626 0,527 626 0,527
566,5 0,46 566,5 - 566,5 -
500 0,475 500 - 500 -443 0,516 443 0,669 443 0,681
6.2. Espectros de emisión y excitación de fluorescencia.
La figura 2 muestra el espectro de excitación, o de acción, de la fluorescencia de la
clorofila a a 685nm cuando una suspensión de Calothrix sp. BI22 es excitada con luz de
longitudes de onda entre 400 y 660nm. El mismo presenta dos picos, a 455, que puede
deberse a una mezcla de clorofila y carotenoides, y a 648nm, causado por la aloficocianina.
Se observa una disminución en el área del pico a los 648nm al aumentar el estrés por UV-B
impuesto a la suspensión de cianobacterias.
Figura 2. Espectro de excitación de fluorescencia de la clorofila a a 685nm de una suspensión de Calothrix sp. BI22. Los tratamientos fueron 24h PEG 0h UV ( ), 24h PEG 1 h UV ( ) y 24h PEG 3h UV ( ).
En la figura 3a se presenta el espectro de emisión de fluorescencia entre 600 y
780nm de una suspensión de células de la cianobacteria Calothrix sp. BI22 excitadas con
luz anaranjada (580nm), absorbida principalmente por la C-ficocianina. Cuando la
iluminación se realiza con luz de 580nm, absorbida principalmente por las ficobilinas, el
espectro presenta un máximo de emisión a 650 nm atribuible a la emisión de fluorescencia
de la aloficocianina (fig. 3a). Se observa un aumento en el área del pico y un pequeño
corrimiento a longitudes de onda menores (651 a 649nm). En la figura 3 b se observa el
espectro de emisión de fluorescencia entre 600 y 780nm de una suspensión de células de
la cianobacteria Calothrix sp. BI122 excitadas con luz azul (445nm), absorbida únicamente
por la clorofila a. El espectro de emisión presenta un solo pico a 675nm, atribuible a la
clorofila a del FS II (Fig 3b). No hay corrimiento considerable del pico, solo pequeños
cambios en su área.
Figura 3. Espectro de emisión de fluorescencia de una suspensión de células de la cianobacteria Calothrix sp. BI22. Las células se excitaron con luz monocromática de a) 580nm. b) 445nm. Los tratamientos fueron 24h PEG 0h UV ( ), 24h PEG 1 h UV ( ) y 24h PEG 3h UV ( ).
a) b)
6.3. Parámetros de fluorescencia in vivo de clorofila.
En la Tabla 2 Se observa la disminución del parámetro Fv/Fm al aumentar la
exposición al estrés, al agregar PEG y aumentar el tiempo de exposición a radiación UV-B.
Tabla 2. Eficiencia máxima del fotosistema II (medias y desvío estándar, n=5). Las medias seguidas por la misma letra no presentan diferencias significativas al 5% del test Tukey.
Eficiencia máxima del fotosistema II
Tratamiento Fv/Fm 0h PEG 0h UV 0,527 ± 0,018 A
24h PEG 0h UV 0,482 ± 0,017 B24h PEG 1h UV 0,419 ± 0,010 C24h PEG 3h UV 0,336 ± 0,033 D
6.4. Evolución fotosintética de oxígeno.
La producción fotosintética de O2 fue afectada de manera negativa con la
exposición de Calothrix sp. BI22 a estrés osmótico durante 24 horas, mientras que no se
observaron diferencias significativas al adicionar radiación UV a la condición de estrés
(Tabla 3).
Tabla 3. Producción fotosintética de oxígeno (medias y desvío estándar, n=4). Las medias seguidas por la misma letra no presentan diferencias significativas al 5% del test Tukey.
Producción fotosintética de O2
Tratamiento nmoles totales O2 min-1mg-1 PS0h PEG 0h UV 26,90 ± 5,65 A
24h PEG 0h UV 1,38 ± 0,35 B24h PEG 1h UV 1,11 ± 0,30 B24h PEG 3h UV 0,23 ± 0,06 B
6.5. Actividad nitrogenasa.
Se ve una marcada disminución en la actividad de la enzima nitrogenasa con el
estrés osmótico. La disminución en la actividad de esta enzima no presentó diferencias
significativas con el estrés por UV.
Figura 4. Actividad de la enzima nitrogenasa medida como reducción de la molécula de acetileno (media de 4 repeticiones). Las barras verticales representan el desvío estándar. Las medias seguidas por la misma letra no presentan diferencias significativas al 5% del test Tukey.
6.6. Detección in situ de peróxido de hidrógeno y superóxido.
Las Figuras 5 y 6 permiten evidenciar la presencia de H2O2 y O2.- en los distintos
tratamientos de estrés en Calothrix sp. BI22. En la figura 5 se puede observar que la
acumulación de H2O2 es mayor al intensificar las condiciones de estrés. El estrés osmótico
solamente parece no favorecer la generación de este radical.
Figura 5. Determinación in situ de H2O2 en células de Calothrix sp. BI22. Tratamientos: a, 0h PEG 0h UV; b, 24h PEG 0h UV; c, 24h PEG 1h UV y d, 24h PEG 3h UV.
Figura 6. Determinación in situ de O2.- en células de Calothrix sp. BI22. Tratamientos: a, 0h PEG 0h UV; b, 24h PEG 0h UV; c, 24h PEG 1h UV y d, 24h PEG 3h UV.
En el caso del radical superóxido, se pudo apreciar su presencia en todas las
condiciones ensayadas, inclusive en el control (Fig. 6). Se pudo observar un aumento en la
tinción en las condiciones en que además de estrés osmótico, esta cianobacteria fue
expuesta a luz UV.
6.7. Peroxidación lipídica.
En la figura 7 se observa el aumento de la acumulación de TBARS cuando además
del estrés osmótico el tiempo de exposición a UV-B fue de 5 h (p<0,05).
Figura 7. Peroxidación lipídica medida a través de la determinación de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico, TBARS (media de 3 repeticiones). Las barras verticales representan el desvío estándar. Las medias seguidas por la misma letra no presentan diferencias significativas al 5% del test Tukey.
6.8. Actividad de enzimas antioxidantes.
En la figura 8 se observa el aumento significativo en la actividad de la enzima
catalasa al aumentar el tiempo de estrés por UV. En la misma figura se ve que la actividad
de la enzima ascorbato peroxidasa aumenta tras una hora de estrés por UV sumado al
estrés osmótico, mientras que desciende al aumentar la exposición a la radiación UV.
Figura 8. Actividad de las enzimas APX y CAT medida espectrofotométricamente (medias de n=3). Las barras verticales representan el desvío estándar. Las medias seguidas por la misma letra no presentan diferencias significativas al 5% del test Tukey.
Como se observa en la tabla 3 la actividad de la enzima superóxido dismutasa presentó una disminución en su actividad al aumentar la exposición a ambos estreses.
Tabla 4. Actividad de la enzima superóxido dismutasa medida como porcentaje de inhibición de la misma. Las medias seguidas por la misma letra no presentan diferencias significativas al 5% del test Tukey.
6.9. Contenido de prolina.
Los niveles de dicho aminoácido aumentaron significativamente con la exposición
a la suma de factores de estrés (Fig. 9).
Tratamiento % inhibición SOD Uenzima
0hPEG 0hUV 37,05 0,74 A
24hPEG 0hUV 24,10 0,48 B
24hPEG 1hUV 25,77 0,52 AB
24hPEG 3hUV 16,25 0,32 C
A
C
B
A
A
B
Figura 9. Contenido de prolina en células de Calothrix sp. BI22 expuestas a la combinación de estrés osmótico y lumínico (UV-B) (medias de n=3). Las barras verticales representan el devío estándar. Las medias seguidas por la misma letra no presentan diferencias significativas al 5% del test Tukey.
6.10. Aminoácidos del tipo de las Micosporinas (MAAs)
Los cromatogramas de los estándares presentaban una disminución de dos
unidades en la longitud de onda de máxima absorción de sus aminoácidos tipo
micosporina respecto a la bibliografía utilizada. Esto puede deberse a que el protocolo de
extracción y la columna empleada para el análisis no son los mismos que los utilizados en
dicha bibliografía. En el análisis de los cromatogramas de las muestras problema se tuvo
en cuenta este corrimiento.
Corallina officinalis presentó un pico con tiempo de retención de 3.32 minutos y
λmáx de absorción de 332nm; y un segundo pico a los 5.60 minutos con λmáx 318nm.
Estos compuestos son shinorine y palythine respectivamente.
El primer pico del cromatograma de Porphyra sp. coincide con el de Corallina officinalis ya
que ambas tienen shinorine; el segundo pico en el cromatograma tiene un tiempo de
retención de 5.90 minutos, con un máximo de absorción a 332nm; que corresponde a
porphyra-334.
Calothrix sp. BI22 tras ser expuesto a estrés osmótico, o la combinación de
osmótico y lumínico, presentó dos picos en su cromatograma. El primer aminoácido tipo
micosporina tiene un tiempo de retención de 3.32 minutos y su máximo de absorción en
332nm. Este pico coincide con el de shinorine de Corallina officinalis y Porphyra sp. El
segundo pico, tiene un tiempo de retención de 10.08 minutos y el máximo de absorción es
332nm. El máximo de absorción coincide con dos de los compuestos de los estándares,
pero no así el tiempo de retención de los mismos. Al buscar en la base de datos de MAAs
existe un tercer compuesto, la micosporina-2-glicina, con ese máximo de absorción. Con
estos datos podemos afirmar que Calothrix BI22 contiene estos aminoácidos en las
condiciones ensayadas.
Figura 10. Cromatograma de HPLC (detección a 330 nm) de un extracto en metanol de cultivo de Calothrix sp. BI22 sometido a 24hs de estrés osmótico. Se observan dos picos correspondientes a Shinorine (3.32 min) y Micosporina-2-glicina (10.08 min).
Al cuantificar los MAAs que presenta Calothrix sp. BI22 no se observó aumento
con mayor tiempo de exposición a luz UV-B (Fig. 11). No hay diferencias significativas
entre los tratamientos.
Figura 11. Contenido de los aminoácidos del tipo de las micosporinas en Calothrix sp. BI22 en las diferentes situaciones de estrés (n=3). Las barras verticales representan el desvío estándar. Las diferencias entre los tratamientos no fueron significativas.
7. DISCUSÍON
En este estudio se demostró el efecto negativo sobre la fotosíntesis y la fijación de N2 de la
aplicación de estrés lumínico y osmótico en forma simultánea en Calothrix BI22. Se
observó in vivo la presencia de EROs y se estimó la peroxidación lipídica confirmándose
daño oxidativo. Se evaluó la respuesta enzimática antioxidante para esos estreses y la
presencia de MAAs en esta cianobacteria. El contenido de prolina también aumentó con la
aplicación de UV-B y PEG.
7.1. Fotosíntesis
El aumento observado en la absorción de los pigmentos en los espectros
relacionado con las condiciones de estrés coincide con los resultados obtenidos por Aráoz
y Häder (1997), que adjudicaron el incremento de absorción de una cepa de Nostoc
expuesta a luz UV al crecimiento celular. La pérdida de los picos correspondientes a
ficoeritrinas y carotenoides puede deberse a la foto-decoloración de estos pigmentos, que
ya había sido comunicada por Donkor y Häder (1996) para diferentes géneros de
cianobacterias expuestas a estrés por radiación UV.
Los espectros de excitación muestran los pigmentos antena accesorios captadores
de energía radiante capaces de transferir dicha energía al FS II (Huot y Babin, 2010) y en el
caso de Calothrix sp. BI22 fueron carotenoides, clorofilas y aloficocianina. La disminución
del área del pico de aloficocianina al aumentar la condición de estrés, indicaría una menor
eficiencia de captación de la luz por este pigmento antena (Serrano y Losada, 1988) al
aumentar el tiempo de exposición a la radiación UV-B.
La considerable autofluorescencia de la aloficocianina (que se detecta en el
espectro de emisión cuando se excita a 580nm) en las muestras con estrés osmótico
únicamente, demuestra que la eficiencia en la transferencia de energía es menor al 100%
(Campbell et al., 1998). Estas pérdidas aumentan cuando se suma la exposición a luz UV-B;
evidenciadas por el aumento en la amplitud del pico antes mencionada, indicando una
disminución en la energía transferida a los fotosistemas y una mayor energía
desperdiciada como fluorescencia. Esto probablemente se debe a una menor eficiencia en
la captura lumínica en las células irradiadas (como evidencia el espectro de absorción) y
una pérdida de efectividad en la transferencia de energía al centro de reacción
fotosintético. El aumento en los picos de emisión de fluorescencia con los tratamientos de
estrés con UV respecto al estrés con PEG únicamente fue acompañado con un pequeño
corrimiento del pico a longitudes de onda más cortos como ha sido reportado para largas
exposiciones a UV-B (Donkor y Häder, 1996). Estos resultados demuestran que la
aloficocianina capta menor energía lumínica en las condiciones de estrés ensayadas, y a la
vez su fluorescencia aumenta; lo que significa que hay un menor aporte de energía al
centro de reacción (Campbell et al., 1998).
El rendimiento cuántico fotosintético determinado por fluorimetría de pulso de
amplitud modulada puede proveer información tanto de la fotosíntesis como del estatus
de aclimatación (Campbell et al., 1998) y los valores obtenidos en esta tesina están en el
rango de los mencionados para cianobacterias en condiciones saludables (Simis et al.,
2012). Debido a que la fluorescencia de los ficobilisomas se superpone con el espectro de
fluorescencia de la clorofila (Campbell et al., 1998) y también a que la fotosíntesis
comparte transportadores de electrones con la respiración, los valores de Fv/Fm son
menores que en eucariotas, sin embargo el rendimiento cuántico es un parámetro útil para
comparar el comportamiento de la misma cianobacteria en distintas condiciones como en
nuestro caso. La disminución significativa del parámetro Fv/Fm cuando se sometió
Calothrix sp. BI22 a 24 horas de estrés osmótico afectó de manera negativa la eficiencia
fotoquímica del FS II, efecto potenciado por la exposición a luz UV, lo que indica cambios
en la eficiencia fotoquímica máxima de los centros de reacción del fotosistema II (He y
Häder, 2002), y cuanto mayor es la exposición, mayor es la disminución del parámetro.
Estos resultados implican que para esta cepa de Calothrix hay menos centros activos del
PSII con la exposición por mayores tiempos a UV-B (Satoh et al., 2002).
Según Máté et al. (1998), las lesiones inducidas por luz UV se localizan en el centro
de reacción del fotosistema II, y están determinados por las tasas de degradación y
resíntesis de la proteína D1, una de las principales proteínas de dicho FS. En las células el
fotoenvejecimiento suele ir acompañado de una reparación del FS II fotodañado, por lo
tanto, la fotoinhibición in vivo es el resultado de un desequilibrio entre el daño inducido
por radiación y la reparación.
Los resultados obtenidos en esta tesina coinciden con los encontrados por Wang et
al. (2008), quienes hallaron que la radiación UV-B inhibe la actividad fotosintética de
Nostoc sp. significativamente y la inhibición de Fv/Fm está correlacionada con el aumento
de la intensidad de la radiación UV-B y el tiempo de exposición. Estos resultados muestran
que el parámetro Fv/Fm, es un buen indicador de la condición de estrés aplicada a las
cianobacterias, tanto por UV-B como osmótico.
Máté et al. (1998) comunicaron para una cepa de Synechocystis que la tasa de
evolución de oxígeno durante la irradiación UV-B disminuía de forma muy similar a la
actividad de transporte electrónico en el FS II y la cantidad neta de proteína D1. Cuando se
sometió a Calothrix sp. BI22 a estrés por UV exclusivamente, la producción fotosintética de
oxígeno también disminuyó (Pérez et al., 2012), sin embargo con la aplicación simultánea
de dos tipos de estrés en esta tesis, no se obtuvieron los mismos resultados. La
preexposición a estrés osmótico podría haber preparado a esta cepa de Calothrix logrando
que el rendimiento fotosintético no disminuyera respecto al control al adicionar estrés por
UV-B al estrés osmótico. Estos resultados confirman la importancia de considerar más de
un estrés al evaluar cianobacterias que como en este caso pretenden utilizarse como
bioinoculante para arroz en el campo donde probablemente estarán sometidas a múltiples
condiciones adversas.
Los resultados obtenidos en nuestro estudio demuestran que la fotosíntesis se ve
severamente afectada por las condiciones de estrés impuestas. Los cambios estructurales
en el aparato fotosintético inducidos por 24 horas de exposición a PEG afectarían la
transferencia de energía dentro del complejo antena. El aumento en la emisión de
fluorescencia de la aloficocianina, y la decoloración de pigmentos como ficoeritrina y
carotenoides con el estrés contribuye a la disminución del rendimiento cuántico
fotosintético, y por ende a la producción fotosintética de oxígeno.
7.2. Fijación de nitrógeno
Kumar et al. (1996) explicaron que la rápida inhibición de la actividad nitrogenasa
debido al tratamiento con UV-B puede deberse a la pérdida de poder reductor y ATP (ya
que la radiación UV-B tiene efectos deletéreos sobre el aparato fotosintético), a la
inactivación completa del polipéptido de la nitrogenasa, a cambios conformacionales en el
complejo enzimático y a la pérdida de la protección contra el oxígeno por los heterocistos.
La pérdida de ATP y poder reductor no ocurre inmediatamente en las cianobacterias ya
que muchas especies fijadoras son capaces de impulsar la actividad nitrogenasa a costa del
pool endógeno de ambos. Alguno de estos mecanismos podrían ser los mismos que actúan
sobre la enzima fijadora de nitrógeno en la situación de estrés osmótico ensayada. Tirkey y
Adhikari (2005) han reportado que las cianobacterias recuperan más lentamente su
actividad nitrogenasa que la fotosíntesis en caso de estrés osmótico producido por sequía.
En un ensayo donde se evaluó la actividad nitrogenasa en este aislamiento en
condiciones de estrés por UV-B, no se detectó disminución significativa de la misma en
esas condiciones de irradiación (Pérez et al., 2012). Estos resultados evidencian entonces
que el estrés osmótico sería causante de la disminución de la actividad de dicha enzima.
7.3. Daño oxidativo
No se encontró literatura previa en que se determinaran radicales libres del
oxígeno in vivo en cianobacterias y uno de los logros de este trabajo fue ajustar las
concentraciones de los reactivos y los tiempos de incubación de la muestra necesarios
para su detección, modificando la técnica empleada en hojas (Thordal-Christensen et al.,
1997; Jabs et al., 1996). Si bien la detección de radicales libres in situ es un ensayo que en
este caso aporta resultados cualitativos, no cuantitativos, puede ser muy útil para seguir
espacial y temporalmente la producción de EROs.
Si bien los EROs son productos posibles de varias vías metabólicas, frente a un
estrés se genera un desbalance entre los mecanismos oxidativos y antioxidativos (Ramel
et al., 2009). En condiciones de exceso de radiación lumínica, parte de energía de la luz
absorbida no es utilizada por la fotosíntesis, como resultado la tasa de producción de EROs
es sensiblemente mayor (Kreslavski et al., 2007). He y Häder (2002) comunicaron que la
formación de EROs era mucho mayor bajo luz UV-B moderada que solo iluminando con
PAR y la radiación UV-B aumentaba los niveles de EROs significativamente con el tiempo
de irradiación.
Debido a la inestabilidad y la reactividad inherente de la mayoría de las EROs y sus
bajos niveles en el estado estacionario, la determinación de la concentración de las EROs
es más difícil que la determinación de antioxidantes y enzimas antioxidantes (He y Häder,
2002). En esta tesis se consiguió visualizar in vivo peróxido y superóxido pero solo en el
caso del peróxido pudo observarse un aumento en condiciones de estrés, indicando que la
síntesis de H2O2 era independiente de la producción de O2.-.
En este estudio el aumento de la acumulación de TBARS, indicador de la
peroxidación lipídica, fue dependiente del tiempo de exposición a las condiciones de
estrés, lo que sugiere daño oxidativo por EROs (H2O2 OH- y O2-) luego de la exposición a la
combinación de estrés osmótico y lumínico. Sin embargo, el estrés osmótico aplicado no
fue suficiente para encontrar diferencias en la peroxidación lipídica. Se ha reportado
anteriormente aumento de TBARS en condiciones de estrés por UV-B (He y Häder, 2002;
Zeeshan y Prasad, 2009).
Para detoxificar las EROs ocurren cambios en las actividades de diversas enzimas
antioxidantes, como SOD (EC 1 .15.1.1), CAT (EC 1 .11.1.6) y APX (EC 1. 11.1.11). Si bien en
este trabajo la respuesta de las enzimas estudiadas fue variada, una elevada actividad de
estas enzimas podría estar relacionada a una mayor eficiencia en la tolerancia al estrés
(Zeeshan y Prasad, 2009).
La actividad de CAT aumentó significativamente cuando al estrés osmótico
inducido por PEG se le suma la exposición a UV-B, lo que concuerda con lo observado por
Zeeshan y Prasad (2009) en diferentes géneros de cianobacterias sometidas a cortos
tiempos de irradiación con luz UV. En el ensayo de detección in situ de peróxido de
hidrógeno se observó que este compuesto aumentaba con el estrés, lo que desencadenaría
el aumento en la actividad de esta enzima. Este aumento de la actividad de una enzima que
detoxifica una especie reactiva del oxígeno podría ser uno de los mecanismos involucrados
en la mejor sobrevivencia de esta cepa de Calothrix frente al estrés lumínico que otras
cepas (Pérez et al., 2012).
Existen diferentes trabajos que indican la presencia de la enzima APX en algunas
especies de cianobacterias, aunque no puede demostrarse una correlación entre la
presencia o ausencia de esta enzima y la taxonomía. Esta enzima puede estar presente en
especies que se presentan como células simples o filamentos, en heterocistos fijadores y
células vegetativas no fijadoras (Obinger et al., 1998). En Calothrix sp. BI22 se detectó
actividad de APX, la cual aumentaba tras una hora de irradiación más 24 h de estrés
osmótico respecto al control solo con estrés por PEG. Luego de tres horas de exposición,
los niveles de actividad de APX cayeron a los niveles iniciales, lo que indica que una mayor
duración en la exposición a luz UV podría inactivar o degradar la enzima.
Los resultados de este trabajo revelan que la reducción fotoquímica del NBT es
inhibida en menor proporción en situaciones de estrés. Esto significa que la capacidad de
dismutar el superóxido es menor, ya sea por una menor cantidad de enzima SOD o menor
actividad. La enzima superóxido dismutasa no está actuando como mecanismo de defensa
frente a estrés lumínico y osmótico en esta cepa de Calothrix en las condiciones ensayadas.
Esta disminución en la actividad puede ser ocasionada por inactivación o degradación de
la enzima, o inhibición a nivel transcripcional, tal como sucede en plantas (Polle, 1997).
Cuando la cepa de Calothrix es sometida solamente a radiación UV, la actividad
SOD aumentó (Pérez et al., 2012) indicando su participación como defensa antioxidante.
Zeeshan y Prasad (2009) también observaron aumento en la actividad SOD en diferentes
cianobacterias sometidas a estrés por UV-B, con tiempos cortos de irradiación. El estrés
osmótico sería el causante de la disminución en la actividad de esta enzima en el caso de
este trabajo. Ha sido demostrado que la actividad de SOD cambia dramáticamente en
condiciones que favorecen la formación de superóxido (Obinger et al., 1998). La radiación
UV también produce una disminución de la actividad SOD en microalgas (Zhang et al.,
2005). Dat et aI. (2000) encontraron en plantas que la actividad SOD puede aumentar o
disminuir dependiendo de la especie, la dosis de UV-B y la presencia o no de radiación PAR
o UV-A acompañando. El aumento en los niveles de radicales libres observado por
detección in situ explican los elevados niveles de TBARS detectados. Además incide la
disminución en la actividad de la enzima SOD, que no estaría actuando como mecanismo
de defensa ante la presencia de radicales libres, específicamente superóxido (Ramel et al.,
2009).
7.4. Prolina
Los niveles de este aminoácido aumentaron considerablemente tras la exposición a
la suma de factores de estrés en Calothrix sp. BI22, 6 veces tras la exposición a 3h de luz
UV y 24h de estrés osmótico respecto al cultivo no estresado. Esto coincide con los
resultados obtenidos por Chris et al. (2006) al someter a Cylindrospermum sp. a la
combinación de estrés lumínico y salino. Estos autores demuestran que la preexposición a
estrés salino aumenta de forma pronunciada los niveles de prolina, en mayor nivel que
cada estrés por separado, mejorando la resistencia a luz UV en dicha cianobacteria, debido
a que observaron una disminución en la generación de H2O2 y menor peroxidación lipídica.
Si bien el rol exacto de este aminoácido es poco conocido. tanto en plantas como en
bacterias su acumulación está estrechamente asociada a una mejor adaptación a ciertos
factores de estrés. Diferentes trabajos han mostrado la acumulación de prolina en
cianobacterias en condiciones de estrés por radiación UV, estrés salino, por metales
pesados, desecación y plaguicidas (Chris et al.,2006; Choudhary et al., 2007; Rajendran et
al., 2007; Fatma et al., 2007). Por lo mencionado hasta ahora es probable que estos altos
niveles de prolina incidan de forma positiva en la tolerancia a estrés en Calothrix sp. BI22.
7.5. Aminoácidos del tipo de las micosporinas
Calothrix sp. BI22 presentó dos tipos de MAAs, shinorine y micosporina-2-glicina,
siendo shinorine encontrado en otras cepas de cianobacterias, por lo que parece ser un
MAA muy común (Singh et al., 2008, Sinha et al., 2007) La bibliografía estudiada reporta
que en condiciones de irradiación con luz UV existe una mayor síntesis de MAAs, que
aumenta con el tiempo de irradiación (revisado por Rozema et al., 2001). Portwich y
Garcia-Pichel (1999) hallaron un efecto sinérgico entre estrés osmótico y por luz UV en la
síntesis de estos compuestos que filtran la radiación UV en Chlorogloeopsis PCC 6912.
En el caso de Calothrix sp. BI22 en las situaciones de estrés aplicadas no se observó
un aumento significativo en la cantidad de MAAs lo que podría responder al corto tiempo
de exposición a la radiación y a que la dosis fue menor que en la bibliografía consultada
tratando de emular la que alcanza el agua de inundación de un arrozal en verano
(Portwich y Garcia-Pichel, 1999; Sinha et al., 1999).
Un nivel constitutivo de MAAs puede aparecer en todas las condiciones de
crecimiento (Portwich y Garcia-Pichel, 1999), como se observa en Calothrix sp. BI22
cuando se encuentra en condiciones control, sin estrés (Pérez et al., 2012). Se puede dudar
de la eficacia de los MAAs en las células planctónicas solitarias o tricomas aislados, sin
embargo su acumulación en las floraciones fitoplanctónicas pueden aumentar la
protección UV dentro de la comunidad (Oren y Gunde-Cimerman, 2007). Portwich y
Garcia-Pichel (1999) señalan que la inducción de la síntesis de MAAs es específica de
estrés osmótico y estrés por UV, no está bajo el control de mecanismos comunes de
respuesta a estrés. La presencia constitutiva de MAAs puede tener efectos beneficiosos
para Calothrix sp. BI22 en la defensa a las condiciones de estrés ensayadas, brindándole
protección contra el daño causado por los estreses osmótico y lumínico por UV. El ajuste
de las condiciones metodológicas para determinar estos aminoácidos por HPLC en este
laboratorio también constituye uno de los logros de este trabajo.
Si bien los estudios de laboratorio en condiciones controladas permiten aislar los
efectos de distintos factores de estrés y la respuesta bacteriana, se debe ser cauteloso con
la extrapolación de estos datos a las condiciones de campo donde las bacterias están
expuestas a más de un factor de estrés, tanto abióticos (luz PAR y distintos tipos de UV,
estrés osmótico, desecación, etc.), como bióticos de amplia naturaleza.
En trabajos previos en este laboratorio se había seleccionado esta cepa de
Calothrix como posible inoculante por presentar mayor resistencia a radiación UV-B
cuando se comparó con cepas de otros géneros. La actividad nitrogenasa no descendía por
luz UV-B, no aumentaba la peroxidación lipídica, presentaba un aumento en la actividad de
SOD cuando se comparaba con el cultivo no irradiado, entre otros resultados (Pérez et al.,
2012). En esta tesina sin embargo, se observó que la respuesta de aclimatación de la
cianobacteria a más de un estrés fue más compleja que la respuesta al estrés solo por UV-
B. Debe considerarse que la lámpara utilizada en este trabajo provee casi exclusivamente
luz UV-B y que no se aplico en simultáneo luz PAR durante el período de irradiación y por
lo tanto las condiciones son diferentes a las de campo. Es importante considerar esto ya
que la cepa de Calothrix elegida como promisoria por su resistencia al estrés por UV,
respecto a otras cepas de otros géneros, puede no sobrevivir en condiciones de campo
debido a la exposición a más de un estrés en simultáneo y el estudio de uno en particular
no proporciona suficiente información para su comprensión holística.
Las cianobacterias son organismos modelo para estudiar la fotosíntesis oxigénica
ya que su aparato fotosintético presenta una gran similitud con el de las plantas
superiores (Kreslavski et al., 2007). Por lo tanto, los resultados obtenidos en este trabajo
podrían emplearse como base para ensayar lo que puede suceder en plantas expuestas a
las mismas condiciones de estrés.
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Advances in Microbiology, 2012, 2, 37-47 doi:10.4236/aim.2012.21006 Published Online March 2012 (http://www.SciRP.org/journal/aim)
Differential Response to Moderate UV-B Irradiation of Two Heterocystous Cyanobacteria Isolated from
a Temperate Ricefield
Germán Pérez, Soledad Doldán, Omar Borsani, Pilar Irisarri Departamento Biología Vegetal, Facultad de Agronomía, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay
Email: [email protected]
Received December 15th, 2011, revised January 4th, 2012, accepted January 15th, 2012
ABSTRACT
In cyanobacteria both photosynthesis and nitrogen fixation can be affected by UV radiation. Two of the most abundant heterocystous cyanobacteria isolates from a temperate ricefield in Uruguay belonging to Anabaena and Calothrix genus were exposed for 1 or 3 hours to UV-B dosis similar to those to which they are exposed in summer. Anabaena survival after 1 h of UV-B exposure was 10% whereas in Calothrix’s was 30%. Both the quantum yields of photosybtem II fluorescence and O2 photoevolution decreased with time of UV-B exposure for Calothrix and only till 1 h for Anabaena. Only the Calothrix strain presented phycoerithryn as antenna pigment and constitutive UV-B screening mycosporine like aminoacids. In the Anabaena strain, nitrogenase activity was drastically reduced with UV-B irradiation but in Ca- lothrix was not affected. Proline content and lipid peroxidation increased after 3 hours of UV-B exposure only in Ana- baena sp. The antioxidant enzyme activities evaluated followed different trends for both isolates, with an increase in superoxide dismutase activity in the Calothrix isolate. These results show that the two nitrogen-fixing cyanobacteria studied have different responses to UV-B radiation and that cyanobacteria diversity may be considered when selecting strains to be used as biofertilizers. Keywords: Cyanobacteria; Antioxidant Responses to UV-B; Mycosporine; Nitrogenase Activity
1. Introduction
The current trend in the decrease of stratospheric ozone from anthropogenic inputs of chlorinated fluorocarbons has caused an increase of ultraviolet-B radiation (UV-B, 290 - 320 nm) reaching the biosphere. Site-specific ozone reductions have been reported over South America as far as 30˚S as a consequence of the transport of air masses with low ozone concentrations after the break-up of Ant- arctic vortex circulation [1]. High doses of UV-A/B radia- tion can also pass through the water column and have deleterious effects on aquatic systems [2]. UV-B radia- tion is the one that produces the most severe cellular damage due to its direct effects on DNA and proteins and indirectly by the reactive oxygen species (ROS) produc- tion [3]. The damage, however, is dependant of the irra- diance/dose received by the cells.
Cyanobacteria comprise the biggest and most widely distributed group of photosynthetic prokaryotes. They absorb solar radiation to drive photosynthesis and nitro- gen fixation in some cases, being exposed to high doses of UV radiation. The main biochemical and physiologi- cal processes altered by UV radiation in these bacteria are surviving rates, pigmentation, motility, O2 photoevo-
lution, CO2 and N2 fixation, and the phycolibiprotein content. Many cyanobacteria have developed mecha- nisms to prevent the toxic effects caused by UV. Among these, DNA damage repair mechanisms, accumulation of detoxifying and antioxidant enzymes or synthesis of UV- protectants compounds [4].
Among the nitrogen fixing cyanobacteria, the hetero- cystous forming ones seem to be the most abundant in the water column and on the surface of rice paddy fields [5]. The fact that heterocystous forming cyanobacteria can assimilate CO2 and fix N2, make them suitable to be used as biofertilizers [6]. A rice inoculation assay using heterocystous-cyanobacteria in Uruguay was not suc- cessful [7], suggesting that conditions to improve inocu- lant survival must be studied. The inoculant was applied at flooding stage and so cyanobacteria received levels of UV radiation similar to those reported at the same lati- tude for shallow lagoons in Uruguay [8]. Light is the most variable of the resources essential for photosynthe- sis in aquatic environments varying with greatest ampli- tude on short time scales from effects of vertical mixing, cloud cover, and the diel cycle of sunlight. Thus, indi- vidual cells must cope with a wide variability in light on
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G. PÉREZ ET AL. 38
time scales shorter than their lifetime [9]. Under the hypothesis that diverse cyanobacteria iso-
lated from the same site may cope with UV radiation in a different form, the aim of this work was to study the UV-B response at laboratory conditions of two of the most abundant cyanobacterial isolates from a temperate rice paddy field [10] at dosis to which they are normally ex-posed. Estimation of growth, their physiological status and some of their UV-protective mechanisms were studied.
2. Materials and Methods
2.1. Organisms and Growth Conditions
The filamentous heterocystous cyanobacteria Calothrix sp. BI22 and Anabaena sp. BI42 were isolated from Uruguayan rice paddy fields [10]. The cultures were ax- enically grown in nitrogen free BG 11 medium [11] buf- fered with 10 mM HEPES, pH 7.6 at 25˚C ± 2˚C with white light supplied by fluorescent lamps providing a photosynthetic photon flux density of 50 μE·m–2·s–1. Ex- ponentially growing cultures were used for the different experiments. Cultures were sampled under sterile con- ditions after homogenization with a Potter pestle and biomass was estimated as dry weight. Unless otherwise stated, cultures with an initial dry weight of about 3 mg mL–1 were used in all experiments.
2.2. UV Treatment
A well homogenised culture suspension of each cyano- bacterium was poured into open Petri dishes (diameter 22 cm). The cultures were exposed directly and only to arti- ficial UV-B (0.034 mW·cm–2) and UV-A (15.54 μW·cm–2) during 1 h and 3 h with constant shaking to avoid self- shading. UV-B irradiation was provided by a Hi-Tech lamp G25T8E, Japan. The irradiance of the light source was determined with an IL1400A radiometer/photometer (International Light Inc.) equipped with UVAR and UVBR sensors.
2.3. Survival
The survival of the irradiated and control organisms was studied on agar plates. After irradiating the cultures, ali- quots of 100 µL were diluted to 1 mL with BG11 me- dium and transferred to nitrogen free BG11 sterile solid plates and grown in the same conditions described above. After 10 days of incubation, colonies were counted under a binocular microscope and the survival was calculated by the colony numbers of test samples (Nt) divided by the control samples (Nc) (survival % = Nt/Nc × 100).
2.4. Absorption Spectra
Culture suspensions were homogenized in a Potter pestle
and then immobilized in agarose 1% (w/v) in a 3 mL-quartz cuvette. A scanning spectrum (300 - 750 nm) of immobi-lized cells exposed for different periods of time to the beam of the spectrophotometer at 280 nm was obtained, according to [12].
Phycobiliproteins were extracted according to [13].
2.5. Fluorescence Emission Spectrum
The emission spectrum was measured with a spectro- fluorophotometer (RF-1501, Shimadzu) at room tem- perature with an excitation wavelength of 445 nm and emission wavelength between 600 and 780 nm.
2.6. Chlorophyll Fluorescence Parameters
The in vivo chlorophyll a fluorescence from both cyano- bacteria cultures was measured with a FMSI fluorometer (Hansatech Instrument Ltd., King’s Lynn, UK) using saturating actinic light (8000 µmol·m–2·s–1 for 8 s as de- scribed by [14]. Prior to the measurement the cyanobac- teria were adapted 30 min to darkness. Fluorescence pa- rameters were calculated as described by [15].
2.7. Photosynthetic Oxygen Evolution
Photosynthesis was measured as O2 evolution with a Clark-type O2 electrode (Hansatech Instruments Ltd.) as described in [10]. Two mL aliquots of cell suspensions which were exposed to UV treatments were placed in a 27˚C controlled cuvette and illuminated with a quantum flux density of 400 μE·m−2·s−1.
2.8. Extraction and Analysis of Mycosporine-Like Aminoacids (MAA)
Cells were harvested by centrifugation at 8000 g for 5 min at room temperature. Pellets were first incubated with methanol 20% (v/v) at 45˚C for 2.5 h and then cen-trifuged (6000 g; 5 min) at 6˚C - 8˚C. The process was repeated twice. The extracts were cleared using nitrocel-lulose membranes (0.45 μm) and characterized using a HPLC system (Shimadzu SPD-10A UV-VIS detector. Kyoto, Japan) equipped with a LiChrosorb RP-18 col-umn. The wavelength for detection was 330 nm at a flow rate of 1.0 mL/min at 25˚C and a mobile phase of 0.2% acetic acid. The separated aminoacids were detected at 330 nm with a photodiode array [16]. Identification of MAAs was done by comparing the absorption spectra and retention times with standards such as Corallina of-ficinalis (shinorine and palythine) and Porphyra sp. (porphyra-334 and shinorine). These standards were kindly provided by Dr. D.-P. Häder from the Alexander Universität (Erlangen, Germany). The database used for identification of the MAAs was http://www.biologie.uni- erlangen.de/botanik1/index.html.
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2.9. Nitrogenase Activity
To determine the response of nitrogenase activity to the exposure to UV light, an acetylene reduction assay (ARA) was performed in 10 mL aliquots of cell suspensions, placed in 22 mL vials after 1 and 3 hours of UV exposi- tion. The incubation time with 10% acetylene in air was 45 min [10]. Ethylene formation was followed with a HP 5890 gas chromatograph equipped with a Porapack N column. Nitrogenase activity was expressed as μmol eth- ylene mg−1 dry weight·h−1.
2.10. Lipid Peroxidation
The formation of malondialdehyde (MDA) was used as indicator of lipid peroxidation. The determination of MDA by the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) method was performed as described by [17] at 532 nm absorbance. Lipid peroxidation was expressed as nmoles of MDA per milligram dry weight using an ex- tinction coefficient of 156 mM−1·cm–1 [18].
2.11. Proline Content
Proline was extracted and quantified according to [19].
2.12. Antioxidant Enzymatic Activities
Superoxide dismutase (SOD) activity was assayed spec-trophotometrically by monitoring inhibition of xanthine oxidase (XO; 1.1.3.22)-dependent reduction of 10 µM ferricytochrome c [20]. The reaction was monitored at 550 nm in 50 mM potassium phosphate, 100 µM EDTA, and 50 µM xanthine, pH 7.8. One unit of SOD was de- fined as the activity that could inhibit the XO-dependent reduction of ferricytochrome c by 50%, measured as in- hibition of the rate of increase in absorbance at 550 nm compared with a control rate, established using sufficient XO. Ferricytochrome c reduction of 0.025 A550/min was done at 25˚C.
Catalase (CAT) activity was determined essentially as described by [21] by measuring the decline in levels of hydrogen peroxide spectrophotometrically at 240 nm. One unit was defined as the activity that decomposed one micromole of hydrogen peroxide per minute at 25˚C at pH 7.0.
Ascorbate peroxidise (APX) activity was followed by decrease in absorption at 290 nm for 3 min (extinction coefficient 2.8 mM·cm–1). The reaction mixture con- tained phosphate buffer 100 mM (pH 7.5), ascorbate 0.5 mM and H2O2 0.2 mM [22].
For protein quantification cultures were centrifuged (6000 g for 10 min) and pellets were resuspended in an extraction buffer (100 mM Tris; 50 mM EDTA; NaCl 100 mM; PMSF 1% fc; pH 8). The protein extract was
quantified according to [23] and kept at –80˚C until fur-ther processing.
2.13. SOD Detection
SOD isozymes were analyzed on a non-denaturing poly- acrilamide gel, using in-gel activity assays and with isozyme-specific inhibitors previously described by [24], and using 40 µg of protein in a given analysis [25].
2.14. Statistical Analysis
Analysis of variance and a t-test were used to establish differences among the different radiation treatments and strains (n = 3 or 4). All experiments described were con- ducted independently at least twice. A confidence level of 95% was used in all analysis.
3. Results
3.1. Cyanobacterial Survival to UV-B
Growth responses of the two tested cyanobacteria Ana- baena sp. BI42 and Calothrix sp. BI22 after UV-B radia- tion were inhibited in a different trend. Anabaena BI42 sp. showed after an hour of exposure a decrease of its survival of near 90% and reached almost a 100% after 3 hours of exposure. On the other hand, the survival de- crease of Calothrix sp. BI22 was near 50% in the first hour of irradiation and reached a 70% after 3 hours of exposure (Figure 1).
3.2. Spectral Properties of Photosynthetic Pigments
The absorption spectrum of photosynthetic pigments in
Figure 1. Growth of cyanobacteria after different times of exposure to UV-B.
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response to moderate UV-B stress (Figure 2) showed that maximum light was absorbed in two distinct regions i.e. from wavelength 400 - 500 nm and 600 to 700 nm. In Anabaena sp. BI42 the spectrum showed absorption maxima at 683, 630, 501 and 443 nm, corresponding to the photosynthetic pigments Chl a (red peak), phycocya- nin, caroten and Chl a (Soret band) respectively. The absorption maxima for Calothrix sp. BI22 corresponded to 681, 629, 572, 503 and 403 nm with an additional phycoerythrin peak. In both cyanobacteria, the absorp- tion of light decreased in both regions with the increase in time of UV-B exposure from the beam of the spectro- photometer (Figures 2(a) and (b)). In the case of Ana- baena, carotenoids that were the more affected pigments, presented a higher decrease in absorbance with exposure time to UV-B radiation than in Calothrix.
The fluorescence emission spectra of Anabaena sp. BI42 and Calothrix sp. BI22 and are shown in Figures 3(a) and (b) respectively, after different times of exposure to UV-B irradiation. The fluorescence emission peak at 670 nm, monitored at an excitation wavelength of 445 nm increased with duration of UV-B irradiation for both cyanobacteria isolates. There was no shift in the peaks ob- served but an increase in their value due to exposure UV-B.
3.3. Chlorophyll a Fluorescence and O2 Photoevolution
The optimum quantum yield of PSII (Fv/Fm) of the con- trol (before exposure treatment) already showed a sig- nificant difference in the photosynthetic capacity be- tween the two isolates (p < 0.01). Photosynthetic effi- ciency was higher in Calothrix sp. BI22 (0.453 ± 0.017) than in Anabaena BI42 sp. (0.223 ± 0.015).
(a) (b)
Figure 2. Absorption spectra of cells of Anabaena sp. BI42 and Calothrix sp. BI22, (a) and (b) respectively, obtained after different time of exposure to the 280 nm beam of the spectrophotometer.
(a) (b)
Figure 3. Impact of UV-B on emission fluorescence spectra of Anabaena sp. BI42 and Calothrix sp. BI22, (a) and (b) respectively. Cells were excited at 445 nm after exposure to UV-B for 0, 1 and 3 h.
Fm/Fv significantly decreased (p < 0.05) with the time of exposure in Calothrix sp. BI22 to UV-B (Figure 4). There was a decline of 32% of the quantum yield of PSII after 3 hours of exposure. While in Anabaena the de- crease was only significantly different in the first hour (p < 0.05). The Fv/Fm in Anabaena reached the same value as the control sample when exposed to 3 hours to UV radiation.
The O2 photoevolution was more drastically reduced in Calothrix BI22 sp. than in Anabaena BI42 sp. (Figure 4).
3.4. Mycosporine Like Aminoacids
The HPLC analysis revealed the presence of two MAAs in Calothrix sp. BI22 (Figure 5). According to [26] these MAAs could be palythinol and mycosporine-2-glycine. Their retention times were 3.54 and 10.29 min espec- tively and their absorption maxima were 330 and 332 nm respectively. The content of these MAAs, 3.7 and 0.5 nmol·g·DW–1 respectively did not increase significantly with UV-B exposure. Instead, neither any peak nor an induction of any MAAs was observed in Anabaena sp. BI42 (Figure 5).
3.5. Nitrogenase Activity
Rates of nitrogen fixation (Table 1), measured as nitro- genase activity, were not significantly altered in Calothrix sp. BI22 due to UV-B radiation. Instead, Anabaena sp. BI42 showed a significant reduction at the very first hour of exposure (p < 0.05) which represents a 55% decline in the nitrogen fixation of this strain. When the culture of Anabaena sp. BI42 was irradiated for 3 hours, the nitro- genase activity drastically decreases (Table 1).
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Figure 4. Photosynthetic parameters measured for both isolates Calothrix sp. BI22 and Anabaena sp. BI42 in the control or irradiated with UV-B for 1 or 3 h. The maximum photochemical efficiency of PSII reaction centers measured as the ratio FV/Fm and percentage of inhibition of O2 pho-toevolution after exposure for different times to UV-B. Re-sults of FV/FM are reported as mean of three replicates ± standard error.
Figure 5. (a) HPLC chromatogram showing the retention times and wavelength of MAAs (palythinol and myco- sporine-2-glycine) in Calothrix sp. BI22. (b1) Absorption spectrum showing the maximum absorbance for MAA pa- lythinol (as purified by HPLC), at 332 nm and retention time 3.32 min. (b2) Absorption spectrum showing the maximum absorbance for MAA mycosporine-2-glycine, (as purified by HPLC), at 332 nm and its retention time was 10.08 min.
3.6. Lipid Peroxidation
The level of lipid membrane damage measured as TBARS was not significantly affected by UV-B exposure in Ca- lothrix sp. BI22 (Table 1). Only after 3 hours of expo- sure, the level of damage became significantly different from the control values in Anabaena sp. BI42 (Table 1).
3.7. Proline Content
Quantification of proline showed that after 3 hours of
exposure its accumulation became significantly different to control samples of Anabaena sp. BI42. However, pro- line content showed no significant difference during the experiments in Calothrix sp. BI22 (Table 1).
3.8. Antioxidant Enzymatic Activities
Both strains had changes in their antioxidant enzymes activities in response to UV-B exposure (Figure 6). SOD activity showed an opposite trend between the cyano- bacterial strains; a significant decrease in Anabaena sp. BI42 and a significant increase in the enzymatic activity in Calothrix sp. BI22 after 3 hours of exposure to UV-B. On the other hand, in Anabaena BI42 and Calothrix sp. BI22, their catalase activity significantly increased after one hour of exposure and dropped down its activity after 3 hours of irradiation. There was no significant change in the APX activity in both strains (Figure 6).
Assays on SOD activity by non-denaturing PAGE gels showed that Anabaena sp. BI42 had two isoforms and Calothrix sp. BI22 one. There was no induction of any new isoform of this enzyme during the exposure to UV-B radiation (Figures 6(c) and (d)). The pre-incubation with inhibitors such as KCN and H2O2 showed that both strains have a Fe-dependent SOD isoform (data not shown) (Fig-ure 7).
4. Discussion
Cyanobacteria harvest light energy during the process of photosynthesis and assimilate it into carbon compounds. Any adverse effect of UVB may severely affect photo- synthesis and related metabolic processes and overall growth performance of cyanobacteria. Although the sur- vival of both cyanobacteria isolates tested decreased after exposure to UV-B irradiation, the responses were differ- ent. Previous reports stated that the differences could in part be explained on the basis of antioxidant defenses and DNA repair mechanisms present in each microorganism or simpler ones as morphological features such as pres- ence of sheath [27,28]. For instance, Calothrix sp. BI22 has a muscilaginous sheath (data not shown) observed by optic microscopy whereas Anabaena sp. BI42 lacks it. It must be considered that in this work the UV lamp used provided almost exclusively UV-B light and PAR was not applied simultaneously during the irradiation period. Field conditions are quite different and so these results must not be extrapolated. For example, DNA-repair mecha- nisms included photoreactivation by photolyase after ab- sorption of light energy at 400 nm or long wavelength UV-A [4].
The laboratory studies presented here show that both photosynthesis and nitrogen fixation in Anabaena sp. BI42 are affected by short exposure times to UV-B, while in Calothrix sp. BI22 only photosynthesis decreased.
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Table 1. Effect of different times of exposure to UV-B on nitrogenasa activity, proline content and lipid peroxidation in Ana-baena sp.BI42 and Calothrix sp.BI22.
Nitrogenase activity (µmol C2H4 mg–1·DW·h–1)
Proline content (nmol·mL–1·mg·DW–1)
TBARS (nmol·g·DW–1) UV-B
treatment (h) Anabaena sp. BI42 Calothrix sp. BI22 Anabaena sp. BI42 Calothrix sp. BI22 Anabaena sp. BI42 Calothrix sp. BI22
0 0.69 ± 0.18a 0.18 ± 0.04b 1.80 ± 0.34a 1.1.67 ± 0.55a 29.5 ± 14.2a 6.7 ± 3.2a
1 0.31 ± 0.05b 0.39 ± 0.20b 2.07 ± 0.43a 1.57 ± 0.65a 20.6 ± 8.5a 7.5 ± 2.5a
3 0.02 ± 0.01c 0.28 ± 0.02b 3.04 ± 0.30a 1.64 ± 0.05a 60.0 ± 4.0b 6.1 ± 1.6a
Values (means ± standard deviation) followed by different letters were significantly different at p < 0.01.
(a) (b)
(c) (d)
Figure 6. Superoxide dismutase (SOD) in vitro activities in Anabaena sp. BI42 (a) and Calothrix sp. BI22 (b) after different times of exposure to UV-B. Results are reported as mean of three replicates ± standard error. Identification of SOD in-gel activities in Anabaena sp. BI42 (c) and Calothrix sp. BI22 (d) for the control and cells irradiated with UV-B for 1 and 3 h.
Figure 7. APX and CAT activities in Anabaena sp. BI42 (a) and Calothrix sp. BI22 (b) exposed to UV-B for 0, 1 and 3 h. Re-sults are reported as mean of three replicates ± standard error.
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4.1. Pigmentation and Photosynthesis
Several studies as this one suggest that phycobiliproteins, chlorophyll and carotenoids are negatively influenced by UV-B radiation [29].
The increase in fluorescence emission peaks with the UV-B treatments (Figure 3) was not accompanied by a shift of the peak to shorter wavelengths as has been re- ported for larger exposure to UV-B [12]. However, the observed slight decay in fluorescence intensity was probably due to less efficiency in light capture in UV-B irradiated cells and loss in efectivity of energy transfer to the photosynthetic reaction center.
Photosynthetic oxygen production declined with artifi- cial UV-B radiation in both isolates investigated. It could be possible that structural changes within the photosyn- thetic apparatus were induced by short exposure times which affected the energy transfer within the antenna complex. Photosynthesis was more affected in Calothrix sp. BI22, as showed by the fluorescence spectra and O2 photoevolution. Photosynthetic quantum yield that was determined by pulse amplitude-modulated fluorometry can provide information on both photosynthesis and overall acclimation status [30]. Quantum yields of PSII fluores- cence showed a decline upon UV-B exposure in Ca- lothrix sp. BI22 (Figure 4). This is consistent with pre- vious studies [31] where accumulation of un-repaired damage over time in cultures exposed to UVR is sug- gested. A possible explanation is that essential proteins of the PSII like D1 are damaged during exposure [32-34] and probably this explains what was observed in Ana- baena sp. BI42. Phycobiliproteins fluorescence may also be contributing to photosynthetic quantum yield as both cyanobacteria possessed different phycobiliproteins [30].
4.2. Nitrogen Fixation
The results of nitrogenase activity (Table 1) showed that in Anabaena sp. BI42 this process was drastically inhib- ited after 3 hours of exposure (near 100%). This is in accordance to previous studies on other strains of Ana- baena sp., but using higher doses of UV-B [29,35] (New-ton et al., 1979, Lesser, 2008). In Calothrix sp. BI22, the N2 fixing activity was not affected by UV-B exposure in any treatment. Nitrogen fixation requires ATP and reductant for its activity that come from photosynthesis. Even though photosynthesis (Fv/Fm and O2 photoevolution) was altered in Calothrix sp. BI22, there is evidence that cyanobacteria contain sufficient endogenous content of reductant and ATP to support the nitrogenase activity [36]. However, [37] showed that nitrogenase inactivation by UV-B is caused by direct damage to nitrogenase poly-peptide. They also proved that restoration of the ac- tivity depends on de novo synthesis of the enzyme rather than the cellular content of ATP and reductant.
4.3. Mycosporine Like Aminoacids
Synthesis of UV-absorbing compounds, such as myco- sporine amino acids (MAAs), is an important mechanism preventing UV photodamage. The degree of protection by MAAs depends on the type of aminoacid, location (cytoplasm or extracellular glycan) and species [38]. Ca- lothrix sp. BI42 had two types of MAAs, palythynol (88%) and mycosporine-2-glycine (12%). The same kind of MAAs had been found in Nostoc punctiforme in colo- nies exposed to high solar radiation [39]. MAA-Gly is reported to be located in the extracellular glycan [40]; [41]. Apart from the benefits from being in the outer membrane, MAA-Gly is reported to give additional pro- tection because it can act as a radical quencher [42]. The experimental conditions used in this study did not induce any increase or variation in Calothrix’s MAAs content. In other studies MAAs synthesis was also influenced by the irradiation conditions [26] and higher doses or longer times of irradiation increased MAAs content [31]. A constituve level of MAAs can appear in all growth con- ditions of cyanobacteria as observed in Calothrix sp. BI42. This cyanobacterium grows in aggregates which is said to substantially increase the screening efficiency of MAAs [43]. Anabaena sp. BI22 did not show the pres- ence of any MAAs nor any induction of them with ex- posure to the UV-B doses assayed. Other surveys re- ported that from 22 cyanobacterial isolates, only 13 were found to contain MAAs [44]. However, [16] found in an Anabaena sp. isolated from an Indian rice paddy-field the presence of shinorine. None of the strains tested showed the presence of scytonemin (data not shown) which is said to be induced by UV-A irradiation and other type of stresses [45].
4.4. Antioxidant Potential
Anabaena sp. BI42, after 3 hours of exposure showed a significant increase of lipid membrane damage measured as TBARS (Table 1). This provides indirect evidence of increased photoxidative damage stress by ROS after UV-B exposure in this cyanobacterium as has been reported before [27,46]. There was no significant change in lipid peroxidation in Calothrix sp. BI22.
Proline is an iminoacid essential to primary metabo- lism whose accumulation has been related to unfavour- able conditions in plants [47] and cyanobacteria [48,49]. According to [50] intracellular proline detoxifies harmful ROS directly rather than improving key antioxidant en- zymes. Our results are in accordance with this, because Anabaena showed an increase in TBARS and in proline content after 3 hours of exposure. No effect in the proline content was seen in Calothrix sp. BI22 (Table 1).
During oxidative stress ROS triggered the activity of several antioxidative enzymes such as SOD (EC 1.15.1.1),
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CAT (EC 1.11.1.6), and APX (EC 1.11.1.11). High ac-tivity of these enzymes in cyanobacteria could be linked to stress tolerance efficiency [46].
As has been stated by [51], cyanobacteria can have iron-containing SOD (cytosolic) and manganese-con- taining SOD (thylacoid-bound) isoforms. The strains tested have both a Fe-SOD isoform and no other isoform was induced due to the experimental conditions (Figures 6(c) and (d)). SOD activities have been shown to change dramatically in response to conditions that favour the formation of superoxide [52]. Calothrix sp. BI22 showed a significant increase of its activity after the maximum exposure time (Figure 6(b)). [53] reported that 2O is the first ROS generated as a consequence of UV-B stress. Like in other studies [54,55], the result obtained supports the fact that SOD plays an important role in protecting Calothrix sp. BI42 from UV-B stress. However, Ana- baena sp. BI42 showed a decrease in the same conditions (Figure 5(a)). It has also been reported that only UV-B produced the decrease of SOD activity in microalgae [56,57] found that in plants SOD activity can increase or diminish according to the species, UV-B dose and the presence or not of concomitant PAR or UVA radiation.
CAT activity had a significant increase in both strains after one hour of exposure to UV-B (Figures 7(a) and (b)). After 3 hours of irradiation, levels of CAT activity fell down reaching the values observed in the Control treatment in both strains. This result has been reported before [54,58] and inactivation of CAT due to UV-B is as consequence of photoinactivation and degradation [59] of the haem group in CAT. According to [60], UV-B inhibition of CAT could be a survival strategy in order to prevent accumulation of H2O2 in the cell.
UV-B irradiation did not significantly affect the APX activity in both strains (Figures 7(a) and (b)). It seems probable that in this moderate UV-B irradiation study, APX is not involved in the protective mechanisms against it in both cyanobacterial strains.
Many effects reported in the literature indicate spe- cies-specific responses to UVR. In this case, the two strains studied under laboratory conditions had different potential survival rates that can be partially explained by the synthesis of UV absorbing compounds and their an- tioxidant potential.
5. Conclusions
Two cyanobacteria strains isolated from the same rice field had different responses to UV-B irradiation doses comparable to the natural solar UV radiation reaching Uruguay’s latitude during rice growing season. Both photosynthesis and nitrogen fixation were affected by moderate UV-B radiation in the Anabaena isolate. Ca- lothrix sp. BI22 seems to have a better and wide suite of protective mechanisms which include constitutive adap-
tations like presence of a sheath or MAAs. It also showed a better antioxidant response to UV-B which may be in- volved in the successful scavenging of ROS and protect- tion of physiological processes of this cyanobacterium.
All in all these results indicate that Calothrix sp. BI22 may be a better candidate than Anabaena sp. BI42 to be used as an inoculant in Uruguayan rice paddy fields when considering UV-B thriving strategies.
6. Acknowledgements
Financial assistance was from Consejo Sectorial de In- vestigación Científica (CSIC-Universidad de la República). We thank Dr. D.-P. Häder for sending us his papers and providing MAAs standards and Dr. J. Monza and P. Díaz for their suggestions.
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